综合结构质谱分析蛋白质结构和蛋白质配体配合物

质谱学在结构生物学中起着重要的作用。这种方法可以帮助回答有关重要的生物大分子在原生状态，特别是蛋白质和蛋白质复合物的关键问题。原生质谱广泛适用于各种生物分子群，包括多蛋白和核酸系统。

这种技术的主要优点是它快速和高度敏感。它可用于检测异质蛋白样本，使同时分析寡聚态的多种蛋白质成为可能。演示这个程序的将是我小组中的博士生刘德华。

要开始此过程，请准备内部毛细管的纳米电子纤维，如文本协议中所述。准备一个无配体样品作为每次运行的控件，作为缓冲交换每个到醋酸铵。接下来，选择灵敏度、正离子采集和移动 TOF 模式。

接下来打开陷阱、API 和 IMS 气体。对于 IM 分离，请使用此处显示的氮气和气氮起始点，并根据需要进行调整。设置适当的 m/z 采集范围。

对于未知蛋白质，初始优化步骤应使用范围很广。将镀金毛细管插入毛细管支架。然后将感兴趣的蛋白质复合溶液的2至3微升加载到毛细管中。

轻轻拧紧毛细管，并放在电喷源舞台上。将阶段滑入位置，开始获取数据。施加低纳米流气体压力，直到毛细管尖端形成下降。

将毛细管与圆锥体移动，并监控离子电流以实现稳定的离子电流。在 0.9 和 1.6 千伏之间施加毛细管电压。然后设置文本协议中概述的采样锥体、源偏移、源温度和锥体气体流量。

为了获得一个解析良好的质量谱并最大化离子传输，请调整MS参数并监测光谱中产生的变化。将陷阱碰撞能量设置为 10 到 50 伏之间的初始起点。如果电压偏移不足，则调整陷印碰撞能量。

通过其电压将陷阱设置到 20 到 45 伏之间的初始起始点。通过优化此电压改善溶解。在此之后，优化文本中概述的波速度和波高度，以实现最佳的移动分离。

对于涉及 HerA 和 NurA 的研究，请使用 40 米/秒的波速和 550 到 650 伏的波高。对于DNA结合分析，混合蛋白质和DNA在摩尔比，允许蛋白质DNA复合的形成。加入以下任意一种，5'O-3-硫磷酸盐、四立盐或ADP的量。

使用适当的软件测量生成的物种质量，并确定配体结合，如ATP和ADP结合和寡聚状态。然后使用原始 ESI MS 光谱中观察到的离子强度来量化相应的相对物种丰度。优化仪器条件后，稳定传输，尽可能降低碰撞能量和采样锥体，同时保持良好的光谱质量。

使用先前确定的优化波速度和波高获取 IM MS。测量三个不同的波速的离子漂移时间，同时保持相同的波高。要确定蛋白质离子CCS测量四个蛋白质卡布里特，两个与质量以上的蛋白质被调查，两个与质量以下，使用相同的仪器条件。首先，准备蛋白质样本，并缓冲交换成醋酸铵，如文本协议中所述。

以10%的增量加入溶剂，直到达到所需的量。在冰上孵育一小时。在此之后，获取每个样本的 IM-MS 频谱。

使用 SUMMIT 软件，分配蛋白质子复杂并生成蛋白质相互作用网络。或者，手动生成预期物种的理论质量列表。要开始研究蛋白质复杂稳定性，记录 IM-MS 数据，同时将陷阱加速度电压从 10 伏特增加至 200 伏，这些电压将逐步展开到蛋白质和气相。

使用适当的软件分析数据，通过堆叠每个充电状态的每个加速电压的强度规范化 CCS 分布来生成二维展开图。原生MS结果揭示了 HerA 和 NurA 复合物的寡聚状态、组成和拓扑。由于在气相中保留了非价相互作用，ATP伽马S和ADP滴定实验的原生MS用于确定 HerA和NurA中对核苷酸结合。

HerA寡聚状态的质谱显示，增加ATP伽马S浓度会增加六聚体 HerA 的相对强度。然后从 IM-MS 实验中得出蛋白质及其复合物的实验 CCS 值。这些值被认为与X射线晶体学的理论测量非常一致，X射线晶体学使用CCS值来验证建立低分辨率的蛋白质组装模型。

CIU 和 KEcom 分析表明，DNA 绑定 HerA-NurA 比无 DNA 复合体更稳定。CIU MS 分析和相应的 ATP 结合状态表明，四个 ATP 伽马 S 绑定状态降低了气相的复杂稳定性。然而，所有站点被占用的六个 ATP 伽玛 S 绑定状态被视为最稳定的。

精确测量完整复合物的分子质量，为生物分子特性提供了宝贵的见解。我们可以获得关于复杂组装途径、蛋白质寡聚化和配体结合的信息。将所有这些信息组合在一起，可以生成功能生物组件的详细模型。