Name: 综合结构质谱分析蛋白质结构和蛋白质配体配合物 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 33 s
Description: 学习使用原生质谱技术解析蛋白质复合物结构与配体相互作用的方法。该技术可快速灵敏地分析寡聚状态，为结构生物学研究提供关键数据。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

我们感谢Karl-Peter Hopfner和Robert Thomas Byrne慷慨提供HerA及HerA-NurA蛋白样品，并在实验设计方面给予帮助。同时感谢Eamonn Reading博士对本文手稿的审阅。我们衷心感谢资助机构：Wellcome Trust [109854/Z/15/Z] 和英国皇家学会 [RG150216，授予A.P.]。

1. 蛋白质及蛋白质-配体复合物天然质谱分析的样品制备
注意：为了利用原生质谱法（native MS）理解蛋白质复合物与配体结合的分子基础，合适的样品制备至关重要。本节旨在以结合DNA和核苷酸的HerA-NurA复合物为例，重点介绍质谱分析前必需的样品制备步骤。
<ol>
	<li>在1.5 mL离心管中制备浓缩纯化蛋白的20 µL分装液（通常浓度为15 - 30 µM）。</li>
	<li>用于ATP或ADP结合分析 
	注意：加入浓度递增的不可水解ATP类似物——腺苷5′-O-(3-硫代三磷酸)四锂盐（ATP-γ-S）或腺苷5′-二磷酸（ADP）。不可水解的ATP衍生物可形成稳定的复合物，从而使得ATP结合态蛋白能够被捕获。其他可测试的不可水解ATP类似物包括AMP-PNP和ATP-γ-S-Mg2+。
	<ol>
		<li>对于HerA-NurA的研究，将5 µM纯化蛋白与ATP-γ-S和ADP在0–1 mM浓度范围内混合。</li>
		<li>为捕获ATP-γ-S与ADP的同时结合，可在相同或不同浓度下同时加入两种核苷酸。</li>
		<li>加入2 mM MgCl2，在25 °C干浴孵育器中孵育1小时。 
		注意：使用nESI原生质谱分析核苷酸结合时，高浓度下可能出现非特异性结合的人为假象，因此必须考虑非特异性结合的影响29。为研究非特异性结合，可加入2–5 mM之间的较高浓度核苷酸进行测试。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用于DNA结合分析
	<ol>
		<li>以允许蛋白-DNA复合物形成的摩尔比混合蛋白与DNA。对于HerA及HerA-NurA，将5 µM纯化蛋白与DNA按1:1比例混合。</li>
		<li>将HerA-NurA或HerA-DNA混合物在25 °C干浴孵育器中孵育30分钟，直至达到平衡。孵育时间和温度可根据所研究蛋白的不同而调整。</li>
		<li>将蛋白样品置换至适合质谱检测的缓冲液中。常用缓冲液为pH 7–8、5 mM–1 M的乙酸铵水溶液。其他适用于质谱的缓冲液包括乙二胺二乙酸盐（EDDA）和三乙胺乙酸盐（TEAA）30。对于HerA-NurA研究，使用pH 7的200 mM乙酸铵溶液。 
		注意：质谱分析前有多种缓冲液置换方法，例如使用离心浓缩管或层析柱。原生质谱的结果主要受限于样品质量，例如纯化过程中使用的缓冲液和加合物。因此，必须进行充分的脱盐处理，以获得分辨良好的质谱峰。</li>
		<li>对于HerA-NurA配体结合研究，使用浓缩管将样品用200 mM乙酸铵缓冲液进行6–8次缓冲液置换。尽管该方法耗时较长，但可确保获得分辨良好的质谱峰，并实现对ATP/ADP结合物种的准确质量测定。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 用于研究蛋白质复合物和蛋白质-配体复合物的原生质谱采集与分析
注意：应优化质谱条件以获得高分辨峰，从而实现精确的质量测定。本节详细介绍了配备32k上限m/z四极杆的Q-ToF质谱仪的优化参数。
<ol>
	<li>自制纳米电喷雾毛细管，并按照Kirshenbaum所述方法进行仪器质谱校准，以实现精确的质量测定 等1.</li>
	<li>选择灵敏度、正离子采集模式和迁移率飞行时间质谱（TOF）模式。</li>
	<li>打开捕集阱（Trap）、API 和 IMS 气体。进行离子迁移率（IM）分离时，初始气体流速可采用氮气（60 mL/min）和氩气（捕集阱区域为 8.4 mL/min），随后根据需要进行调整。</li>
	<li>设置合适的质荷比（m/z）采集范围。对于未知蛋白质，初始优化步骤应使用较宽的范围，例如 500–32,000 m/z。</li>
	<li>加载 2-3 µL 将待分析的蛋白质复合物溶液加入镀金毛细管中，并将其插入毛细管支架。</li>
	<li>轻轻拧紧毛细管，将毛细管置于电喷雾离子源样品台中，滑动样品台至指定位置，开始采集数据。</li>
	<li>施加低纳流气体压力（0.00–0.05 Bar），直至毛细管尖端形成液滴。随后可逐步降低纳流压力，直至维持稳定喷雾。</li>
	<li>通过调节毛细管在 x、y、z 方向的位置来调整其相对于锥体的位置，并监测离子流以获得稳定的离子电流。施加 0.9–1.6 kV 范围内的毛细管电压。</li>
	<li>设置采样锥电压（50–120 V）、源偏置电压（60.0）、源温度（25 °C) 和锥形气流（0.0 L/h）。这些建议的初始条件可进行调整。</li>
	<li>为获得分辨率良好的质谱图并最大化离子传输效率，需调整质谱参数并监测谱图的变化。这些参数包括调节离子阱中的气体流速（2–8 mL/min）、氦气碰撞池（He Cell）中的气体流速（180 mL/min）以及离子迁移谱（IMS）池中的气体流速（90 mL/min），以在最高离子传输效率下实现最佳分离效果。</li>
	<li>如果电压偏移不足，请调整陷阱碰撞能量。最佳起始范围为10-50 V。 
	注意：提高捕获能量可去除非共价结合的加合物，但需注意避免引起碰撞诱导解离以及蛋白-配体复合物的去折叠。进行离子淌度测量以确认仪器条件是否能使蛋白保持天然折叠状态（步骤3）。</li>
	<li>通过优化捕集阱偏置电压来改善去溶剂化效果。最佳起始范围为 20–45 V。</li>
	<li>优化波速和波高以实现最佳的迁移率分离。详细的解释和操作步骤可在此处找到31对于 HerA-NurA 研究，使用 40 m/s 的波速和 550–650 V 的波高。</li>
	<li>使用仪器的其他所有默认参数。</li>
	<li>每次运行时准备一份无配体样品作为对照用于分析（图1）。对于配体结合实验，需至少进行三次独立测量。</li>
	<li>使用 MassLynx 软件测定生成物的质量，鉴定配体结合情况（如 ATP 和 ADP 结合）以及寡聚状态图2 和 3）。其他可用软件包括 UniDec32，PULSAR33 和多毛纲虫属（Amphitrite）34.</li>
	<li>为量化物种的相对丰度，使用在原始电喷雾电离质谱（ESI-MS）谱图中观察到的相应离子强度（例如配体结合态、不同寡聚体） 等等.）或者，使用 UniDec 和 Massign 等专用软件进行定量分析35 (图1 和 3 ).</li>
</ol>
3. 获取与分析离子迁移率-质谱（IM-MS）
注意：离子淌度质谱（IM-MS）根据离子在气相中的尺寸（质量）、形状和电荷对其进行分离。质荷比（m/z）谱图中每个可分辨的特征均对应一个漂移时间分布。IM-MS测量离子的漂移时间，该时间可用于计算碰撞截面（CCS）。利用漂移管获得的IM-MS数据所测得的漂移时间值可与CCS值呈线性相关36。对于行波离子淌度质谱（TWIMS）测量，计算CCS值需要利用已知CCS值的蛋白质标准品建立校准曲线37。由于紧凑结构与迁移池中缓冲气体的相互作用较少，其迁移速度比扩展或伸长结构更快38。因此，IM-MS可用于检测天然折叠结构在气相中是否得以保持39,40。本节概述了如何使用TWIMS测量IM-MS并计算蛋白质的CCS值。
<ol>
	<li>在优化仪器条件以实现稳定传输后（步骤 2），在保持良好谱图质量的前提下，尽可能降低碰撞能量和采样锥电压。</li>
	<li>使用优化的波速和波高获取离子淌度-质谱（IM-MS）步骤 2).</li>
	<li>使用离子淌度-质谱法（IM-MS）在三种不同波速下测量离子漂移时间例如， 550、600 和 650 m/s）的同时保持相同的波高（例如， 40 V</li>
	<li>为确定蛋白质离子的碰撞截面（CCS），需在与待测蛋白质相同的仪器条件下测量蛋白质校准物。最佳的漂移时间校准需要测量已知CCS的蛋白质。
	<ol>
		<li>选择四种校准物，其中两种的质量高于待研究蛋白质，另外两种的质量低于待研究蛋白质37最重要的是，确保波高和波速与所研究蛋白质的记录值相同。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>手动计算 CCS41 或使用 PULSAR 等专用软件33 和Amphitrite34 (图5).</li>
	<li>为检验气相中蛋白质是否具有类似天然的构象，需将实验测得的碰撞截面（CCS）与基于高分辨率结构获得的理论CCS进行比较。对于HerA-NurA，使用MOBCAL中采用的投影近似（Projection Approximation, PA）方法计算其理论CCS。42其他方法包括轨迹法（TM）42 精确硬球散射（EHS）43.</li>
</ol>
4. 用于天然质谱和离子迁移质谱引导结构测定的溶液内蛋白质复合物解离
注意：在某些情况下，蛋白质亚复合物可从与完整复合物相同的溶液中鉴定出来。然而，通过破坏溶液中的蛋白质相互作用以形成亚复合物，可以获得更进一步的结构信息，例如亚基间的连接性及复合物的组装方式。实现这一目的的方法有多种，例如添加有机溶剂、提高离子强度或调节pH值。为了深入了解HerA-NurA复合物的亚基连接性及复合物组装机制，本研究通过添加可干扰亚基间相互作用的溶剂，在溶液中生成了亚复合物。
<ol>
	<li>按照步骤1所述方法制备蛋白质样品，并将缓冲液置换为乙酸铵。</li>
	<li>以10%为增量，逐步加入10-40%的溶剂。常用的溶剂包括甲醇（MeOH）、二甲基亚砜（DMSO）或乙腈（ACN）。 
	注意：此步骤可在聚丙烯微量离心管中进行。</li>
	<li>将混合物在冰上孵育1小时。</li>
	<li>对每种条件（步骤2和步骤3）采集离子迁移-质谱（IM-MS）谱图（图4）。</li>
	<li>使用SUMMIT软件44对蛋白质亚复合物进行指认并构建蛋白质相互作用网络。或者，手动列出预期物种的理论质量表。</li>
	<li>为确认亚复合物处于折叠状态，需计算各亚复合物的实验碰撞截面（CCS）值，并按照步骤3所述方法与理论CCS值进行比较（表1、图5和图6）。</li>
</ol>
5. 使用碰撞诱导去折叠（CIU）研究蛋白质复合物的稳定性
注意：CIU 可用于探测配体结合后蛋白质及其复合物的结构稳定性。随后可使用专业软件包（如 PULSAR33、Amphitrite34 和 CIU suite9）对目标蛋白质在有无配体存在条件下的气相去折叠过程进行建模。例如，本节概述了监测 HerA-NurA 复合物气相去折叠轨迹、并研究 DNA 和 ATP 结合对该复合物稳定作用的实验流程。
<ol>
	<li>在2-10 V的增幅范围内，逐步将捕集器加速电压从10 V升高至200 V，同时记录离子迁移率-质谱（IM-MS）数据，以实现蛋白质在气相中的逐步去折叠。 
	注意：记录更小的增量会产生更多待处理的数据文件，但该方法可提供分辨率更高的解折叠曲线，这对于分析折叠态与解折叠态物种之间的转变点至关重要。</li>
	<li>使用 PULSAR 分析所获取的数据33，多毛纲蠕虫属名双栉虫属34 或 CIU 套件9 并生成以碰撞截面（CCS）为单位、作为加速电压函数的二维展开图步骤 3）。对于每种电荷态，通过在每个加速电压下叠加强度归一化的碰撞截面（CCS）分布来获得图7 A-Bi).</li>
	<li>使用其中一款软件包生成理论去折叠图谱。数据将被拟合至去折叠模型，从而可量化发生去折叠转变时的碰撞能量，并确定蛋白质在有或无结合配体情况下的稳定性。33去折叠转变是指一个物种根据其实验测得的碰撞截面（CCS）值，从一种状态转变为另一种具有较大CCS的状态。</li>
	<li>为了量化这些转变，可使用 PULSAR 等算法和软件计算状态之间的转变中点。33。这通常以变异系数（CV）表示50即特定状态被耗尽50%时的碰撞（捕获）电压值。</li>
	<li>使用CV50 值，使用质心碰撞能量（KE）计算离子的总内能COM)45. KECOM 由离子解折叠转变过程中可利用的总内能定义，并根据碰撞伙伴（蛋白质离子和中性气体）的动能和质量，按照公式（1）计算得出10 
	KEcom (eV) = <img alt="CV分析的数学公式，CV50×Z×(MN/MN+MIon)，用于科学计算。" src="/files/ftp_upload/57966/57966eq1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="公式 1"> （公式 1） 
	何处 Z 是离子电荷，MN 是中性气体的质量，M离子 是蛋白质离子的质量。 
	注意：这是因为蛋白质的电荷依赖性CIU46,47。建议进行KECOM 分析至多个电荷态（ 图7Aii).</li>
</ol>
6. 整合型质谱中用于差分分子动力学模拟的建模流程
注意：使用来自晶体结构等的蛋白质亚基或复合物模型，可通过差异分子动力学模拟（含配体与不含配体的蛋白质复合物）来确定配体存在对蛋白质结构和动力学的影响。本节详细说明进行差异分子动力学模拟所需建模步骤的工作流程及所需工具。
<ol>
	<li>鉴定构成该复合物的亚基图8A, 在步骤2和步骤3中）。参考现有亚基模型， 例如， 来自 RCSB 数据库（https://www.rcsb.org）的晶体结构。蛋白质的 UniProt 条目将包含已知晶体结构/NMR 结构的列表（http://www.uniprot.org）。如果这些结构不可用，可将理论序列输入 BLAST 以鉴定适用于同源建模的模板（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/）。</li>
	<li>以正确的拓扑结构组装复合物（图8A-ii）。这可以通过多种方法实现。各个亚基可以被拟合到EMDB中提供的电子显微镜图谱中，以组装完整的复合物（https://www.ebi.ac.uk/pdbe/emdb/）。使用分子动力学柔性拟合（MDFF）将PDB结构拟合到电子显微镜图谱的教程可在此处找到：http://www.ks.uiuc.edu/Training/Tutorials/science/mdff/tutorial_mdff-html/。</li>
	<li>鉴定复合物中缺失的区域（图8A-iii）。在PDB序列与理论序列之间进行多序列比对（MSA），以识别可能未被拟合到晶体结构中的残基，或源自晶体学实验的任何突变。可使用如T-Coffee（http://tcoffee.crg.cat/apps/tcoffee/do:regular）等网络服务器进行MSA。</li>
	<li>通过同源建模补全缺失的残基图8A-iv). 可使用 MODELLER 程序（https://salilab.org/modeller/）构建蛋白质复合物中缺失的残基。MODELLER 可输出包含 n 个不同重构构象的模型集合。可通过离散优化蛋白质能量（Discrete Optimised Protein Energy, DOPE）评分来识别优质模型。软件官网提供了详细的使用教程（https://salilab.org/modeller/tutorial/）。</li>
	<li>对蛋白质复合物进行差分分子动力学（MD）模拟图8B以鉴定蛋白质中对特定环境变化产生响应的区域， 例如， 配体存在下的行为变化。在这些模拟中，以仅含蛋白质的模拟A（作为参照）的行为参数为基准，从含蛋白质与配体的模拟B中减去该基准值。通过计算模拟A与模拟B之间的差分均方根涨落（RMSF），可揭示蛋白质在配体依赖性条件下柔性增强或减弱的区域。
	<ol>
		<li>使用 GROMACS（http://www.gromacs.org）进行分子动力学模拟及后续分析。相关教程可访问：http://www.bevanlab.biochem.vt.edu/Pages/Personal/justin/gmx-tutorials/Lysozyme/index.html。为消除模型偏差，应首先构建配体结合复合物的结构，然后从中复制该蛋白结构但去除配体，从而获得与配体结合状态一致的蛋白模型。 </li>
	</ol>
	</li>
</ol>

未声明任何利益冲突。

质谱（MS）在表征蛋白质复合物的化学计量比、相互作用及亚基结构方面正发挥着日益重要的作用。离子迁移率-质谱（IM-MS）数据可用于确定多组分复合物中亚基的空间拓扑排列。与其他现有的结构生物学方法相比，质谱具有多项优势。天然质谱（Native MS）是一种快速且高度敏感的技术，可用于分析异质性蛋白质样品。当与溶液中断实验相结合时，可监测蛋白质组装体的解离途径。结合晶体结构或同源建模，结构质谱所提供的信息为研究蛋白质-配体相互作用提供了有力工具，并可构建接近天然状态的结构模型及组装路径11。
本文描述了使用整合质谱法（integrative MS）分析含有一种或多种配体的蛋白质-配体相互作用的化学计量比和组成的必要实验步骤。该流程包括质谱样品制备、数据采集、数据分析，以及利用计算工具整合质谱数据。为此，我们采用结合了三种配体（DNA、ATP 和 ADP）的DNA解链复合物HerA-NurA异源寡聚蛋白作为模型系统。本方案展示了如何使用当前可用的软件辅助进行数据分析和结果展示。
获得高质量的质谱图对于配体结合分析至关重要，因此，仔细的样品制备步骤十分关键，包括蛋白质纯化、配体滴定和缓冲液置换。在研究配体结合时，纳电喷雾电离（nESI）天然质谱的一个局限性是会发生非特异性结合。非特异性结合在电喷雾过程中液滴去溶剂化阶段发生，这会提高配体浓度，从而改变蛋白质/配体的比例29。核苷酸结合导致的脱辅基蛋白与结合核苷酸的蛋白质之间的质量差异相对较小，因此不会改变电离效率50,51。
我们使用了Synapt G2-Si质谱系统开展本研究，但这些方案同样适用于利用其他市售的纳米电喷雾质谱仪对不同的蛋白质-配体复合物进行研究。整合性结构质谱技术在解决日益复杂的生物学问题中正发挥着越来越重要的作用。本文所述的工作流程与技术特别适用于解析蛋白质复合物及蛋白质-配体形成过程中的结构变化及其构建机制，而这些过程往往难以通过传统的结构生物学方法进行研究。

完整蛋白质及其复合物的原生质谱分析采用电喷雾和纳米电喷雾电离（nESI）技术，这些方法在电离过程中可保持蛋白质的折叠结构及非共价相互作用1,2。在原生质谱（native MS）中，蛋白质及其复合物的结构在气相中以接近天然的状态得以保留3,4。原生质谱可检测到多种带电荷的蛋白质离子，这些离子根据其质荷比（m/z）被分离，从而可计算出蛋白质或蛋白质-配体复合物的质量。该信息可用于确定完整蛋白质的化学计量比、亚基组成、配体结合情况以及相互作用网络3,4,5,6。与其他技术（如X射线晶体学和核磁共振波谱法）相比，原生质谱具有多项优势5。首先，原生质谱是一种快速且高度敏感的技术，仅需数微升（2–3 µL）样品，且样品中复合物的终浓度可低至数个高nM至低µM范围6。其次，原生质谱可用于分析异质性蛋白质样品，从而能够同时检测多种蛋白质及寡聚状态。第三，原生质谱在分析前无需对蛋白质样品进行化学交联或蛋白标记等修饰。这些优势使结构质谱成为研究蛋白质复合物结构的有力工具。
原生质谱可与离子淌度（IM）联用，后者是一种测量蛋白质离子在电场中穿行所需时间的技术，从而能够确定碰撞截面（CCS）。CCS可提供低分辨率的结构信息，有助于获取蛋白质的拓扑结构和构象异质性信息。此外，该方法还可用于检验通过计算方法生成的蛋白质结构模型。
可通过离子迁移谱-质谱法（IM-MS）测量的碰撞诱导去折叠（CIU）来研究蛋白质气相稳定性。在CIU过程中，蛋白质离子在质谱仪内被加速，并通过与惰性缓冲气体发生更频繁的加速碰撞而被活化7,8,9。这种碰撞活化过程会导致蛋白质部分去折叠，表现为碰撞截面（CCS）增大。该CCS变化及使蛋白质去折叠所需的能量可通过IM-MS进行测量。利用此方法，可测定配体结合对蛋白质稳定性的影响10。可通过溶液中断裂方法（例如添加有机溶剂）在溶液中生成亚复合物，以监测蛋白质复合物的类天然拓扑结构。蛋白质复合物的解离主要源于其内部非共价相互作用的破坏。这些亚复合物保持类天然的拓扑结构，在质谱检测时可揭示亚基间的连接信息。
结构生物学中的整合方法结合了多种技术，用于研究蛋白质及其复合物的结构与动态特性3,4,5,6。原生质谱（Native MS）和离子迁移谱-质谱（IM-MS）已被用于揭示具有挑战性的生物系统的分子细节。已有多个应用实例，包括蛋白质组装途径的研究11,12,13,14、蛋白质-蛋白质相互作用网络的分析15,16,17、膜蛋白的研究6,18,19,20,21，以及蛋白质-配体相互作用（如核酸）的研究22,23,24。
然而，原生质谱（native MS）也存在其局限性。原生质谱测量通常在挥发性缓冲液（如乙酸铵水溶液）中进行，而某些蛋白质在此类缓冲液中无法保持其折叠的天然构象3,25。尽管如此，近期研究表明，通过优化喷雾针尖直径（使用0.5 mm针尖），可直接从高离子强度的非挥发性缓冲液中生成蛋白质及蛋白质复合物离子，从而克服这一限制，且此类缓冲液更接近生理环境26。此外，原生质谱利用电喷雾技术将非共价复合物从溶液中电离并转移至气相，因此所检测到的复合物相对丰度可能无法完全反映其在溶液中的真实情况5,27。而且，与溶液环境相比，气相中疏水相互作用减弱，而静电相互作用增强并因此更占优势3,28。
本文提供了利用天然质谱（native MS）、离子迁移质谱（IM-MS）、碰撞诱导解离（CIU）、溶液中断实验及建模方法进行蛋白质鉴定与配体结合研究的实验方案、数据分析与结果解读。以DNA修复复合物HerA-NurA作为模型系统。DNA双链断裂（DSBs）是最具细胞毒性和危害性的DNA损伤形式之一，可导致基因组不稳定，并最终引发人类癌症。同源重组是清除DSBs的主要修复机制，该过程由依赖ATP的解旋酶-核酸酶复合物HerA-NurA所调控22。
结合天然质谱、离子迁移质谱与功能实验及建模分析，可研究以下内容：i）NurA在复合物组装、构象及稳定性中的作用；ii）双链DNA与复合物之间的相互作用及其对复合物整体稳定性的影响；iii）ATP结合的化学计量比及其对复合物组装的影响22。总体而言，本研究通过将蛋白质复合物的构象变化和稳定性与核苷酸结合关联起来，加深了对HerA-NurA复合物分子机制的理解。该方案适用于任何与一种或多种配体类型相互作用的蛋白质复合物。

<table><tbody><tr><td>5&amp;prime;-三磷酸腺苷-3-硫四锂盐</td><td>Merck Millipore</td><td>119120-25MG</td><td></td></tr><tr><td>5&amp;prime;-二磷酸腺苷&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>20398-34-9</td><td></td></tr><tr><td>乙酸铵溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2706</td><td></td></tr><tr><td>微型 Bio-Spin 层析柱</td><td>Bio-Rad</td><td>7326204</td><td></td></tr><tr><td>Vivaspin 浓缩管</td><td>Sartorius</td><td>Z614041-25EA</td><td></td></tr><tr><td>六水合氯化镁</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>246964</td><td></td></tr><tr><td>TraceSelect 级水</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>95305</td><td></td></tr><tr><td>硼硅酸盐毛细管</td><td>Harvard Apparatus</td><td>300060</td><td></td></tr></tbody></table>

通过整合结构质谱法分析蛋白质结构与蛋白质-配体复合物

Analyzing Protein Architectures and Protein-Ligand Complexes by Integrative Structural Mass Spectrometry

蛋白质是一类重要的生物大分子，在细胞功能中发挥多种关键作用，包括基因表达、催化代谢反应、DNA修复与复制等。因此，深入理解这些过程可为细胞功能机制提供关键信息。整合性结构质谱（MS）方法能够提供有关蛋白质复合物组装、复合物连接性、亚基化学计量比、蛋白质寡聚化以及配体结合等方面的结构与动态信息。近年来，整合性结构质谱技术的进步使得对具有挑战性的生物体系（如大型DNA结合蛋白和膜蛋白）的表征成为可能。本实验方案描述了如何将多种质谱数据（如天然质谱和离子淌度-质谱联用技术，IM-MS）与分子动力学模拟相结合，以深入研究一种解旋酶-核酸酶DNA修复蛋白复合物。该整合方法为深入研究其他参与重要生物学过程的蛋白质复合物的配体结合提供了可行的分析框架。

天然质谱结果揭示了HerA-NurA复合物的寡聚状态、组成及拓扑结构（图1）。由于非共价相互作用在气相中得以保留，对ATP-γ-S和ADP滴定实验进行的天然质谱分析确定了核苷酸与HerA-NurA的成对结合情况（图2），并表明提高ATP-γ-S浓度会增加六聚体HerA的相对强度（图3）。通过溶液中断裂实验结合天然质谱获得了有关亚基相互作用的结构信息，结果与理论质量相符（图4 和表1）。
蛋白质及其复合物的实验碰撞截面（CCS）值源自离子迁移谱-质谱（IM-MS）实验（图5）。这些值是对分子形状的旋转平均气相横截面积的计算结果，用于描述蛋白质的构型状态。将CCS值与X射线晶体学获得的理论测量值进行比较，若两者吻合良好，则表明蛋白质的天然构象在气相中得以保留（表1）。这验证了利用CCS值构建蛋白质组装体低分辨率模型的可行性48。
可针对每种电荷态离子计算实验碰撞截面（CCS）。具有天然构象的蛋白质构象体可能产生具有相似CCS值的电荷态离子。然而，较高电荷态离子的库仑排斥作用增强，可能导致蛋白质在气相中发生去折叠，从而使其CCS值大于理论CCS值。因此，通常采用最低电荷态离子的CCS值49。对于HerA-NurA复合物，溶液中的解离实验（针对HerA以及有或无DNA存在下的HerA-NurA）提示其组装路径始于单体，随后逐步形成完整的六聚体HerA（HerA6）与二聚体NurA（NurA2）在DNA存在下的复合物（图6）。
apo（无配体）状态与配体结合状态之间CIU解折叠曲线的差异定义了配体结合后复合物稳定性的变化。较高的CV50 或KECOM值表明气相中离子的稳定性更高。CIU和KECOM分析显示，结合DNA的HerA-NurA复合物比无DNA的复合物更稳定（图7Aii）。在各自ATP结合状态下的CIU-MS分析表明，结合四个ATP-γ-S的状态导致复合物在气相中的稳定性降低，而所有结合位点均被占据的六分子ATP-γ-S结合状态则最为稳定（图7Bii）。_native MS_可以揭示HerA的离散核苷酸结合状态；然而，它无法区分是哪些HerA亚基结合了ATP以及结合发生的具体位置。这些信息可通过针对六聚体HerA及HerA-NurA复合物进行的显式溶剂分子动力学（MD）模拟获得，模拟流程遵循所总结的工作流程（图8）。
<img alt="DNA-蛋白质复合物形成的质谱图，含m/z谱图；相对强度柱状图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57966/57966fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图1"> 
图1. HerA-NurA非共价复合物的寡聚状态、组成及拓扑结构分析。(A) HerA、HerA-NurA以及HerA-NurA在存在DNA（15.4 kDa，25 bp双链DNA）条件下的质谱图。HerA亚复合物以六聚体和七聚体形式存在。NurA二聚体结合至HerA六聚体，诱导其发生寡聚态转换。DNA结合于形成的HerA-NurA复合物（结果改编自Z. Ahdash et al., 201722）。(B) 使用UniDec32计算鉴定出的各物种的相对强度。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57966/57966fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="质谱分析；HerA-NurA复合物；ATP、ADP影响；谱图；蛋白质研究。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57966/57966fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图2"> 
图2. 天然电喷雾电离质谱（Native ESI-MS）揭示了核苷酸与HerA-NurA结合的机制。质谱图：（A）HerA-NurA，以及（B）HerA-NurA-DNA，在逐渐增加的（i）ATP-γ-S和（ii）ADP浓度下的质谱结果。通过将实测质量与理论质量进行比较，确定结合的ATP-γ-S或ADP的数量。质谱图上标出了实测质量及结合的核苷酸数目。ATP-γ-S和ADP滴定实验确定了HerA-NurA单独存在以及与DNA形成复合物时核苷酸的依次结合情况，表明存在一种循环反应机制（结果改编自Z. Ahdash et al., 201722）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57966/57966fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="质谱分析图；ATP结合，强度与m/z关系，相对蛋白质相互作用水平。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57966/57966fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图3"> 
图3. 测定ATP-γ-S浓度增加对HerA寡聚状态的影响。（A）在ATP-γ-S浓度递增条件下HerA的质谱图。（B）利用UniDec去卷积软件计算得到的不同物种相对强度图谱32。随着ATP-γ-S浓度的增加，六聚体HerA的相对强度也随之增加。质谱图中标注了结合的ATP-γ-S分子数量（结果改编自Z. Ahdash et al., 201722）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57966/57966fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="质谱分析；HerA、NurA 与双链 DNA 在乙腈、甲醇溶液中的复合物。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57966/57966fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 4"> 
图 4。溶液中断裂后，(A) HerA 和 (B) HerA-NurA (i) 单独存在以及 (ii) 存在 DNA 时的质谱图及亚复合物解离产物。溶液中断裂实验使用 10–40% 的乙腈、甲醇（MeOH）或二甲基亚砜（DMSO）进行，结果形成了多种亚复合物。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57966/57966fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="蛋白质-DNA复合物分析；质谱CCS图谱；亚复合物及完整复合物谱图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57966/57966fig5.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图5"> 
图5. 在碰撞截面（CCS）轴上显示的复合物及其衍生亚复合物的离子淌度到达时间分布。各亚复合物的图标与图4谱图中标注的图标相对应。亚复合物的实验值与计算得到的质量及CCS值列于表1，所有数据均显示实验值与计算值之间具有良好一致性（在考虑行波离子淌度质谱分辨率的典型不确定性为±5-8%的情况下37）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57966/57966fig5large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="HerA-NurA 双链 DNA 相互作用示意图，展示多聚体形成过程及蛋白质复合物。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57966/57966fig6.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 6"> 
图6. 基于溶液中断裂的原生质谱和离子迁移质谱（IM-MS）推导出的 HerA-NurA 复合物组装途径。不同颜色的圆圈表示各亚复合物被检测到的条件：原生状态（绿色，断裂前）、甲醇处理（黄色）、DMSO 处理（紫色）或乙腈处理（红色）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57966/57966fig6large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="ATP/dsDNA存在下HerA6-NurA2复合物的质谱分析，显示碰撞截面（CCS）与电压关系图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57966/57966fig7.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图7"> 
图7. 研究（A）DNA对HerA-NurA的稳定作用以及（B）ATP结合HerA-NurA-DNA的稳定效应。（i）气相CIU-MS图谱和（ii）质心碰撞能量（KEcom）计算表明，dsDNA的存在可稳定HerA-NurA复合物，且结合六个ATP-γ-S的状态最为稳定。图中显示了不同电荷态的稳定化情况。图谱使用PULSAR33生成。（A）部分结果改编自Z. Ahdash et al., 201722。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57966/57966fig7large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="显示RMSF和差异分析的蛋白质复合物组装与分子动力学模拟示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57966/57966fig8.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图8"> 
图8. 差异分子动力学模拟建模流程。(A) 通过从现有亚基构建拓扑结构并重建缺失的残基，生成待研究的复合物。(B) 对蛋白质复合物在有配体和无配体条件下进行分子动力学模拟的流程。首先对仅含蛋白质的体系运行分子动力学模拟，作为参考体系，并将其从蛋白质与配体复合体系的模拟结果中扣除。随后计算两个模拟之间的差异均方根涨落（RMSF），以确定配体结合的影响。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57966/57966fig8large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<table fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>复合物 / 亚复合物</td>
			<td>理论质量 (kDa)</td>
			<td>实验质量 (kDa)</td>
			<td>理论碰撞截面积 (Å²)</td>
			<td>实验碰撞截面积 (Å²) [电荷]</td>
			<td>条件 HN</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HerA6-NurA2</td>
			<td>416.22</td>
			<td>417.85</td>
			<td>14531</td>
			<td>14577 [42+] 
			14599 [43+] 
			14608 [44+] 
			14637 [45+]</td>
			<td>10-20% ACN, 10-40% DMSO, 10% MeOH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HerA6-NurA2-dsDNA</td>
			<td>431.72</td>
			<td>432.27</td>
			<td>-</td>
			<td>14661 [39+] 
			14728 [40+] 
			14781 [41+] 
			14837 [42+]</td>
			<td>10% ACN, 10% MeOH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NurA1</td>
			<td>39.12</td>
			<td>38.18</td>
			<td>3254</td>
			<td>2618 [10+] 
			2746 [11+] 
			2878 [12+]</td>
			<td>10-40% ACN, 10% MeOH, 20-40% DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NurA2</td>
			<td>78.24</td>
			<td>78.36</td>
			<td>4890</td>
			<td>4903 [16+] 
			4614 [17+] 
			4537 [18+] 
			4666 [19+]</td>
			<td>10-40% MeOH, 20-40% DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HerA1</td>
			<td>56.33</td>
			<td>56.32</td>
			<td>4131</td>
			<td>3647 [14+] 
			3792 [15+] 
			3950 [16+]</td>
			<td>10-40% ACN, 40% DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HerA2</td>
			<td>112.66</td>
			<td>112.95</td>
			<td>6475</td>
			<td>5648 [20+] 
			5747 [21+] 
			5842 [22+] 
			5996 [23+]</td>
			<td>40% Meth, 10-40% ACN</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HerA3</td>
			<td>168.99</td>
			<td>169.39</td>
			<td>8607</td>
			<td>7501 [25+] 
			7616 [26+] 
			7717 [27+] 
			7867 [28+]</td>
			<td>10-40% MeOH, 10-40% CAN, 40% DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HerA3 + DNA</td>
			<td>183.99</td>
			<td>184.976</td>
			<td>-</td>
			<td>7655 [26+] 
			7990 [27+] 
			8107 [28+]</td>
			<td>10-30% ACN</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HerA4</td>
			<td>225.32</td>
			<td>226.2</td>
			<td>10477</td>
			<td>9205 [30+] 
			9287 [31] 
			9493 [32+] 
			9961 [33+]</td>
			<td>10-40% MeOH, 10-40% ACN</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HerA4 +DNA</td>
			<td>240.82</td>
			<td>241.33</td>
			<td>-</td>
			<td>9637 [31+] 
			9756 [32+] 
			9830 [33+]</td>
			<td>10-30% ACN</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HerA5</td>
			<td>281.65</td>
			<td>282.75</td>
			<td>11853</td>
			<td>10847 [36+] 
			10958 [37+] 
			11161 [38+]</td>
			<td>30-40% ACN</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HerA6</td>
			<td>337.98</td>
			<td>339.3</td>
			<td>12517</td>
			<td>12335 [38+] 
			12386 [39+] 
			12498 [40+] 
			12590 [41+] 
			12676 [42+] 
			13019 [43+]</td>
			<td>10-40% MeOH, 10-40% ACN</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HerA6 +DNA</td>
			<td>353.48</td>
			<td>354.626</td>
			<td>-</td>
			<td>12890 [40+] 
			13081 [41+] 
			13184 [42+] 
			13273 [43+] 
			13463 [44+] 
			13576 [45+]</td>
			<td>30% ACN</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HerA7</td>
			<td>394.3</td>
			<td>395.85</td>
			<td>13901</td>
			<td>14154 [42+] 
			14219 [43+] 
			14261 [44+] 
			14285 [45+] 
			14335 [46+]</td>
			<td>10-40% MeOH, 10-40% ACN, 10-40% DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HerA7 +DNA</td>
			<td>409.8</td>
			<td>410.62</td>
			<td>-</td>
			<td>14414 [41+] 
			14510 [42+] 
			14558 [43+] 
			14598 [44+] 
			14630 [45+] 
			14641 [46+]</td>
			<td>10% ACN</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1. 通过溶液中断实验生成的HerA-NurA及其亚复合物的实验与计算质量及碰撞截面（CCS）值。

质谱法（MS）已成为研究大分子组装体结构与动态的重要工具。本文整合了基于质谱的方法，用于探究蛋白质复合物的形成及配体结合。

蛋白质是一类重要的生物大分子，在细胞功能中发挥多种关键作用，包括基因表达、催化……

如今，质谱技术在结构生物学中发挥着重要作用。该方法有助于回答有关重要生物大分子（尤其是蛋白质和蛋白质复合物）在天然状态下的关键问题。天然质谱技术可广泛应用于多种生物分子组装体，包括多蛋白体系和核酸体系。该技术的主要优势在于其快速且高度灵敏。它可用于分析成分复杂的蛋白质样品，并能够同时检测处于寡聚状态的多种蛋白质。演示该实验操作的是我课题组的博士研究生Andy Lau。开始此操作前，按照文本方案中所述制备实验室自制的纳米电喷雾毛细管。每次运行均需制备一份无配体样品作为对照，并将其缓冲液置换为乙酸铵。接下来，选择灵敏度模式、正离子采集模式以及迁移率飞行时间（mobility TOF）模式。接下来打开捕集阱、API 和 IMS 气体。进行离子迁移率分离时，使用此处所示的氮气和氩气起始参数，并根据需要进行调整。设置合适的质荷比（m/z）采集范围。对于未知蛋白质，初始优化步骤应使用较宽的范围。将镀金毛细管插入毛细管支架中，然后向毛细管内加载 2 至 3 微升目标蛋白质复合物溶液。轻轻拧紧毛细管，并将其放置在电喷雾离子源的样品台上。将样品台推至指定位置以开始采集数据。施加较低的纳流气体压力，直至毛细管尖端形成液滴。移动毛细管相对于锥体的位置，并监测离子流以获得稳定的离子流。施加0.9至1.6千伏范围内的毛细管电压。然后根据文本方案设置采样锥电压、源偏置电压、源温度和锥孔气体流速。为了获得分辨率良好的质谱图并最大化离子传输效率，需调整质谱参数并监测谱图的变化。将离子阱碰撞能量设定在10至50伏之间的初始值。如果电压偏移不足，则调整离子阱碰撞能量。通过调节电压将捕集器设定在20至45伏特之间的初始起始点。通过优化该电压以改善去溶剂化效果。随后，按照文中所述优化波速和波高，以实现最佳的迁移率分离。对于涉及 HerA 和 NurA 的研究，使用 40 米/秒的波速，波高在 550 至 650 伏特之间。进行 DNA 结合分析时，将蛋白质与 DNA 按能够形成蛋白质-DNA 复合物的摩尔比例混合。逐步增加以下任一种物质的用量：5'O-3-硫代三磷酸四锂盐或 ADP。使用适当的软件测量所生成物种的质量，并鉴定配体结合情况，例如 ATP 和 ADP 的结合以及寡聚状态。然后利用原始 ESI-MS 谱图中观察到的离子强度来定量各物种的相对丰度。在优化仪器条件以实现稳定传输后，将碰撞能量和采样锥电压降至尽可能低，同时仍保持良好的谱图质量。使用先前确定的优化波速和波高获取离子淌度质谱（IM MS）数据。在保持相同波高的情况下，以三种不同的波速测量离子漂移时间。为测定蛋白质离子的碰撞截面（CCS），需使用相同的仪器条件，检测四种蛋白质校准物，其中两种的质量高于待测蛋白质，另两种的质量低于待测蛋白质。首先，按照文本方案中的说明制备蛋白质样品，并将其缓冲液置换为乙酸铵。以10%的增量加入溶剂，直至达到所需体积。冰上孵育一小时。之后，对每个样品采集离子迁移率-质谱（IM-MS）谱图。使用 SUMMIT 软件分配蛋白质亚复合物并生成蛋白质相互作用网络。或者，手动列出预期物种的理论质谱质量。为开始研究蛋白质复合物的稳定性，逐步将捕获加速电压从 10 伏特升高至 200 伏特，同时记录离子迁移率-质谱（IM-MS）数据，这将逐步诱导蛋白质在气相中解折叠。使用适当的软件分析数据，并通过叠加每个电荷态在不同加速电压下的强度归一化碰撞截面（CCS）分布，生成二维去折叠图。原生质谱（native MS）结果揭示了HerA与NurA复合物的寡聚状态、组成及拓扑结构。由于非共价相互作用在气相中得以保留，因此采用ATPγS与ADP滴定实验的原生质谱方法，用于确定HerA与NurA中核苷酸的成对结合情况。HerA 寡聚状态的质谱结果显示，随着 ATPγS 浓度的增加，六聚体 HerA 的相对强度也随之增强。通过离子迁移质谱（IM-MS）实验可获得蛋白质及其复合物的实验碰撞截面（CCS）值。这些实验值与来自 X 射线晶体学的理论测量值具有良好一致性，从而验证了利用 CCS 值构建蛋白质组装低分辨率模型的可行性。CIU 和 KEcom 分析表明，结合 DNA 的 HerA-NurA 比无 DNA 的复合物更稳定。CIU MS 分析及其相应的 ATP 结合状态显示，在气相中，结合四个 ATPγS 的状态会降低复合物的稳定性。然而，当所有结合位点均被占据、形成结合六个 ATPγS 的状态时，该复合物表现出最高的稳定性。对完整复合物的分子质量进行精确测量，可为生物大分子的表征提供重要信息。我们能够获得有关复合物组装途径、蛋白质寡聚化以及配体结合的信息。综合这些信息，可构建功能生物复合物的详细模型。

analyzing-protein-architectures-protein-ligand-complexes-integrative

Research

科研

JoVE Journal

Chemistry

化学

综合结构质谱分析蛋白质结构和蛋白质配体配合物

质谱技术已被证明是分析大型蛋白质复合物的有力工具。该方法能够揭示多亚基复合物的组成、化学计量比和整体结构。本文将逐步介绍如何进行结构质谱分析，并表征大分子结构。...

通过结构质谱分析大型蛋白质复合物

离子淌度-质谱法是一种新兴的气相技术，可根据离子的碰撞截面和质量对其进行分离。该方法可提供蛋白质复合物整体拓扑结构和形状的三维信息。本文概述了仪器设置与优化、漂移时间校准以及数据分析的基本操作流程。...

T波离子淌度-质谱分析：蛋白质复合物分析的基本实验流程

精确质量测定是蛋白质研究过程中的重要步骤。基质辅助激光解吸/电离（MALDI）质谱（MS）可用于此类测定，其主要优势在于对盐类、去污剂和污染物具有良好的耐受性。本文展示了一种利用MALDI-MS分析分子量大于100...

基质辅助激光解吸/电离飞行时间（MALDI-TOF）质谱法分析完整蛋白质（分子量大于100 kDa）

本文介绍了针对固态粉末中蛋白质的固态酰胺氢/氘交换质谱法（ssHDX-MS）和固态光解标记质谱法（ssPL-MS）的详细实验方案。这些方法可提供非晶态固态中蛋白质构象及其相互作用的高分辨率信息，可能对制剂设计具有重要意义。...

质谱技术在冻干粉末中研究蛋白质结构与相互作用的应用

本文介绍了蛋白质复合物的亲和纯化及其通过蓝色天然PAGE分离的实验方案，随后采用无标记定量质谱技术进行蛋白质相关性分析。该方法有助于将相互作用组解析为不同的蛋白质复合物。...

通过蓝色天然PAGE和蛋白质相关性分析解析亲和纯化蛋白质复合物

蛋白质复合物的结构对其功能至关重要。结合多种质谱技术已被证明是研究其组装过程的有力手段。本文提供了化学交联和天然质谱的技术方案，并展示了这两种互补技术如何帮助阐明多亚基蛋白质复合物的结构架构。...

结合完整蛋白质复合物的化学交联与质谱技术研究多亚基蛋白组装体的结构

本文介绍了一种利用生物膜干涉技术（BLI）监测炭疽毒素组装与解聚过程的实验方案。在生物传感器表面完成毒素复合物的组装与解聚后，将大分子蛋白复合物从传感器表面释放，进而通过电子显微镜和质谱技术分别对其进行可视化观察及组分鉴定。...

利用质谱和电子显微镜分析在生物层干涉技术生物传感器上组装并释放的动态蛋白质复合物

靶向交联质谱技术利用最多三种不同采集方法获得的质谱数据，构建蛋白质四级结构模型。当在 Cheetah-MS 网络服务器上以简化工作流程执行时，结果将以 Jupyter Notebook 形式呈现。本文演示了如何扩展 Jupyter Notebook...

通过化学交联质谱法进行四级结构建模：扩展 TX-MS Jupyter 报告

本文描述了一种蛋白质组学工作流程，用于从细胞核亚细胞组分中鉴定特定目标蛋白的相互作用蛋白伙伴。该流程采用免疫亲和富集结合无标记质谱分析技术，包括亚细胞分级分离、免疫沉淀、滤膜辅助样品制备、离线纯化、质谱分析以及后续的生物信息学分析流程。...

无需标记的免疫沉淀质谱工作流程用于大规模核相互作用组分析

本文描述了基于焦碳酸二乙酯的共价标记实验步骤，并结合质谱检测方法。焦碳酸二乙酯可直接与目标蛋白质或蛋白质复合物混合，从而修饰溶剂可及的氨基酸残基。经过蛋白酶消化及液相色谱-质谱分析后，即可鉴定出被修饰的残基。...

通过质谱法研究蛋白质高级结构的二乙基焦碳酸酯共价标记

学习使用原生质谱技术解析蛋白质复合物结构与配体相互作用的方法。该技术可快速灵敏地分析寡聚状态，为结构生物学研究提供关键数据。

通过整合结构质谱法分析蛋白质结构与蛋白质-配体复合物

探索更多视频