乳酸脱氢酶螯合测定--一种简便、可靠的测定哺乳动物细胞中自噬性螯合活性的方法

这种方法可以帮助回答自噬领域中的关键问题，例如如何调节自噬体的形成以及各种细胞处理和条件如何影响大量自噬。该技术的主要优点是它可以测量内源性货物封存。因此，该方法具有广泛的适用性，并且独立于人工过表达或引入货物探针。

演示该程序的是我实验室的博士生 Paula Szalai 和 Morten Luhr。首先，在 75 平方厘米的组织培养瓶中，在 37 摄氏度下加入 5% 二氧化碳的加湿培养箱中培养贴壁细胞。让细胞生长，直到它们到达接近汇合的细胞层。

在此之后，在 37 摄氏度、pH 7.4 下用 3 毫升 PBS 洗涤细胞。去除 PBS 并用 3 毫升 0.25% 胰蛋白酶 EDTA 替换。在 37 摄氏度下加入 5% 二氧化碳的加湿培养箱中孵育，直至细胞分离。

接下来，将细胞重悬于含有 10% FBS 的 7 mL 培养基中，并转移至无菌 50 mL 试管中。使用 0.5 至 20 μL 移液器吸头，将 10 μL 细胞悬液转移到含有 10 μL 台盼蓝的微量离心管中。使用相同的移液器吸头立即填充计数室载玻片，并在自动细胞计数仪中对细胞进行计数。

然后使用含有 10% FBS 的培养基制备适当稀释的细胞悬液。使用无菌技术，将 1 毫升稀释细胞悬液接种到 12 孔组织培养板的每个孔中。在 37 摄氏度下加入 5% 二氧化碳的加湿培养箱中孵育，直至达到所需的细胞密度。

在所需的实验处理中，留下一组未处理的井，以确定可沉淀 LDH 的背景水平。收获前 3 到 4 小时，向每个孔中加入饱和量的螯合后抑制剂巴弗洛霉素 A1。在 37 摄氏度的加湿培养箱中加入 5% 二氧化碳孵育。

在处理期结束时，您抽吸以吸出培养基。向每个孔中加入 200 微升预热至 37 摄氏度的细胞分离溶液。在 37 摄氏度下孵育，直到细胞分离。

向每个孔中加入 500 微升 pH 值为 7.4 且含有 2% BSA 的室温 PBS。使用移液管重悬每个孔，直到看不到细胞团块。在此之后，立即将每个孔中的细胞悬液转移到单独的 1.5 mL 微量离心管中，并置于冰上。

试管以 400 倍 g 和 4 摄氏度离心 5 分钟，以沉淀细胞。使用抽吸功能彻底吸出上清液，使细胞沉淀尽可能干燥。然后，向每个试管中加入 400 微升含有 10% 蔗糖的超纯水溶液。

使用移液管，重悬细胞沉淀以获得接近单细胞的悬液。将此悬浮液转移到 4 mm 电穿孔比色皿中。将比色皿放入指数衰减波电穿孔仪中，并以 800 伏、25 微法和 400 欧姆的电压放电单个电脉冲。

使用新的移液器吸头将细胞破坏物转移到含有 400 μL 冰冷磷酸盐缓冲蔗糖溶液的 1.5 mL 微量离心管中，并通过移液短暂混合。对每个样品重复此重悬、电破碎和混合过程。如果是第一次执行该程序，请确保验证有效和选择性的质膜电破坏，如文中所述。

为了获得沉淀的 LDH 级分，从每种稀释的细胞破坏液中取出 550 微升，并将其转移到其自己的两毫升微量离心管中，该离心管含有 900 微升冰冷的重悬缓冲液，含 0.5% BSA 和 0.01%Tween 20。短暂移液以混合。在 18， 000 倍 g 和 4 摄氏度下离心 45 分钟，以产生含有沉淀 LDH 的颗粒。

使用抽吸，彻底吸出上清液，使沉淀尽可能干燥。将沉淀的 LDH 样品储存在零下 80 摄氏度，直到准备好进行分析。对于总 LDH 组分，从每个稀释的细胞破碎液溶液中转移 150 μL 到其自己的新试管中。

将这些储存在零下 80 摄氏度的冰箱中，直到准备好进行分析。在冰上解冻沉淀的 LDH 和总 LDH 样品。解冻后，向总 LDH 样品中加入 300 微升含有 1.5% Triton X-405 的冰冷重悬缓冲液。

冷藏室中将样品放在滚筒上旋转 30 分钟。接下来，向沉淀的 LDH 样品中加入 750 微升含有 1% Triton X-405 的冰冷重悬缓冲液。使用移液管重悬沉淀，直到溶液均匀。

样品在 18， 000 倍 g 和 4 摄氏度下离心 5 分钟，以沉淀未溶解的细胞碎片。离心完成后，将样品放在冰上。使用文中描述的经典酶法测定或各种市售试剂盒中的任何一种来确定上清液中 LDH 的水平。

在这项研究中，在许多不同的哺乳动物细胞系中监测了大量自噬隔离活性。如此处所示，基础和饥饿诱导的 LDH 隔离和 LNCaP 细胞都被 pan-PI3 激酶抑制剂 3MA 完全消除。选择性 PI3 激酶 III 类抑制剂 SAR-405 和 ER 钙泵抑制剂 Thapsigargin。

在 HEK293 细胞中，Thapsigargin 和 ULK 抑制剂 MRT 67307 都会强烈降低饥饿条件下的 LDH 隔离。此外，在其他观察到的细胞系中，饥饿诱导的 LDH 隔离被 3MA 持续抑制。接下来，使用各种 ATG 基因敲除 MEF 来测试 LDH 隔离是否需要据报道对自噬体形成至关重要的自噬相关基因。

可以看出，饥饿诱导的 LDH 隔离在 ATG5 敲除 MEFS 中被消除。此外，它在 ATG7 和 ATG9A 敲除 MEF 中也被减弱。最后，确定了 RNAi 介导的关键 ATG 基因转录本沉默的影响。

使用 ATG9A 靶向 siRNA 或联合靶向 ULK1 和 ULK2 转染可显著降低 LNCaP 细胞中 LDH 的隔离。在尝试此程序时，请务必准确完成所有移液步骤。按照此程序，可以执行其他方法，如长寿命蛋白质降解测定，以回答其他问题，例如是否观察到隔离活性的变化导致自噬降解活性的类似变化。

在哺乳动物细胞系中建立这种方法后，我们用它来证明大量自噬独立于 LC3 蛋白家族，而是需要 GABARAP。这突出了采用 LC3 非依赖性方法来监测自噬活性的重要性。