Name: 叶喷雾质谱: 一种快速的环境电离技术直接评价植物组织中的代谢产物 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 43 s
Description: 了解叶喷雾质谱技术如何直接分析完整植物组织中的代谢产物。该方法无需复杂样品制备即可快速检测生物碱和农药等小分子，为植物化学研究提供高效便捷的分析手段。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

本工作由美国国家科学基金会植物基因组研究计划项目 IOS-1238812 和生物学博士后奖学金项目 IOS-1400818 资助。凯瑟琳·A·萨蒙斯获得了孟山都公司研究生奖学金资助。感谢富布赖特非洲研究学者计划（2017–2018）为诺克万达·P·马孔加提供的资助。我们非常感谢杰西卡·普雷尼及科罗拉多州立大学蛋白质组学与代谢组学平台捐赠的纳米喷雾电离源。

1. 叶片喷雾质谱中纳米喷雾源的改造
<ol>
	<li>使用改良的纳米喷雾源进行叶片喷雾质谱分析。由于叶片喷雾质谱无需任何流体组件，可通过从源中移除液相色谱探针来改装该源。</li>
	<li>组装叶片喷雾质谱导线，该导线将通过合适的插针连接至源，用于向植物组织施加电压。将插针焊接到绝缘导线的一端，另一端焊接一个夹子。 
	注意：夹子（鳄鱼夹型）可带齿或不带齿。对于较小的组织，建议使用无齿夹子。可选择性地在纳米喷雾源上加装带夹子的柔性臂，以辅助定位植物组织。需注意，本方案具体描述的是如何在混合型四极杆离子阱质谱分析系统上进行叶片喷雾质谱（参见材料表）；然而，其他质谱系统也可经改造后用于该技术6。将叶片喷雾质谱与便携式质谱仪联用，可对植物样品进行现场实时化学分析，无需将其运送至实验室19,20。</li>
	<li>在源下方的地面上放置防静电地垫，以减少使用高电压时源可能产生的电放电现象。</li>
</ol>
2. 叶片喷雾质谱分析前质谱系统的准备
<ol>
	<li>如果系统最近已使用过，请等待其冷却至可触摸温度，并移除任何其他离子源和扫气锥。安装纳米喷雾叶喷雾质谱离子源。</li>
	<li>创建一个调谐文件，设置适当的电离参数如下：鞘气、辅助气和扫气均设为 0；喷雾电压设为 2 - 5 kV；毛细管温度设为 150 - 250 °C；S-透镜射频水平设为 50。将包含所需参数的调谐文件保存8,13。针对目标组织和化合物优化电压与温度以获得最佳电离效果。 
	注意：良好的起始参数为 4 kV 和 200 °C。</li>
	<li>创建一个方法文件，包含叶喷雾质谱调谐文件，设置如下：正离子和负离子全扫描质谱模式；分辨率 70,000；自动增益控制（AGC）目标值为 1 × 106；最大注入时间 200 ms；以及所需的扫描范围 m/z。也可仅使用单一极性。</li>
</ol>
3. 仪器、溶剂和植物组织的准备
注意：务必佩戴手套，切勿使用被裸手接触过的植物组织。否则，聚乙二醇等污染物离子将主导谱图信号。
<ol>
	<li>将用于分析的植物组织带到与质谱（MS）系统相同的房间，以便快速取样。</li>
	<li>对于没有天然尖端的植物组织，使用载玻片上的剃须刀片切割出锥形尖端（图2）。根据仪器灵敏度、组织类型及目标化合物确定分析所需的组织量（例如，长约5 mm的幼嫩S. tortuosum叶片）。
	<ol>
		<li>在种子萌发后10周，将S. tortuosum叶片切成细条，每条末端修成锥形以形成尖端。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用镊子轻轻夹取待夹持端的植物组织。用镊子夹住组织后，小心将其转移至夹具中。 
	警告：当电压开启时，请勿触碰仪器离子源。</li>
	<li>调节带夹具的柔性臂和导线，使植物组织与质谱仪进样口对齐，确保植物组织与质谱仪离子入口之间的距离为：三重四极杆（例如，TSQ）和线性阱四极杆（LTQ）为5–10 mm，离子阱质谱分析器（例如，Orbitrap）为10–50 mm8。
	<ol>
		<li>将导线的另一端插入离子源。若初次尝试信号强度较低，可将植物组织向离子入口方向适当靠近（参见讨论部分以进行优化）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>加载方法文件，命名数据文件并设置存储路径。然后点击播放启动质谱系统，并点击开始以开始采集数据。</li>
	<li>使用带有凝胶上样枪头的移液器加入溶剂（例如，甲醇），以最大化手部与高压部件之间的距离，保障操作者安全。 
	注意：所需溶剂量取决于组织的大小、干燥程度和质地，通常为~2–20 µL。S. tortuosum叶片无需额外添加溶剂。加溶剂时应小心操作，电压开启时切勿触碰仪器离子源。请使用LC-MS级溶剂，以及经酸洗且无去污剂残留的玻璃器皿。某些组织因自身含水量较高，即使不添加溶剂也可能检测到信号。然而，通常在组织上施加溶剂后可获得更强的信号强度和更低的信噪比（S/N）。</li>
	<li>持续采集数据直至信号消失或已获得足够谱图，通常为30–60秒。如有需要，可追加溶剂以维持较长时间的高强度信号。数据采集完成后停止采集并暂停质谱系统运行。</li>
	<li>移除组织样本，并用100%甲醇和无尘擦拭布清洗夹具。根据供应商的操作规范，在叶片喷雾质谱连续运行约1–2小时后，清洁质谱仪离子入口。在分析不同类型组织之间也应清洁离子入口。</li>
</ol>
4. 数据质量评估
<ol>
	<li>打开数据文件并目视检查基峰质谱色谱图。确认信号强度在约 1.0 × 107 至 5.0 × 108 范围内。若信号较低，将组织靠近离子入口；若信号过高，质谱系统前端会变脏，因此需将组织远离离子入口。</li>
	<li>根据生成的质谱图中目标离子是否存在，调整参数。 
	注意：此处可暂停本实验方案。</li>
</ol>
5. 串联质谱碎裂
<ol>
	<li>确定串联质谱碎裂（MS/MS）中感兴趣的离子；一个质谱信号 &#62; 1.0 × 105 足以用于MS/MS的离子选择。</li>
	<li>新建一个包含纳入列表的方法文件 m/z 保留至小数点后四位。 点击全局列表和纳入. 在 PRM 的性质，选择碎裂能量[例如，归一化碰撞能量（NCE）30–50 是一个合适的起始范围] 以及其他 MS/MS 参数。
	<ol>
		<li>为获得 mesembrine 类生物碱的 MS/MS 数据，对以下离子进行碎裂：276.1583 m/z, 290.1742 m/z，以及 292.1897 m/z，在NCE 35。 
		注意：MS/MS 数据采集可在完成 MS 后立即进行，或在之后的某个时间进行。同一组织样本在完成完整的 MS 后通常可保持夹持状态，并可重复使用以采集 MS/MS 数据。然而，若重新喷雾未能提供足够的信号，则应使用新的组织样本。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>加载MS/MS方法文件和指定的数据文件。开启质谱系统并开始采集数据，必要时加入溶剂。当收集到足够的质谱信号后（通常在30至60秒后），停止数据采集。</li>
	<li>在指认碎片离子时，应在多种不同能量下收集碎裂产物。 
	注意：由于叶片喷雾法MS缺乏色谱分离步骤，其裂解谱图可能包含大量离子，而在不同能量下进行裂解有助于提高谱图解析的清晰度。</li>
</ol>
6. 基于精确质量和串联质谱碎片的推定鉴定
<ol>
	<li>通过参考公共代谢物数据库（如 Metlin21、人类代谢组数据库22、Mass Bank23、Lipid Maps24、美国国家标准与技术研究院质谱检索库25、ReSpect for Phytochemicals26 或 GNPS27）中的精确质量测量值，进行初步鉴定。</li>
	<li>由于这些数据库并不全面，必要时需针对已进行化学表征的植物物种进一步开展文献调研。</li>
	<li>当获得 MS/MS 数据时，将叶喷雾 MS/MS 产生的碎片离子与上述数据库或相关文献中的数据进行比对；或者，通过人工解析 MS/MS 碎片离子，或采用直接进样或 LC-MS/MS 方法对真实标准品进行碎片分析，以辅助鉴定。</li>
</ol>
7. 数据分析
<ol>
	<li>使用 Proteowizard 中的 msConvert 工具将质谱原始文件转换为 mzXML 文件28。</li>
	<li>在 R 中使用 XCMS 软件包进行峰提取。对叶片喷雾质谱分析采用直接进样处理方法。 
	注意：用于数据处理的注释详尽的脚本可在 https://github.com/HegemanLab/Leaf-Spray-Code 获取。</li>
	<li>为获得半定量测量结果并校正实验变异性，需将每种代谢物的强度通过总离子流（TIC）进行归一化，因为叶片喷雾质谱信号强度可能因叶片在离子源中位置的微小差异以及叶片形状和大小的不同而有所变化。</li>
	<li>或者，也可使用仪器厂商提供的软件进行数据分析，或使用 MZmine2（可从 http://mzmine.github.io/ 获取）29。</li>
</ol>

<ol><li>Pitt, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+and+applications+of+liquid+chromatography+-+mass+spectrometry+in+clinical+biochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22The+Clinical+Biochemist+Reviews%22%5BJournal%5D)">Principles and applications of liquid chromatography - mass spectrometry in clinical biochemistry.</a> The Clinical Biochemist Reviews. 30 (1), 19-34 (2009).</li>
<li>Cooks, R. G., Ouyang, Z., Takats, Z., Wiseman, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+technologies.+Ambient+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Detection technologies. Ambient mass spectrometry.</a> Science. 311 (5767), 1566-1570 (2006).</li>
<li>Kim, H. K., Verpoorte, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sample+preparation+for+plant+metabolomics%5BTitle%5D)+AND+%22Phytochemical+Analysis%22%5BJournal%5D)">Sample preparation for plant metabolomics.</a> Phytochemical Analysis. 21 (1), 4-13 (2010).</li>
<li>Takats, Z., Wiseman, J. M., Gologan, B., Cooks, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry+sampling+under+ambient+conditions+with+desorption+electrospray+ionization%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry sampling under ambient conditions with desorption electrospray ionization.</a> Science. 306 (5695), 471-473 (2004).</li>
<li>Liu, J., Wang, H., Cooks, R. G., Ouyang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leaf+spray%3A+direct+chemical+analysis+of+plant+material+and+living+plants+by+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Leaf spray: direct chemical analysis of plant material and living plants by mass spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 83 (20), 7608-7613 (2011).</li>
<li>Chan, S. L. -F., Wong, M. Y. -M., Tang, H. -W., Che, C. -M., Ng, K. -M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-spray+ionization+mass+spectrometry+for+raw+herb+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Communications+in+Mass+Spectrometry%22%5BJournal%5D)">Tissue-spray ionization mass spectrometry for raw herb analysis.</a> Rapid Communications in Mass Spectrometry. 25 (19), 2837-2843 (2011).</li>
<li>Wang, H., Liu, J., Cooks, R. G., Ouyang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paper+spray+for+direct+analysis+of+complex+mixtures+using+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">Paper spray for direct analysis of complex mixtures using mass spectrometry.</a> Angewandte Chemie International Edition. 49 (5), 877-880 (2010).</li>
<li>Liu, J., Wang, H., Cooks, R. G., Ouyang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leaf+spray%3A+Direct+chemical+analysis+of+plant+material+and+living+plants+by+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Leaf spray: Direct chemical analysis of plant material and living plants by mass spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 83 (20), 7608-7613 (2011).</li>
<li>Malaj, N., Ouyang, Z., Sindona, G., Cooks, R. G. <a target="_blank" href="http://pubs.rsc.org/en/content/articlelanding/2012/ay/c2ay25222h">Analysis of pesticide residues by leaf spray mass spectrometry.</a> Analytical Methods. 4 (7), 1913-1919 (2012).</li>
<li>Snyder, D. T., Schilling, M. C., Hochwender, G., Kaufman, A. D. <a target="_blank" href="http://pubs.rsc.org/en/content/articlelanding/2015/ay/c4ay02639j">Analytical methods profiling phenolic glycosides in Populus deltoides and Populus grandidentata by leaf spray ionization tandem mass spectrometry.</a> Analytical Methods. 7 (3), 870-876 (2015).</li>
<li>Falcone, C. E., Cooks, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+recognition+of+emerald+ash+borer+infestation+using+leaf+spray+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Communications+in+Mass+Spectrometry%22%5BJournal%5D)">Molecular recognition of emerald ash borer infestation using leaf spray mass spectrometry.</a> Rapid Communications in Mass Spectrometry. 30 (11), 1304-1312 (2016).</li>
<li>Liu, J., Gu, Z., Yao, S., Zhang, Z., Chen, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+analysis+of+Callicarpa+L.+using+direct+spray+ionization+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmaceutical+and+Biomedical+Analysis%22%5BJournal%5D)">Rapid analysis of Callicarpa L. using direct spray ionization mass spectrometry.</a> Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 124, 93-103 (2016).</li>
<li>Freund, D. M., Martin, A. C., Cohen, J. D., Hegeman, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+detection+of+surface+localized+specialized+metabolites+from+Glycyrrhiza+lepidota+%28American+licorice%29+by+leaf+spray+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Planta%22%5BJournal%5D)">Direct detection of surface localized specialized metabolites from Glycyrrhiza lepidota (American licorice) by leaf spray mass spectrometry.</a> Planta. 247 (1), 267-275 (2018).</li>
<li>Smith, M. T., Crouch, N. R., Gericke, N., Hirst, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Psychoactive+constituents+of+the+genus+Sceletium+N.E.Br.+and+other+Mesembryanthemaceae%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Ethnopharmacology%22%5BJournal%5D)">Psychoactive constituents of the genus Sceletium N.E.Br. and other Mesembryanthemaceae: a review.</a> Journal of Ethnopharmacology. 50 (3), 119-130 (1996).</li>
<li>Gerickea, N., Viljoen, A. M. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18761074">Sceletium-a review update.</a> Journal of Ethnopharmacology. 119 (3), 653-663 (2008).</li>
<li>Terburg, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+effects+of+Sceletium+tortuosum+%28Zembrin%29%2C+a+dual+5-HT+reuptake+and+PDE4+inhibitor%2C+in+the+human+amygdala+and+its+connection+to+the+hypothalamus%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropsychopharmacology%22%5BJournal%5D)">Acute effects of Sceletium tortuosum (Zembrin), a dual 5-HT reuptake and PDE4 inhibitor, in the human amygdala and its connection to the hypothalamus.</a> Neuropsychopharmacology. 38 (13), 2708-2716 (2013).</li>
<li>Coetzee, D. D., López, V., Smith, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-mesembrine+Sceletium+extract+%28TrimesemineTM%29+is+a+monoamine+releasing+agent%2C+rather+than+only+a+selective+serotonin+reuptake+inhibitor%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Ethnopharmacology%22%5BJournal%5D)">High-mesembrine Sceletium extract (TrimesemineTM) is a monoamine releasing agent, rather than only a selective serotonin reuptake inhibitor.</a> Journal of Ethnopharmacology. 177, 111-116 (2016).</li>
<li>Shikanga, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+permeation+of+mesembrine+alkaloids+from+Sceletium+tortuosum+across+porcine+buccal%2C+sublingual%2C+and+intestinal+mucosa%5BTitle%5D)+AND+%22Planta+Medica%22%5BJournal%5D)">In vitro permeation of mesembrine alkaloids from Sceletium tortuosum across porcine buccal, sublingual, and intestinal mucosa.</a> Planta Medica. 78 (3), 260-268 (2012).</li>
<li>Pulliam, C. J., Bain, R. M., Wiley, J. S., Ouyang, Z., Cooks, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry+in+the+home+and+garden%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+The+American+Society+for+Mass+Spectrometry%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry in the home and garden.</a> Journal of The American Society for Mass Spectrometry. 26 (2), 224-230 (2015).</li>
<li>Lawton, Z. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analytical+validation+of+a+portable+mass+spectrometer+featuring+interchangeable%2C+ambient+ionization+sources%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+for+Mass+Spectrometry%22%5BJournal%5D)">Analytical validation of a portable mass spectrometer featuring interchangeable, ambient ionization sources.</a> Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 28 (6), 1048-1059 (2017).</li>
<li>Metlin. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://metlin.scripps.edu">http://metlin.scripps.edu</a> (2018).</li>
<li>Human Metabolome Database. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.hmdb.ca/">http://www.hmdb.ca/</a> (2018).</li>
<li>Mass Bank. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.massbank.jp/?lang=en">http://www.massbank.jp/?lang=en</a> (2018).</li>
<li>Lipid Maps. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.lipidmaps.org/data/standards/index.html">http://www.lipidmaps.org/data/standards/index.html</a> (2018).</li>
<li>National Institute of Standards and Technology MS Search. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://chemdata.nist.gov/mass-spc/ms-search/">http://chemdata.nist.gov/mass-spc/ms-search/</a> (2018).</li>
<li>ReSpect. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://spectra.psc.riken.jp/">http://spectra.psc.riken.jp/</a> (2018).</li>
<li>GNPS. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://gnps.ucsd.edu/">https://gnps.ucsd.edu/</a> (2018).</li>
<li>Chambers, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cross-platform+toolkit+for+mass+spectrometry+and+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">A cross-platform toolkit for mass spectrometry and proteomics.</a> Nature Biotechnology. 30 (10), 918-920 (2012).</li>
<li>Pluskal, T., Castillo, S., Villar-Briones, A., Ore, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MZmine2%3A+modular+framework+for+processing%2C+visualizing%2C+and+analyzing+mass+spectrometry-based+molecular+profile+data%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">MZmine2: modular framework for processing, visualizing, and analyzing mass spectrometry-based molecular profile data.</a> BMC Bioinformatics. 11, 395(2010).</li>
<li>Meyer, G. M. J., Wink, C. S. D., Zapp, J., Maurer, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GC-MS%2C+LC-MS%28n%29%2C+LC-high+resolution-MS%28n%29%2C+and+NMR+studies+on+the+metabolism+and+toxicological+detection+of+mesembrine+and+mesembrenone%2C+the+main+alkaloids+of+the+legal+high+%26%2334%3BKanna%26%2334%3B+isolated+from+Sceletium+tortuosum%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+and+Bioanalytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">GC-MS, LC-MS(n), LC-high resolution-MS(n), and NMR studies on the metabolism and toxicological detection of mesembrine and mesembrenone, the main alkaloids of the legal high &#34;Kanna&#34; isolated from Sceletium tortuosum.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 407 (3), 761-778 (2015).</li>
<li>Zhang, N., et al. <a target="_blank" href="http://pubs.rsc.org/en/Content/ArticleHtml/2013/AY/c3ay00018d">Rapid detection of polyhydroxylated alkaloids in mulberry using leaf spray mass spectrometry.</a> Analytical Methods. 5 (10), 2455-2460 (2013).</li>
<li>Pereira, I., et al. <a target="_blank" href="http://pubs.rsc.org/en/content/articlelanding/2016/ay/c6ay01154c">Rapid screening of agrochemicals by paper spray ionization and leaf spray mass spectrometry: which technique is more appropriate?</a> Analytical Methods. 8, 6023-6029 (2016).</li>
<li>Zhang, J. I., Li, X., Cooks, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+analysis+of+steviol+glycosides+from+Stevia+leaves+by+ambient+ionization+mass+spectrometry+performed+on+whole+leaves%5BTitle%5D)+AND+%22The+Analyst%22%5BJournal%5D)">Direct analysis of steviol glycosides from Stevia leaves by ambient ionization mass spectrometry performed on whole leaves.</a> The Analyst. 137 (13), 3091-3098 (2012).</li>
<li>Freund, D. M., Hegeman, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+stable+isotope-enabled+mass+spectrometry-based+plant+metabolomics%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Recent advances in stable isotope-enabled mass spectrometry-based plant metabolomics.</a> Current Opinion in Biotechnology. 43, 41-48 (2017).</li>
<li>Wurtzel, E. T., Kutchan, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+metabolism%2C+the+diverse+chemistry+set+of+the+future%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Plant metabolism, the diverse chemistry set of the future.</a> Science. 353 (6305), 1232-1236 (2016).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

成功应用本方案依赖于针对特定植物种类、组织类型及目标化合物对各个步骤进行优化。方案中描述的参数可作为良好的起始点。以下实验条件需要确定并进行测试：（1）使用切割或未切割的组织；（2）是否使用溶剂；（3）选择何种溶剂及其使用体积；（4）组织与离子入口之间的距离；以及（5）电压幅度。优化的目标是找到能够产生持续至少30秒至数分钟连续信号的条件。这些条件应提供足够且可重复的信号强度，以进行精确质量测定和串联质谱（MS/MS）分析。高信号强度依赖于组织中离子喷雾的成功且稳定地产生。喷雾质量取决于指向离子入口的组织尖端的锐利程度、组织尖端与离子入口之间的距离以及所施加的电场电压。成功的喷雾高度依赖于组织尖端的尖锐程度，在某些情况下，需对组织进行切割以形成尖锐的顶端。特别是，切割后组织尖端锥形角度的微小变化，都会显著影响电离效果及所产生的信号强度7。对于本身已具尖端形态的组织，则无需切割，例如禾本科植物叶片或披针形叶片即属此类情况5,13。
<p class="jove_con...

植物含有多种具有不同化学性质的小分子。质谱法（MS）是一种用于分析植物化合物的强大技术，因其能够以高灵敏度和高特异性提供元素组成，从而实现对代谢物的检测与鉴定1。通常情况下，质谱分析采用溶剂提取的样品，并在质谱分析前通过色谱法进行分离1。然而，液相色谱（LC）的使用往往需要较长的分析时间，且通常伴随复杂的样品前处理过程1。相比之下，无需色谱分离、直接对完整组织进行化学分析的技术具有极高的速度，且样品前处理步骤极少2。因此，在可省略色谱步骤的情况下，直接化学分析具有显著优势。
传统的天然产物与代谢组学研究通常依赖于对干燥或冷冻植物材料进行耗时较长的整体提取，这些材料包含多种组织和细胞类型3。另一种方法是直接化学分析，例如对植物组织中的代谢物进行质谱检测，该方法可实现特定细胞类型的分离，并避免样品制备过程中引入的人为假象4。叶片喷雾质谱（leaf spray MS），也称为组织喷雾（tissue-spray）5,6，是一种直接环境电离质谱技术，几乎无需样品前处理5,7。叶片喷雾质谱与纸喷雾质谱（paper spray MS）密切相关，后者是一种具有电喷雾电离特性的环境电离技术，可用于检测沉积在纸基材料上的分析物7。尽管名称中包含“叶片”，但该技术适用于多种植物组织而不仅限于叶片，已在果实、种子、根、花组织和块茎等多种样品上得到验证6,8,9,10,11,12。该技术能够将植物材料中内源性植物化学物质直接电离并导入质谱仪进行检测8。叶片喷雾质谱还可提供有关植物不同组织类型中化学物质空间分布的信息13。与溶剂提取结合液相色谱-质谱（LC-MS）相比，研究结果表明，叶片喷雾质谱能够快速检测来自特定细胞类型（如腺毛）的表面代谢物13。图1展示了叶片喷雾质谱实验装置示意图。仅需对离子源进行轻微改造即可实现直接电喷雾电离。通过金属夹具向植物组织施加高电压，产生高度带电的液滴喷雾，形成泰勒锥（Taylor cone），将离子输送至质谱仪的离子入口。电喷雾电离可来源于植物自身的天然液体，也可来源于施加于植物表面的溶剂。组织上的尖端结构有助于电喷雾的形成，该尖端可以是天然存在的，也可以通过切割人为制造。
叶片喷雾质谱法（leaf spray MS）是一种快速分析完整植物组织的定性和半定量方法，已广泛应用于多种研究场景。例如，该技术曾被用于检测内源性化合物以区分相近物种，甚至可用于评估同一物种在不同生长条件下代谢物的变化。先前的研究已通过该方法测定了紫珠属（Callicarpa L.）12 和西洋参 (Panax quinquefolium L.)6 中的代谢物。在后一案例中，湿润西洋参原始组织后，可检测到人参皂苷、氨基酸和低聚糖。通过块茎切片可区分野生与栽培的西洋参6。叶片喷雾质谱分析后，西洋参块茎的完整性得以保留，从而可进一步进行形态学和显微观察6。此外，该方法也可用于检测植物样品上的外源性化合物。已有研究在水果和蔬菜的果皮或果肉中检测到多种农药（如啶虫脒、二苯胺、咪唑菌酮、利谷隆和噻菌灵）9。尽管已有大量研究展示了叶片喷雾质谱法在特定应用中的价值，但此前尚未报道过详细的操作流程。
本文所述方案并不针对特定组织或化合物的方法优化。相反，将以检测番杏科（Aizoaceae）植物 Sceletium tortuosum (L.) N.E.Br. 中的mesembrine类生物碱为例，讨论在首次为某一物种、组织或化合物建立叶喷雾质谱（leaf spray MS）实验时应采取的必要优化措施。S. tortuosum 是一种多肉植物，原产于南非半干旱的卡鲁（Karroo）地区。该植物是桑人（San）和科伊科伊人（Khoi Khoi）的传统药物，曾用于抑制食欲和口渴，并因其精神活性和镇痛作用而被使用14,15。目前，其标准化提取物已被用于治疗神经精神和神经心理疾病16,17。主要关注的化合物包括生物碱mesembrine及其衍生物，其中许多成分也存在于其他相关的 Sceletium 物种中15。野生和栽培的 S. tortuosum 种群中mesembrine类生物碱的含量存在差异，因此带来了质量控制方面的挑战18。一种能够快速检测mesembrine类生物碱的方法（例如叶喷雾质谱法）可能有助于对 Sceletium 产品的监测。由于此前尚无关于叶喷雾质谱技术的详细可视化实验方案，本文将以 S. tortuosum 为例展示该方法，具体描述如下：纳喷雾源的改装、植物组织的选择与制备、数据采集、结果解读以及质谱参数的优化。

<table><tbody><tr><td>连接针</td><td>Digi-Key elctronics</td><td>WM2563CT-ND</td><td>针将插入赛默飞世尔科技的源中以提供电压</td></tr><tr><td>小型夹子</td><td>Digi-Key elctronics</td><td>314-1018-ND</td><td>微型铜质鳄鱼夹，5A</td></tr><tr><td>大型夹子</td><td>Digi-Key elctronics</td><td>290-1951-ND</td><td>窄型镍质鳄鱼夹，5A</td></tr><tr><td>热缩管</td><td>Digi-Key elctronics</td><td>Q2Z1-KIT-ND</td><td>用于覆盖焊接接头</td></tr><tr><td>NSI 源 纳米喷雾电离源</td><td>Thermo scientific</td><td>NA</td><td>如果您不使用赛默飞世尔科技的仪器，则可使用其他品牌</td></tr><tr><td>Q Exactive-混合四极杆Orbitrap</td><td>Thermo scientific</td><td>NA</td><td>如果您不使用赛默飞世尔科技的仪器，则可使用其他品牌</td></tr><tr><td>Tune 软件</td><td>Thermo scientific</td><td></td><td>如果您不使用赛默飞世尔科技的仪器，则可使用其他品牌</td></tr><tr><td>Xcalibur 软件</td><td>Thermo scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>目标植物 - &lt;em&gt;S. tortousum&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

叶片喷雾质谱法：一种用于直接检测植物组织代谢物的快速常温离子化技术

Leaf Spray Mass Spectrometry: A Rapid Ambient Ionization Technique to Directly Assess Metabolites from Plant Tissues

植物会产生数千种化学性质各异的小分子。质谱法（MS）是分析植物代谢物的一种强大技术，因其能够以高灵敏度和高特异性提供分子量信息。叶喷雾质谱法是一种常温电离技术，通过电喷雾直接利用植物组织进行化学分析，无需色谱分离步骤。这种代谢物取样方法可同时检测完整植物组织中的多种化学类别，显著减少样品前处理的工作量。当与高分辨率、精确质量的质谱仪联用时，叶喷雾质谱法可实现对目标代谢物的快速检测。该技术还可采集串联质谱碎裂数据，有助于化合物的鉴定。精确质量测定与碎裂图谱相结合，有利于确认化合物的身份。叶喷雾质谱技术仅需对纳米电喷雾电离源进行少量改装，即可成为进一步拓展质谱仪功能的实用工具。本文中，对来自南非的传统药用植物 Sceletium tortuosum（番杏科）的新鲜叶片组织进行了分析；通过叶喷雾质谱法检测到多种美沙明类生物碱。

萌发后10周时，采集温室栽培的 S. tortuosum 新鲜叶片，采用叶片喷雾质谱法（leaf spray MS）进行分析。利用叶片喷雾质谱法检测 S. tortuosum 叶片中代谢物的实验流程如图2所示。选取一片叶片，用剪刀切成一端逐渐变细的细条，形成尖端，并用叶片喷雾质谱专用的金属夹具夹住。将植物组织置于距离离子入口约30 mm处，并与x轴和y轴对齐。启动对 S. tortuosum 叶片的叶片喷雾质谱分析后，在未施加任何溶剂的情况下即检测到离子信号。Sceletium 属植物为多肉植物，叶片厚实且含水量高，其自身水分足以支持在无外加溶剂条件下通过叶片喷雾实现电喷雾电离。然而，大多数植物组织通常需要施加溶剂才能检测到离子信号。
在正离子化模式下采集30秒后，生成了包含大量离子的质谱总离子流图和质谱图（<strong...

叶片喷雾质谱是一种直接化学分析技术，可最大限度减少样品前处理并省去色谱步骤，从而实现对植物组织中小分子的快速检测。

植物产生数千种化学性质各异的小分子。质谱法（MS）是分析……的一种强大技术。

叶片喷雾质谱法是一种快速分析完整植物组织的定性与半定量方法，具有广泛的应用。该技术的主要优势在于植物组织可几乎无需样品前处理而直接进行分析。尽管该方法在分析来自钩藤属（Sceletium）的美沙明类生物碱方面具有良好的效果，也可用于分析其他多种植物种类以及外源性化学物质，如农药。初次使用该方法的研究人员可能会感到具有挑战性，因为需要针对每种植物物种、组织类型和目标化合物优化实验方案。使用改良的纳米喷雾源进行叶片喷雾质谱分析。由于叶片喷雾质谱分析无需任何流体组件，可通过从源中移除液相色谱探针来改装喷雾源。用于向植物组织施加电压的叶片喷雾质谱金属丝一端焊接有插针，另一端焊接有夹子。如果系统最近刚使用过，请在拆卸扫掠锥中的替代源之前，等待其冷却至可触碰温度。然后安装纳米喷雾叶喷雾质谱源。最后，按照文本方案中的描述创建调谐文件和方法文件。始终佩戴手套，不要使用被裸手接触过的植物组织。否则，污染物离子（如聚乙二醇）将主导质谱信号。将用于分析的植物组织带入与质谱系统相同的房间，以便快速取样。对于没有天然尖端的植物组织，可使用载玻片上的剃刀片切出锥形尖端。在种子萌发后10周时，将螺旋芦荟（Sceletium tortuosum）叶片切成细条，每条末端均呈锥形以形成尖端。用镊子轻轻夹取将要被固定的组织末端部分。用镊子夹住组织，小心地将其转移至夹具上。调整夹具的柔性臂和金属丝，使组织与质谱仪进样口对齐。关于每种特定质谱仪离子入口的最佳距离，请参考正文内容。如果初次尝试产生的信号强度较低，可将植物组织移近离子入口。加载方法文件，命名数据文件并设置文件存储位置。然后通过点击“播放”开启质谱系统，并点击“开始”以启动数据采集。使用带有加样枪头的移液器施加溶剂，以最大限度增加高电压与操作者手部之间的距离，确保安全。持续采集数据直至信号消失或获得足够的谱图，通常为 30 至 60 秒。停止数据采集并暂停质谱系统。采集完成后，移除组织，并用无绒布蘸取100%甲醇清洗夹具。打开数据文件，目视检查基峰质谱色谱图。检查信号强度是否在约1000万至5亿之间。创建一个新的方法文件，其中包含精确到小数点后四位的质荷比（M/Z）纳入列表。点击全局列表并选择纳入。在 PRM 的属性中，选择碎裂能量及其他串联质谱参数。为获得 mesembrine 类生物碱的串联质谱数据，需在归一化碰撞能量为 35 的条件下，对质荷比（M/Z）分别为 276.1583、290.1742 和 292.1897 的离子进行碎裂。随后，加载串联质谱方法文件和指定名称的数据文件。打开质谱系统，必要时加入溶剂并开始采集数据。当获得足够的质谱图后（通常在30至60秒后），停止数据采集。按照文本方案中所述进行数据分析。通过叶片喷雾质谱法及正离子化模式对扭茎仙人掌（Sceletium tortuosum）进行代谢谱分析的代表性结果如图所示

leaf-spray-mass-spectrometry-rapid-ambient-ionization-technique-to

Research

科研

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

叶喷雾质谱: 一种快速的环境电离技术直接评价植物组织中的代谢产物

激光烧蚀电喷雾电离（LAESI）是一种用于质谱分析的常压电离源。在成像模式下，中红外激光用于探测组织切片或生物膜中分子的空间分布。该技术为在接近天然实验条件下开展多种生物分析研究提供了一种新方法。...

大气压分子成像技术在生物组织和生物膜的激光烧蚀电喷雾电离质谱分析中的应用

非靶向代谢组学可提供代谢谱的假设生成式快照。本方案将演示从细胞、血清或组织中提取和分析代谢物的方法。通过液-液相萃取、微流速超高效液相色谱/高分辨质谱法（UPLC-HRMS）结合差异分析软件，对多种代谢物进行检测。...

使用超高效液相色谱-高分辨质谱法（UPLC-HRMS）对生物来源样本进行非靶向代谢组学分析

质谱成像（MSI）是一种强大的工具，可用于在完整组织中发现和鉴定多种化学物质，同时将化合物保留在其原始环境中，从而为生物学过程提供新的见解。本文介绍了一种用于小分子分析的质谱成像方法。...

MALDI-质谱成像技术用于研究Medicago truncatula根瘤中的代谢物

本文介绍了一种通过实时直接分析-高分辨质谱法结合多变量统计分析对植物材料进行物种鉴定的方法。...

利用实时直接分析高分辨质谱法快速高通量鉴定植物材料物种

介绍了一种利用单个样品对生物组织中的脂质、代谢物和蛋白质进行综合提取的实验方案。...

一种用于从单个样品中全面分析代谢物、脂质和蛋白质的简单分级提取方法

气泡萃取是一种用于分析挥发性和半挥发性化合物的新型实验技术。通过施加过压并搅拌液体样品，使载气溶解于其中。随后对样品室进行减压，分析物因起泡现象而释放至气相中。...

挥发性有机化合物的 fizz 萃取结合大气压化学电离四极杆质谱法

本方案描述了一种高通量方法，结合互补的分析技术和组学技术，最终实现对不同生态系统中天然有机质和微生物蛋白质组的全面配对表征。该方法可进行可靠的比较，有助于识别对描述温室气体产生及预测环境变化响应具有重要意义的代谢途径和转化过程。...

用于表征复杂天然有机质混合物的单通量互补高分辨率分析技术

本文介绍了基于常压质谱技术的一种独特实时分析方法的样品制备步骤。该方法使我们能够在无需任何特殊预处理的情况下，对生物分子进行实时的活体分析。...

探针电喷雾电离质谱分析的样品制备

本文介绍了一种对小麦籽粒代谢物和脂质进行非靶向分析的方法。该方案包括乙腈代谢物提取法以及反相液相色谱-质谱分析法，并在正离子和负离子电喷雾电离模式下进行检测。...

基于液相色谱-质谱的非靶向小麦籽粒代谢组学分析

该方法利用质谱成像（MSI）技术研究S.

通过质谱成像研究 Salix alba 叶片中外源物质的代谢

结合液相色谱-高分辨质谱法的13C6-葡萄糖标记方法具有广泛适用性，为今后研究药用植物中次生代谢物合成所涉及的主要器官和代谢途径，以及次生代谢物的综合利用奠定了基础。...

13C6-葡萄糖标记结合液相色谱-质谱法：植物次生代谢物合成中主要器官的鉴定

了解叶喷雾质谱技术如何直接分析完整植物组织中的代谢产物。该方法无需复杂样品制备即可快速检测生物碱和农药等小分子，为植物化学研究提供高效便捷的分析手段。

叶片喷雾质谱法：一种用于直接检测植物组织代谢物的快速常温离子化技术

探索更多视频