有髓轴突上的光谱反射显微镜技术 原位

该技术有助于解答髓鞘研究领域的一些关键问题，例如髓鞘可塑性和脱髓鞘过程。此技术的主要优势在于，无需复杂的标记或样品制备，即可在完整脑组织中研究有髓轴突的纳米结构。本文将展示该技术在脑切片中的应用，但该方法也可拓展至活体动物研究。

根据文本方案固定并切片小鼠脑组织后，为每一片组织准备一张载玻片和两片盖玻片。使用玻璃切割刀将其中一片方形盖玻片切成两半。然后，使用超级胶水将这两片半盖玻片粘附在载玻片上，制成间隔片。

使用毛刷或移液器采集脑切片，并将组织置于载玻片上的间隔片之间，注意避免组织折叠。在组织表面加入 100 µL 的 PBS。然后，将第二块方形盖玻片覆盖在组织上方，注意避免产生气泡。

使用指甲油密封盖玻片周围，以防止在后续成像过程中 PBS 蒸发以及灰尘污染。成像前至少一小时打开显微镜，使激光光源达到热稳定。然后启动光谱扫描软件，并点击图形用户界面（GUI）顶部的“采集”按钮。

打开白光激光器和光电倍增管的软件快门。在采集模式下，从下拉列表中选择 XY lambda 模式。此时，激光输入模式将自动从恒定百分比切换为恒定功率。

在 lambda 激发条件下，设置 lambda 扫描参数，取消勾选自动 SP 移动选项，并将输入激光的光谱范围设置为 470 至 670 纳米，光谱步长设置为 4 纳米。通过双击或移动光谱范围调节条，将 PMT 的光谱范围设置为 450 至 690 纳米。选择一个具有高数值孔径的合适水浸物镜。

为PMT和激光功率设置任意值，以激活AOBS配置并启用实时扫描按钮。在AOBS配置下，通过勾选反射切换至光路。随后，将参考镜安装在显微镜载物台上，使其表面朝向物镜。

如果难以将镜面直接放置在显微镜载物台上，可将镜面粘附于平整的平板上。调节显微镜载物台，使焦平面与镜面表面对齐。然后，根据探测器的动态范围，调节光电倍增管（PMT）增益和激光功率。

在伪彩色下检查整个波长范围内是否存在饱和现象。如果观察到饱和，则降低激光功率。然后运行lambda扫描采集。

取下镜片，不放置样品，重复相同的采集过程，以获得暗参考图像。然后将数据保存为多层堆叠的TIF格式。进行SpeRe图像采集时，将切片置于显微镜载物台上。

通过目镜使用宽场荧光模式，大致将组织与物镜的焦平面进行对齐。在实时扫描开启的情况下，控制显微镜载物台，使焦平面与组织中的目标区域对齐。为避免来自盖玻片的背景噪声，应从玻璃与组织交界面起，选择深度至少为15 µm的区域作为目标区域。

使用本视频前面演示的相同方法，获取目标区域的光谱图像堆栈。然后将组织和暗偏移的数据以多层堆叠的 TIF 格式保存。要在 ImageJ 中处理图像，请打开参考镜和脑组织的光谱数据。

为已打开的图像序列选择感兴趣区域（ROI），包括参考镜的中心区域和脑组织中的一段轴突纤维。然后运行图像、序列、沿Z轴绘制轮廓，以获取所选ROI的原始光谱。由于轴突纤维在其长度方向上可能存在结构异质性，因此建议在较小的轴突片段上选择ROI，通常小于5 µm，以尽量减少部分容积伪影。

打开暗偏移数据，一份是参考镜面采集的，另一份是脑组织采集的，并绘制Z轴轮廓，方法如前所述。然后使用复制和粘贴功能保存所有已获取的参数。为进行基线校正和SpeRe信号分析，需从参考镜面和脑组织的光谱中减去偏移光谱。

通过将每个光谱除以其最大强度来归一化光谱。通过取实验中所用波长的倒数得到波数，通过将轴突的光谱除以参考镜的光谱来归一化轴突光谱，并从归一化光谱中减去直流偏移量。然后通过将获取的光谱拟合到正弦曲线来获得波数频率。

通过取倒数将获得的波数频率转换为周期性，再利用此处所示方程将波数周期性转换为轴突直径。在本实验中，固定的脑切片经髓鞘荧光染色，并采用比传统荧光共聚焦显微镜低一个数量级光剂量的条件进行SpeRe成像。根据光学反射的几何特性，SpeRe信号如预期般定位于有髓轴突的中心。

从轴突节段的反射光谱中获得波数周期性，并将其转换为轴突直径。该图展示了此处方框区域内荧光强度的横向分布，通过SpeRe测得的直径与基于荧光的测量结果高度一致。SpeRe成像基于光学反射原理。

因此，基于二氧化硅的盖玻片可能会引入显著的背景噪声。在光学系统中，当成像深度小于五微米时，背景噪声较为明显；但当成像深度大于15微米时，可避免该问题。校准步骤并非每次实验都必需，但建议至少每周进行一次。

校准完成后，通常每个视野的成像过程可在20秒内完成。在实施该操作时，需注意考虑探测器在全光谱扫描中的动态延迟。观看本视频后，您应能够充分掌握如何利用反射成像获取有髓轴突的纳米结构信息。