通过整合结构质谱法分析蛋白质结构与蛋白质-配体复合物

如今，质谱技术在结构生物学中发挥着重要作用。该方法有助于回答有关重要生物大分子（尤其是蛋白质和蛋白质复合物）在天然状态下的关键问题。天然质谱技术可广泛应用于多种生物分子组装体，包括多蛋白体系和核酸体系。

该技术的主要优势在于其快速且高度灵敏。它可用于分析成分复杂的蛋白质样品，并能够同时检测处于寡聚状态的多种蛋白质。演示该实验操作的是我课题组的博士研究生Andy Lau。

开始此操作前，按照文本方案中所述制备实验室自制的纳米电喷雾毛细管。每次运行均需制备一份无配体样品作为对照，并将其缓冲液置换为乙酸铵。接下来，选择灵敏度模式、正离子采集模式以及迁移率飞行时间（mobility TOF）模式。

接下来打开捕集阱、API 和 IMS 气体。进行离子迁移率分离时，使用此处所示的氮气和氩气起始参数，并根据需要进行调整。设置合适的质荷比（m/z）采集范围。

对于未知蛋白质，初始优化步骤应使用较宽的范围。将镀金毛细管插入毛细管支架中，然后向毛细管内加载 2 至 3 微升目标蛋白质复合物溶液。

轻轻拧紧毛细管，并将其放置在电喷雾离子源的样品台上。将样品台推至指定位置以开始采集数据。施加较低的纳流气体压力，直至毛细管尖端形成液滴。

移动毛细管相对于锥体的位置，并监测离子流以获得稳定的离子流。施加0.9至1.6千伏范围内的毛细管电压。然后根据文本方案设置采样锥电压、源偏置电压、源温度和锥孔气体流速。

为了获得分辨率良好的质谱图并最大化离子传输效率，需调整质谱参数并监测谱图的变化。将离子阱碰撞能量设定在10至50伏之间的初始值。如果电压偏移不足，则调整离子阱碰撞能量。

通过调节电压将捕集器设定在20至45伏特之间的初始起始点。通过优化该电压以改善去溶剂化效果。随后，按照文中所述优化波速和波高，以实现最佳的迁移率分离。

对于涉及 HerA 和 NurA 的研究，使用 40 米/秒的波速，波高在 550 至 650 伏特之间。进行 DNA 结合分析时，将蛋白质与 DNA 按能够形成蛋白质-DNA 复合物的摩尔比例混合。逐步增加以下任一种物质的用量：5'O-3-硫代三磷酸四锂盐或 ADP。

使用适当的软件测量所生成物种的质量，并鉴定配体结合情况，例如 ATP 和 ADP 的结合以及寡聚状态。然后利用原始 ESI-MS 谱图中观察到的离子强度来定量各物种的相对丰度。在优化仪器条件以实现稳定传输后，将碰撞能量和采样锥电压降至尽可能低，同时仍保持良好的谱图质量。

使用先前确定的优化波速和波高获取离子淌度质谱（IM MS）数据。在保持相同波高的情况下，以三种不同的波速测量离子漂移时间。为测定蛋白质离子的碰撞截面（CCS），需使用相同的仪器条件，检测四种蛋白质校准物，其中两种的质量高于待测蛋白质，另两种的质量低于待测蛋白质。首先，按照文本方案中的说明制备蛋白质样品，并将其缓冲液置换为乙酸铵。

以10%的增量加入溶剂，直至达到所需体积。冰上孵育一小时。之后，对每个样品采集离子迁移率-质谱（IM-MS）谱图。

使用 SUMMIT 软件分配蛋白质亚复合物并生成蛋白质相互作用网络。或者，手动列出预期物种的理论质谱质量。为开始研究蛋白质复合物的稳定性，逐步将捕获加速电压从 10 伏特升高至 200 伏特，同时记录离子迁移率-质谱（IM-MS）数据，这将逐步诱导蛋白质在气相中解折叠。

使用适当的软件分析数据，并通过叠加每个电荷态在不同加速电压下的强度归一化碰撞截面（CCS）分布，生成二维去折叠图。原生质谱（native MS）结果揭示了HerA与NurA复合物的寡聚状态、组成及拓扑结构。由于非共价相互作用在气相中得以保留，因此采用ATPγS与ADP滴定实验的原生质谱方法，用于确定HerA与NurA中核苷酸的成对结合情况。

HerA 寡聚状态的质谱结果显示，随着 ATPγS 浓度的增加，六聚体 HerA 的相对强度也随之增强。通过离子迁移质谱（IM-MS）实验可获得蛋白质及其复合物的实验碰撞截面（CCS）值。这些实验值与来自 X 射线晶体学的理论测量值具有良好一致性，从而验证了利用 CCS 值构建蛋白质组装低分辨率模型的可行性。

CIU 和 KEcom 分析表明，结合 DNA 的 HerA-NurA 比无 DNA 的复合物更稳定。CIU MS 分析及其相应的 ATP 结合状态显示，在气相中，结合四个 ATPγS 的状态会降低复合物的稳定性。然而，当所有结合位点均被占据、形成结合六个 ATPγS 的状态时，该复合物表现出最高的稳定性。

对完整复合物的分子质量进行精确测量，可为生物大分子的表征提供重要信息。我们能够获得有关复合物组装途径、蛋白质寡聚化以及配体结合的信息。综合这些信息，可构建功能生物复合物的详细模型。