Name: 基于尸检的野生鱼类健康评估 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 57 s
Description: 学习基于尸检的野生鱼类健康评估方法，用于监测水生生态系统健康。该技术包括血液采集、组织病理学分析和耳石年龄测定，可检测肿瘤等病变并评估环境压力对鱼类的影响。

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本工作由美国地质调查局生态系统（切萨皮克湾环境与渔业）和环境健康（污染物生物学）项目以及西弗吉尼亚州自然资源部资助。使用商品名称仅为便于识别，不意味着美国政府对此表示认可。

本文所述方法已获利特敦科学中心机构动物护理和使用委员会批准。
1. 鱼类采集
<ol>
	<li>以最小化应激的方式采集活鱼。可使用船载或背负式电捕鱼设备、钓钩钓线或网具。</li>
	<li>采样前将鱼暂养于活鱼箱或充氧容器中。 
	注意：美国渔业学会已发布多份关于鱼类采集、处理以及麻醉/安乐死的指南26,27,28。操作鱼类时应佩戴手套。</li>
</ol>
2. 鱼类解剖
<ol>
	<li>处死一条鱼。
	<ol>
		<li>将鱼置于麻醉剂中，直至鳃盖运动停止且鱼体失去平衡。再经过2–10分钟，鱼将被安乐死；但此时间可能因物种而异。 
		注意：鱼类可通过多种麻醉剂实施安乐死（参见 材料清单 对于最常用的实验方法，实施安乐死的方式将取决于对所采集组织进行的实验室检测项目29.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>测量生物特征参数。
	<ol>
		<li>将鱼称重至最接近的克。</li>
		<li>将鱼的体长测量至最接近的毫米。
		<ol>
			<li>测量从吻端（闭口时）到尾末端（尾部夹紧时）的总长度。</li>
			<li>从尾叉到吻端测量叉长，从吻端到身体末端（尾部起点）测量标准体长。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>使用以下公式计算肥满度： 
		条件因子 = （体重 - 性腺重）/体长3. 
		注意：由于性腺对总体重的贡献可能很大，特别是在产卵前的雌鱼中，因此从总体重中减去性腺重量。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>采集血液样本。 
	注意：血液最常取自尾静脉，但也可从背主动脉采血或通过心脏穿刺获取30.
	<ol>
		<li>使用1至5 mL注射器配22或23号针头，根据鱼体大小从尾静脉采集外周血样。将针头插入侧线下方尾部区域前方图 1A 和 1B向上倾斜针头直至触及脊柱，然后稍作回撤。该静脉位于上方脊突的腹侧。 
		注意：若需制备血涂片或需要血清，则不使用抗凝剂。大多数情况下将采集血浆，因此使用肝素钠、EDTA 或锂等抗凝剂涂布针头和注射器，且采血管中也含有此类抗凝剂例如，真空采血管）。</li>
		<li>移除针头，并将其放入锐器废弃容器中，然后再将血液注入收集管。 
		注意：血液可暂时置于冰上，但应根据后续分析要求尽快进行离心处理30.</li>
		<li>如果需要评估核异常或进行血细胞分类计数，应立即将一滴血液滴加到两张干净的载玻片上。将第二张载玻片的边缘 45° 倾斜进入液滴，然后通过毛细作用将液滴在表面展开。静置风干31.</li>
		<li>离心血液，转速为 1,500–2,500 x g 15分钟以沉淀细胞。用无菌移液管移除血浆/血清，分装至冻存管中，并在-80℃保存。80 °C.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="鱼类采血流程；注射器抽取，生物学研究，样本采集。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57946/57946fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图1"> 
图1：从鱼类获取血液样本。（A）将刚处死的鱼侧放，并定位侧线。（B）在侧线下方（箭头所示）插入针头，向上倾斜进针直至接触脊柱，随后稍许回撤针头，开始抽吸以采集血液。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57946/57946fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<ol start="4">
	<li>对每条鱼进行基于尸体解剖的健康评估。 
	注意：已有大量出版物对病变和异常情况进行图示和描述32,33,34,35.
	<ol>
		<li>记录体表和鳍部的外部异常情况，包括病变图2）、眼睛和鳃（图3），体外寄生虫如水蛭（图2D），蛴螬或吸虫的囊蚴图 2D, 3B) 和鳃部寄生虫（图 3D）。在数据表上记录所观察到的异常的类型、位置和大小，如有可能，还应进行拍照记录。</li>
		<li>打开腹腔（图 4A使用剪刀从肛门区域向鳃盖处剪开，然后移除肌肉瓣以暴露内脏器官。 
		注意：如果需要采集前肾用于免疫功能检测（见下文步骤5）或采集细菌学、病毒学样本，则应先用70%酒精对体表进行消毒，并在解剖前完成这些样本的采集。如果组织仅用于肉眼观察、血浆分析和组织病理学检查，则无需无菌操作。</li>
		<li>记录内部异常图4）包括各器官的弥漫性或局灶性变色（图 4B-4D），隆起区域的存在（图4E）、囊肿、寄生虫以及大小异常（增大、萎缩）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="鱼类皮肤病变检查；示意图突出显示鱼类标本上可能的疾病标志物。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57946/57946fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 2"> 
图 2：鱼类体表和鳍上观察到的可见病变示例。（A）体侧表面出现一处较小且轻微糜烂的病灶（箭头所示）。（B）尾部体表出现大面积发红区域（箭头所示）。（C）体表和鳍上出现隆起的黑色病灶（箭头所示）。（D）鳍上附着有水蛭（白色箭头）和小的黑色斑点（黑色箭头）。比例尺 = 3 mm。（E）体表出现一处隆起、多叶状、颜色较浅的病灶（箭头所示）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57946/57946fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="鱼类鳃部解剖图，显示内部结构，标注各部分以供教学研究。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57946/57946fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 3"> 
图3：鱼类鳃部和眼部可见病变的示例。（A）眼球晶状体内的苍白区域（箭头所示）。比例尺 = 5 mm。（B）鳃盖（a）上由吸虫寄生引起的白色囊肿（白色箭头）和小黑点（黑色箭头）。比例尺 = 1 cm。（C）鳃组织（a）上苍白且被侵蚀的区域（箭头所示）。比例尺 = 5 mm。（D）已取出的鳃，可见寄生虫（箭头所示）附着于鳃丝上。比例尺 = 2 mm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57946/57946fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="鱼类解剖实验；肝脏和性腺鉴定；生物学研究分析方法。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57946/57946fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 4"> 
图 4：鱼类尸检及内脏异常示例。（A）尸检过程中，沿白色箭头方向切开鱼体，并移除一块肌肉瓣（黑色箭头），以暴露性腺（a）以及被镊子和剪刀夹持的脾脏。（B）花斑状肝脏（a）、睾丸（b）、被脂肪组织包裹的肠道（c）和胃（d）。比例尺 = 5 mm。（C）肝脏（a）上出现暗红色区域（箭头）、卵巢（b）和肠道（c）。比例尺 = 5 mm。（D）肝脏上出现绿色变色区域（箭头）。比例尺 = 1 cm。（E）正常（a）与异常（b）睾丸示例，后者具有隆起的结节。比例尺 = 1 cm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57946/57946fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<ol start="5">
	<li>获取肝体指数（HSI）。
	<ol>
		<li>切断肝动脉和前端的结缔组织，取出肝脏。在分离与肠道和脂肪组织的粘连时轻柔地提起肝脏并修剪。注意不要刺破胆囊。称量肝脏重量。 
		注意：某些鱼类（如鲤科鱼类）没有独立的肝脏，而是将肝组织包裹在肠道和其他器官周围。对于这些物种，可能无法获取肝脏重量。</li>
		<li>使用以下公式计算肝体指数（HSI）： 
		HSI = 肝脏重量 / 个体总体重</li>
	</ol>
	</li>
	<li>计算性腺体指数（GSI）。
	<ol>
		<li>取出性腺并称重。</li>
		<li>使用以下公式计算性腺体指数（GSI）： 
		GSI = 性腺重量 / 个体总体重</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 为显微病理学保存组织
注意：可使用多种固定剂在野外保存组织样本，包括10%中性缓冲福尔马林和含锌福尔马林固定剂Z-fix。若后续采用诸如 原位 可采用杂交或荧光抗体染色。
<ol>
	<li>小心切割组织样本，但不要拔出。保持各个组织块的完整性 &lt;2 cm 大小 &lt;5毫米厚以确保充分固定。作为经验法则，固定液体积应约为组织体积的10倍，以实现适当保存。将同一条鱼的所有组织样本置于一个合适大小的防漏容器中，具体容器大小取决于所采样鱼类的尺寸。</li>
	<li>将存在任何外部异常的组织块放入固定液容器中，同时包括一块相邻的正常组织。 
	注意：不正确的处理方式（如挤压或其他机械性损伤、长时间暴露于空气或阳光下，以及冷冻）可能导致人为假象。</li>
	<li>从不同区域切取至少五块 3–4 mm 厚的肝组织，放入固定液容器中。若观察到异常区域，应包括正常与异常组织。</li>
	<li>根据大小，将一个完整的性腺或多个性腺组织块放入固定液容器中。</li>
	<li>将较小的完整器官或所有其他器官（脾脏、前肾和后肾、鳃、心脏、肠和胃）的组织块放入固定液容器中。若发现异常组织，应同时保存相邻的正常组织一块。</li>
</ol>
4. 取出耳石用于年龄分析
注意：年龄在鱼类疾病/鱼类健康研究中可能是一个重要的变量。尽管已有多种结构（包括鳞片和棘刺）被用于年龄测定，但多数比较这些结构的研究发现，耳石能提供最佳结果36,37。硬骨鱼类具有三对耳石——听壶耳石（lapillus）、矢耳石（sagitta）和星耳石（asteriscus）。通常采集矢耳石或听壶耳石用于年龄鉴定，但具体选择可能因物种而异。耳石的摘除与年龄鉴定技术此前已有描述38。
<ol>
	<li>切开鳃峡，并将头部向后弯曲。剥离神经颅骨下部周围的结缔组织和肌肉组织，以找到前耳泡，即一处隆起的骨性区域。</li>
	<li>使用骨剪刻划或剪切并敲裂，以暴露耳石。耳石可用肉眼观察到。</li>
	<li>将耳石放入标记好的小瓶或硬币信封中，并在室温下保存，直至通过计数环状结构或生长增量来测定年龄38。若放入小瓶中，返回实验室后应打开瓶盖，待其完全干燥后再进行储存。</li>
</ol>
<img alt="用于鳃分析的鱼类解剖；展示使用剪刀和镊子进行提取的步骤。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57946/57946fig5.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 5"> 
图 5：耳石的取出。（A）切断峡部，并剥离结缔组织和肌肉，以暴露脊椎基部和神经脊区域。（B）敲裂骨骼以暴露耳石。（C）取出矢耳石。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57946/57946fig5large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
5. 获取组织用于免疫功能检测
注意：前肾是主要的造血器官，也是淋巴细胞和巨噬细胞的功能检测来源；若需将细胞用于有丝分裂原反应、巨噬细胞吞噬与杀伤能力等功能性检测培养，则必须无菌取出前肾39,40。
<ol>
	<li>用70%乙醇喷洒鱼体外表面。使用无菌剪刀、解剖刀和镊子打开腹腔，取出位于鳔前方的前肾组织，该组织为暗红色器官。</li>
	<li>将前肾样品置于培养基中（例如， Leibovitz L-15）以维持细胞活性。使用无菌手持式组织研磨器匀浆肾脏样本（例如， Tenbroeck组织研磨器）研磨成单细胞悬液。置于湿冰上保存，直至返回实验室。</li>
</ol>
6. 保存组织用于核酸分析
注意：如果后续将进行分子分析，例如利用转录本丰度检测基因表达41 或定量 PCR42（聚合酶链式反应），应尽快将待检测的组织样本置于适当的保存剂（例如，RNAlater 稳定溶液）中。
<ol>
	<li>用于RNA保存时，将两到三个微小组织块（2–3 mm）放入适量的保存液中，保存液体积与组织体积比为10:1。 
	注意：样品应避免阳光直射或高温，并在湿冰上运输。</li>
	<li>用于DNA保存时，将两到三个微小组织块放入95%乙醇中（乙醇与组织的体积比为10:1）。随后将样品置于湿冰上暂存，然后于-20 °C保存。</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

基于尸体解剖的鱼类健康评估可应用于任何鱼类物种，前提是研究者了解该物种外部和内部结构的正常形态。采用标准化方法可实现不同地点和物种之间的比较，以及种群在季节性和时间上的变化分析。评估结果可用于识别与点源和非点源污染物相关的影响，并为管理措施提供依据，也可在管理措施实施后用于追踪改善情况。该方法可根据需要进行调整，以增强对各种外部可视异常的记录。仅基于视觉观察的评估具有非致死性、相对低成本的特点，且可在短时间内获得大量个体的数据。因此，此类评估适用于探索性或初步评估、长期变化监测，或与其他指标联合使用。若在视觉观察过程中测量鱼类的体长和体重，还可计算其肥满度系数。尽管仅基于视觉观察的评估无法提供病因或相关风险因素的信息，但长期监测某些皮肤异常45和生物测量参数46的变化趋势表明，部分区域的水质改善与这些指标的改善相关。
基于尸体解剖的评估可提供更多信息，因为同时会检查内部器官，并可计算肝体指数和性腺体指数等其他状况因子。Goede 和 Barton22 开发了一种现场尸体解剖方法，包括血液参数、生物测量因子、异常百分比以及特定异常的指数值。该方法的改进版本引入了对某些变量的严重程度评分，从而可计算出可进行统计比较的健康评估指数23。该健康评估指数已被用于区域位点间的比较研究23,47,48，并结合其他生物学指标（包括血浆分析和组织病理学分析）应用于美国地质调查局“环境状况与趋势生物监测计划”中，以评估全国大型河流中污染物暴露的潜在影响49,50,51。一种基于外部可见疾病与寄生虫、可见的肝脏肿瘤及其他组织病理学检测到的肝脏病变的鱼类疾病指数已在北海、波罗的海及冰岛周边地区广泛开发和应用。研究表明，该指数作为生态系统健康指示工具具有重要意义52。
在开展基于尸体剖检的鱼类评估时，有一些关键因素需要注意。首先，必须在鱼类死亡后立即进行评估，因为器官的颜色和质地在死亡后可能迅速发生变化。此外，某些寄生虫可能在宿主死亡后很快离开。其次，了解目标物种的正常状态非常重要。例如，某些鱼类的肝脏通常含有较多脂肪，因而颜色较浅，而对大多数鱼类而言，浅色肝脏则属于异常。同时，还应认识到自然发生的季节性变化，一些鱼类在繁殖季节会出现体色改变或形成繁殖结节。
基于尸体解剖的鱼类健康评估方法存在局限性，包括无法 1) 一致地确定特定病变的&#34;病因&#34;，以及 2) 识别肉眼不可见的效应。这些缺陷可通过增加组织病理学检查、病原体和寄生虫的分子或培养鉴定，以及基因表达分析来克服。例如，肉眼观察到的&#34;肿瘤&#34;或隆起性病变（肿胀）可能是真正的肿瘤性病变，也可能是寄生虫感染、炎症、水肿或增生（正常细胞数量增加），其诱因可能为化学物质暴露、传染性病原体或其他刺激物。如代表性结果所示，明确诊断肿瘤或新生物病变需要借助显微病理学检查，以确定病变类型及其严重程度（i.e., 良性或恶性）。通过对白 sucker 鱼体表&#34;肿瘤&#34;进行肉眼观察评估，会高估其患病率，尤其是在参考采样点。许多隆起性病变并非肿瘤，而是增生性病变。目前尚不清楚这些增生性病变是否属于癌前病变。相反，对肝脏隆起结节的观察则显著低估了肝脏肿瘤的患病率。因此，采集组织样本进行显微病理学检查对于充分评估去清单化的可能性至关重要。

人类活动对水生环境具有多种不利影响。鱼类栖息于各种水体中，而这些水体常被人类用于 recreational 活动，并经常作为饮用水来源，因此鱼类是水生环境健康状况的重要指示生物。生活在特定栖息地中的野生鱼类在其整个生命周期中都会暴露于多种应激因子之下，包括病原体、寄生虫、水质不良以及化学污染物。成千上万种化学物质通过工业和生活废水、城乡径流以及农业面源污染进入我们的水道。这些复杂的化学混合物可能对暴露的生物体产生相加、协同或拮抗效应1,2,3。此外，其他环境应激因子，如营养盐浓度过高、水温升高、溶解氧降低或pH值波动，可能加剧化学污染物的影响4,5。环境应激因子还可能通过增加传染性病原体数量6、增强机会性病原体的毒力7，或抑制宿主的免疫反应和抗病能力8,9,10，直接改变传染病的发生结果。基于上述原因，利用鱼类及其他水生生物开展生物效应或有害效应监测，以识别处于风险中的种群和生态系统，正受到越来越多的关注11,12,13,14。
不良反应监测利用从个体到亚细胞或分子水平等不同组织层次的生物标志物，识别可能影响种群并指示暴露于各种应激因子的亚致死效应。个体水平的指标包括可见的异常和状况。通过体长和体重计算状况指数，以评估鱼类种群的健康状况或适应性。最常用的是弗尔顿状况因子（K）=（体重/体长）3) 15另一个指标是可见异常的存在。在各项研究和监测项目中，已采用多种方法来评估、记录和评价可见异常。仅基于外部异常的评估， 即， 患有疾病、鳍损伤、肿瘤和骨骼畸形的个体所占比例，是用于评估群落健康状况的生物完整性指数（IBI）的指标之一16一种称为DELTs（畸形、侵蚀、病变、肿瘤）的类似评估方法也已被用于评价鱼类群落的健康状况17然而，这些方法仅能评估外部视觉异常，无法检测内部病变或早期亚致死指标。
基于尸体解剖的评估包括外部和内部观察，并可用于测量其他状况指数。肝体指数（肝脏重量/总体重）也已被用作衡量鱼类健康状况或能量储备的指标15，较高的指数值通常表示鱼类更健康。然而，多项研究表明，由于肝脏代谢多种污染物，可能导致肝脏肥大或体积增大18,19,20。在此情况下，较高的肝体指数则可能提示暴露于某些化学物质类别。gonadosomatic index（性腺重量/总体重）是另一项针对生殖健康的状况指数21。尸体解剖评估过程中所记录的观察结果可用于比较不同类型病变的发生率或正常个体所占百分比。此外，这些数据也可用于更定量化的健康评估22,23。
本文所述的标准化尸体剖检评估方法可根据待回答的问题、专业技能及其他可用资源，以多种方式补充肉眼可见的评估。我们的常规方法是收集生物测量数据（体长、体重、肝脏重量、性腺重量）、用于血浆/血清分析的血液，记录外部和内部可见的异常情况，保存器官组织样本用于显微镜检查，并采集耳石用于年龄分析。结合年龄分析和多种器官的组织病理学检查，尸体剖检评估可实现按性别、年龄、地点和采样时段对各种状况指数、可见异常的流行率以及显微组织变化进行计算和比较。还可额外采集组织样本，用于电子显微镜、细菌学、病毒学、寄生虫学以及化学物质浓度等其他多种分析。这些方法也可作为更深入分析的一部分，用于诊断鱼类死亡事件24或圈养鱼类死亡原因25。本文还图示了用于另外两项分析——基因表达和功能性免疫分析——的组织采集方法。

<table><tbody><tr><td>折叠桌</td><td>任意</td><td></td><td></td></tr><tr><td>折叠椅</td><td>任意</td><td></td><td></td></tr><tr><td>解剖板</td><td>任意</td><td></td><td></td></tr><tr><td>测量板（mm）</td><td>任意</td><td></td><td></td></tr><tr><td>电池供电的鱼类称重天平（g）</td><td>任意</td><td></td><td></td></tr><tr><td>电池供电的器官称重天平（mg）</td><td>任意</td><td></td><td></td></tr><tr><td>解剖镊</td><td>任意</td><td></td><td></td></tr><tr><td>骨剪</td><td>任意</td><td></td><td></td></tr><tr><td>手术刀及刀片</td><td>任意</td><td></td><td></td></tr><tr><td>一次性手套</td><td>任意</td><td></td><td></td></tr><tr><td>桶</td><td>任意</td><td></td><td></td></tr><tr><td>防漏Nalgene瓶（250 mL）</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>02-924-5C</td><td></td></tr><tr><td>含肝素钠的真空采血管</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>02-689-6</td><td>用于血液采集</td></tr><tr><td>一次性&amp;nbsp;3 mL注射器配23G针头</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>14-826-11</td><td></td></tr><tr><td>1 &amp;ndash; 2 mL冻存管</td><td>任意</td><td></td><td>用于血浆和RNAlater样本</td></tr><tr><td>Invitrogen RNAlater稳定液</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>AM7021</td><td></td></tr><tr><td>Z-Fix甲醛锌固定液</td><td>Anatech LTD</td><td>SKU-174</td><td></td></tr><tr><td>三卡因-S（MS-222）</td><td>Syndel USA</td><td></td><td>鱼类麻醉剂</td></tr><tr><td>硬币信封</td><td>任意</td><td></td><td>用于耳石</td></tr><tr><td>铅笔和笔</td><td>任意</td><td></td><td></td></tr><tr><td>70%酒精</td><td>任意</td><td></td><td></td></tr><tr><td>数据记录表</td><td>任意</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

基于尸体解剖的野生鱼类健康评估

Necropsy-based Wild Fish Health Assessment

营养物质增加、化学污染物、生境改变以及气候变化等人为影响，可能对鱼类种群产生显著效应。通过从个体到分子水平的生物标志物进行不利效应监测，可用于评估这些因素对鱼类及其他生物的累积影响。鱼类健康状况在全球范围内被用作水生生态系统健康的指示指标。基于解剖的鱼类健康评估可提供关于肉眼可见的异常与病变、寄生虫、体况以及器官体重指数的数据。这些数据可通过地点、季节和性别进行比较，并进行时间序列分析，以记录随时间发生的变化。可通过为各项观察结果分配严重程度评分，计算鱼类健康指数，从而实现更定量化的评估。基于解剖评估的一个缺点是，其依赖于肉眼观察和体况参数，对于亚致死效应的敏感性不如组织和亚细胞水平的生物标志物。此外，通常难以确定所观察到的异常现象的成因或相关风险因素。例如，鱼鳍、唇部或体表出现的隆起性病灶或“肿瘤”可能是肿瘤性病变，但也可能是寄生虫引起的反应、慢性炎症，或正常细胞对刺激物产生的增生反应。相反，某些肿瘤、寄生虫、其他病原体以及许多组织学变化在肉眼观察下不可见，因此可能被低估。然而，在进行解剖评估过程中，可采集血液（血浆）、用于组织病理学（显微病理学）、基因组学及其他分子分析的组织样本，以及用于年龄鉴定的耳石。这些后续分析，结合地理空间分析、生境评估、水质与污染物分析，在全面的生态系统评估中均具有重要意义。

五大湖“关注区域”（Areas of Concern, AOC）是指因多种有益用途受到损害而被划定的地理区域。在许多 AOC 中，其中一项有益用途损害（BUI）表现为鱼类肿瘤或其他畸形。为消除各项 BUI 并最终撤销 AOC 列名，每个区域已投入数百万美元用于修复与生态恢复43。不同州对鱼类肿瘤 BUI 撤销列名的标准有所不同（参见 epa.ohio.gov/portals/35/lakeerie/ohio_AOC_delisting_guidance.pdf 和 dnr.wi.gov/topic/GreatLakes/documents/SheboyganRiverFinalReport2008.pdf）；然而，正如撤销列名文件中所指出的，需评估肝脏肿瘤的发生率，在某些情况下还需评估皮肤肿瘤的发生率。在多数情况下，需将该发生率与非 AOC 的参考站点进行比较。
利用对白 sucker（Catostomus commersonii）的尸体解剖评估，随后进行皮肤和肝脏组织的显微病理学分析，对位于苏必利尔湖和密歇根湖的三个AOC区域（圣路易斯河、密尔沃基河和谢博伊根河）以及一个非AOC参考点（克沃因河）的鱼类肿瘤BUI进行了评价。鱼类样本于2012年和2013年从密尔沃基河、谢博伊根河和克沃因河采集44，并于2015年从圣路易斯河采集（未发表数据）。密尔沃基河、克沃因河和圣路易斯河共评估了200条白 sucker，谢博伊根河为193条。
根据定义，肿瘤可以是任何肿胀或隆起区域，但通常认为，由异常细胞构成的组织异常增生所引起的肿胀，属于良性或恶性肿瘤。从所有采样点收集的白 sucker 鱼均表现出多种体表隆起病变，包括体表和唇部的小而孤立的白色斑点、较大的白色区域、轻微隆起的黏液样病变以及多叶状隆起区域（图6）。对鱼类进行称重和体长测量以计算其肥满度系数，记录其外部和内部异常情况，并采集皮肤和肝脏组织用于组织病理学检查。
<img alt="鱼类乳头状瘤病；鲤鱼皮肤和尾部的肉眼可见病变，如详细检查图像所示。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57946/57946fig6.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图6"> 
图6：在五大湖捕获的白 sucker 鱼体表观察到的隆起性皮肤病变。（A）体表一处界限清晰的白色斑点。比例尺 = 5 mm。（B）体后部表面轻微隆起的黏液性病变（箭头所示）及多叶状病变（a）。比例尺 = 1 cm。（C）体表一处较大的多叶状病变。比例尺 = 1 cm。（D）唇部多发性多叶状病变。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57946/57946fig6large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
在圣路易斯AOC，出现外部肿瘤或隆起变色区域的鱼类比例为15.5%，而在密尔沃基AOC则高达58.0%。总体而言，离散的白色斑点是最不常见的肉眼可见病变，而多叶状的唇部及体表病变最为常见。具有可观察到的肝结节的鱼类数量较少，从基瓦尼和圣路易斯的1.5%到密尔沃基的2.5%不等（表1）。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td colspan="4">河流及采样年份</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>可见病变</td>
			<td>Kewaunee 2013</td>
			<td>St. Louis 2015</td>
			<td>Sheboygan 2012</td>
			<td>Milwaukee 2013</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>离散的白色斑点</td>
			<td>16</td>
			<td>3</td>
			<td>3.1</td>
			<td>5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>黏液状</td>
			<td>20</td>
			<td>9.5</td>
			<td>9.8</td>
			<td>30.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>多叶状</td>
			<td>22.5</td>
			<td>3</td>
			<td>29.5</td>
			<td>40</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>隆起性皮肤异常总数a</td>
			<td>46</td>
			<td>15.5</td>
			<td>38.3</td>
			<td>58</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>可见肝脏结节</td>
			<td>1.5</td>
			<td>1.5</td>
			<td>1.6</td>
			<td>2.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="5">a具有隆起性病变的鱼类总数。部分鱼类存在多种类型的异常。</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：基于尸体解剖观察的五大湖关注区域及参考点（基瓦尼河）采集的白 sucker 鱼的异常情况，以百分比形式呈现。 
通过肉眼检查可记录具有各种异常的鱼类所占百分比。然而，要明确诊断肿瘤的存在及其类型，必须对组织进行显微镜下检查（组织病理学检查）。显微镜检查发现，并非所有隆起的病灶均为肿瘤性病变。许多白色斑点和黏液样病灶，尤其是在基瓦尼河地区，实际上是增生性病变而非肿瘤（表2）。此外，在基瓦尼河和圣路易斯河地区，所观察到的所有皮肤肿瘤均为良性乳头状瘤。而在谢博根和密尔沃基地区，则同时观察到了乳头状瘤和鳞状细胞癌，后者为恶性皮肤肿瘤（表2）。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td colspan="4">采样的河流</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>肿瘤类型</td>
			<td>Kewaunee 2013</td>
			<td>St. Louis 2015</td>
			<td>Sheboygan 2012</td>
			<td>Milwaukee 2013</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>乳头状瘤</td>
			<td>21</td>
			<td>5.2</td>
			<td>30.5</td>
			<td>37.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>鳞状细胞癌</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>2.1</td>
			<td>10.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>皮肤肿瘤总数</td>
			<td>21</td>
			<td>5.2</td>
			<td>32.6</td>
			<td>48</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>胆管肿瘤a</td>
			<td>2.5</td>
			<td>4</td>
			<td>6.2</td>
			<td>9.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>肝细胞肿瘤b</td>
			<td>1</td>
			<td>0</td>
			<td>2.1</td>
			<td>8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>肝脏肿瘤总数</td>
			<td>3.5</td>
			<td>4</td>
			<td>8.3</td>
			<td>15.0c</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">a包括胆管瘤和胆管癌</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">b包括肝细胞腺瘤和肝细胞癌</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">c部分鱼类同时患有胆管和肝细胞肿瘤</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表2：在五大湖关注区域及参考点（基瓦尼河）采集的白 sucker 鱼中经显微镜确认的肿瘤性病变，以百分比形式呈现。 
组织病理学分析还发现了肉眼观察未能识别的肝脏肿瘤。尽管从基瓦尼河和圣路易斯河采集的鱼类中仅有1.5%存在肉眼可见的肝结节（表1），但经显微镜检出的肿瘤比例分别为3.5%和4.0%（表2）。在谢博伊根（Sheboygan）和密尔沃基（Milwaukee）两地差异更为显著：谢博伊根为1.6%（肉眼）对比8.3%（显微镜），密尔沃基为2.5%（肉眼）对比15.0%（显微镜）。显微镜检查还可区分胆管来源与肝细胞来源的肿瘤（表2），以及良性与恶性肿瘤。

野生鱼类的健康状况可作为水生生态系统健康状况的指标。基于尸体解剖的鱼类健康评估能够记录可见的病变或异常，并提供用于计算体况指数的数据，同时为组织的显微观察、基因表达及其他更深入的分析提供样本采集机会。

营养物增加、化学污染物、生境改变以及气候变化等人为影响，可能对……产生显著作用。

基于尸体解剖的鱼类健康评估用于常规监测野生鱼类的健康状况，比较不同采样点的特定研究，以及为组织样本采集以进行更深入分析提供依据。鱼类持续暴露于多种应激因子的复合影响下，这些因子包括复杂的化学物质混合物、病原体和寄生虫。这些应激因子的联合作用可能导致不良效应，如疾病抵抗力下降、癌症以及生殖功能障碍。所展示的技术可用于对可见异常进行标准化评估，并采集血液和组织用于组织病理学分析，耳石用于年龄鉴定，以及其他组织用于后续分析。首先，我们将以一条鱼为例，演示常规的尸体解剖评估过程，包括用于组织病理学分析的血液、耳石和组织的采集。此外，本方法还包括前肾组织的采集用于免疫功能检测，以及肝脏或其他组织的采集用于基因表达分析，这些附加步骤我们也将一并演示。为了防止发生死后变化，应尽快采集组织样本。因此，我们通常采用流水线式的工作流程，由两到三名人员负责采集组织，另有一人负责记录数据。来自西弗吉尼亚大学的博士生希瑟·沃尔什（Heather Walsh）和切耶恩·史密斯（Cheyenne Smith），以及刚获得博士学位的瑞安·布雷厄姆（Ryan Braham）将演示该流程的各个步骤。根据机构指南收集并处死鱼类后，称量鱼的体重并测量其体长，同时采集血样。接下来，测量鱼从吻端到尾鳍末端的总长度。使用一支预先用肝素涂层处理的3 CC注射器（22或23号针头），插入侧线下方尾部区域前方的位置。将针头向上倾斜，直至接触脊柱，然后稍作回撤以获取血样。在将血样转移至收集管之前，取下针头并将其放入锐器盒中。对于当日往返的采样，血液样本可在湿冰上保存，直至返回实验室。然后进行离心以去除血浆，血浆储存于-80摄氏度直至分析。如果无法每天返回实验室，则需要配备离心机和干冰储存设备。接下来，记录鱼类体表、鳍、眼睛和鳃部存在的任何外部异常或病变。检查鱼类体表是否存在寄生虫，例如水蛭、蠕虫、吸虫囊蚴以及鳃部寄生虫。然后使用剪刀从肛门区域向鳃盖处剪开腹腔。剪除肌肉瓣以暴露内部器官。检查内脏器官，记录普遍性及局灶性变色、隆起区域、囊肿、寄生虫以及大小异常等情况。随后，切断肝动脉和前端的结缔组织，以移除肝脏。轻柔地将肝脏从尸体中取出，并修剪与肠道及脂肪组织之间的任何粘连和连接，注意避免刺破胆囊。称量肝脏重量，然后按照文本方案中的说明计算肝体指数。接着取出性腺并称重。小心地剪取小块组织样本，避免牵拉。将同一条鱼的组织样本放入同一个容器中。接着，从肝脏的不同区域切取至少五块、每块厚三到四毫米的组织，放入固定液容器中。根据大小，将完整的性腺或性腺组织块放入固定液容器中。随后，将较小的完整器官及其他较大器官的组织块放入固定液容器中。若观察到任何异常组织，应额外保存一块相邻的正常组织。许多结构，如鳞片、鳍条和耳石，均可用于鉴定鱼类年龄。此处我们采用耳石，因其准确性最高。首先，切开鳃峡，并将头部向后弯曲。然后，为了定位前耳泡，需剥离神经颅下部周围的结缔组织和肌肉组织。使用骨剪敲开前耳泡，暴露耳石。耳石应能用肉眼直接观察到。将耳石放入已标记且未加盖的小瓶中，并在室温下保存，直至可进行年龄分析。暴露于多种化学物质及其他环境应激因素可能导致免疫抑制。可从该组织中分离出淋巴细胞、巨噬细胞和粒细胞，并在实验室中检测其杀灭病原体、产生抗体、对肿瘤细胞作出反应及其他功能的能力。使用无菌剪刀、解剖刀和镊子取出前肾组织。将前肾组织样本置于适当的培养基中以维持细胞活性。使用无菌手持组织研磨器将样本匀浆成单细胞悬液。将样品置于湿冰上保存。为保存 RNA，按 10 体积保存液对 1 体积组织的比例，将两到三小块肝脏放入适当的保存液中。本研究中，白 sucker 鱼样本采集自五大湖的三个重点关注区域（AOCs）以及参考地点 Kewanee 河。在圣路易斯AOC，出现体表肿瘤的鱼类比例为15.5%，而在密尔沃基AOC则高达58%。观察到多种类型的体表病变，包括界限清晰的白色斑点、轻微隆起的黏液样病变以及较大的乳头状病变。本研究中观察到的许多界限清晰的白色斑点和黏液样病变，特别是在科瓦尼参考点位，属于增生性病变，而非肿瘤性病变。组织病理学分析还发现了通过肉眼观察无法识别的肝脏肿瘤。如果操作得当，熟练掌握该技术后，每条鱼的处理可在15至20分钟内完成。在进行该操作时，了解所研究物种的正常组织学特征，并在描述异常情况时尽可能保持一致性和准确性，至关重要。包括大小、颜色、质地和位置。照片记录非常有用。该技术适用于任何鱼类物种，可用于在空间和时间上记录鱼类健康状况，以更好地理解环境应激因素的不利影响，并识别入侵性疾病。

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科研

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