Name: 萝卜品种多糖的 PNGase 研究 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 26 s
Description: 了解萝卜N-聚糖快速分析方法，使用PNGase H+酶解和2-氨基苯甲酰胺衍生化技术，无需更换缓冲液即可高效完成植物糖组学研究。该方法适用于Raphanus sativus品种多糖的UPLC和MALDI-TOF质谱分析。

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本工作部分得到了中国国家自然科学基金（资助号 31471703、A0201300537 和 31671854，授予 J.V. 和 L.L.；资助号 31470435，授予 G.Y.）以及外国人才千人计划（资助号 JSB2014012，授予 J.V.）的支持。

1. 样品采集
<ol>
	<li>购买不同品种的新鲜萝卜（Raphanus sativus L.）。</li>
</ol>
2. 萝卜中蛋白质的提取
<ol>
	<li>取约100 g新鲜萝卜，使用厨房搅拌机匀浆10分钟。</li>
	<li>将匀浆液转移至50 mL离心管中，在4 °C条件下以14,000 × g离心20分钟，去除不溶性物质。</li>
	<li>小心将上清液转移至新的50 mL离心管中，并加入等体积的2 M三氯乙酸（TCA）溶液。 
	注意：加入TCA会使可溶性（糖基化）蛋白质沉淀。</li>
	<li>在4 °C条件下以14,000 × g离心30分钟，弃去上清液，保留沉淀的（糖基化）蛋白质。</li>
	<li>用20 mL去离子水洗涤沉淀，在4 °C条件下以14,000 × g离心5分钟，以去除可溶性低聚糖和多糖。</li>
	<li>重复步骤2.5四次。</li>
	<li>将沉淀重悬于1 mL去离子水中，转移至新的1.5 mL离心管中。</li>
</ol>
3. N-糖链的制备
<ol>
	<li>将步骤 2.7 中的 50 µL 蛋白质溶液（相当于 5 g 新鲜萝卜）与 0.2 mU 重组 PNGase H+ 在 10 mM 乙酸中混合。</li>
	<li>将反应混合物在 37 °C 下孵育 12 小时。孵育结束后，在 14,000 × g 下离心 5 分钟，以去除多余的蛋白质和酶。</li>
	<li>将上清液转移至新的 1.5 mL 离心管中。</li>
</ol>
4. N-糖链的纯化
<ol>
	<li>准备固相萃取（SPE）柱，以富集 N-糖链并从反应混合物中去除盐类及其他杂质，从而提高荧光标记试剂2-氨基苯甲酰胺（2-AB）对 N-糖链衍生化的选择性。
	<ol>
		<li>加入 3 mL 去离子水洗涤柱子。</li>
		<li>加入 3 mL 含三氟乙酸（TFA，0.1% v/v）的 80% 乙腈溶液活化 SPE 柱。</li>
		<li>加入 3 mL 去离子水平衡 SPE 柱。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将步骤 3.3 中的样品转移至柱子上，弃去穿流液。</li>
	<li>加入 1.5 mL 去离子水洗涤柱子，并弃去穿流液。</li>
	<li>用 1.5 mL 含 0.1% TFA（v/v）的 20% 乙腈水溶液洗脱柱子上释放的 N-糖链，收集至 2 mL 离心管中。</li>
	<li>在室温下通过离心蒸发去除溶剂，蒸发至样品完全干燥。</li>
</ol>
5. N-糖链的荧光衍生化
<ol>
	<li>配制1 mL的2-AB溶液，该溶液由35 mM 2-AB和0.1 M氰基硼氢化钠溶于二甲基亚砜/乙酸溶液（体积比7:3）中组成。</li>
	<li>向来自六种不同萝卜的干燥样品（步骤4.5）中各加入5 µL 2-AB溶液。涡旋振荡每个样品，直至完全溶解。</li>
	<li>将混合物在65 °C下孵育2小时。</li>
	<li>让样品在室温下冷却5分钟，然后加入5 µL去离子水和40 µL乙腈。在14,000 × g下离心3分钟。</li>
	<li>从上清液中转移48 µL至300 µL高回收率HPLC小瓶中。将衍生化的N-糖链样品在-20 °C下保存，最长可保存一个月。</li>
</ol>
6. HILIC-UPLC 分析 N-糖链
<ol>
	<li>使用标准超高效液相色谱（UPLC）系统连接在线荧光检测器，分别在激发/发射波长330 nm/420 nm条件下分析样品。</li>
	<li>采用亲水相互作用液相色谱（HILIC）-UPLC糖链分析柱，柱温设置为60 °C进行分析。</li>
	<li>通过将50 mL储备液（1 M甲酸铵溶液，pH 4.5）用950 mL液相色谱-质谱（LCMS）级水稀释来配制溶剂A。储备液的配制步骤如下：
	<ol>
		<li>向700 mL LCMS级H2O中加入43 mL甲酸。</li>
		<li>逐滴加入25%（w/w）氨水溶液，调节pH至4.5。</li>
		<li>将溶剂转移至量筒中，并用LCMS级H2O定容至1000 mL。储存于4–6 °C，可保存最多3个月。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用LCMS级乙腈作为溶剂B。</li>
	<li>采用以下梯度洗脱程序分离N-糖链：
	<ol>
		<li>起始时将95%的溶剂B加入溶剂A中。在0至44.5 min期间，流速设定为0.5 mL/min。</li>
		<li>从0 min到6 min，通过线性梯度将溶剂B的比例逐步降低至78%。</li>
		<li>从6 min到44.5 min，通过线性梯度将溶剂B的比例进一步逐步降低至55.9%。</li>
		<li>从44.5 min到46.5 min，通过线性梯度迅速将溶剂B的比例从55.9%降至0%，并在0%保持2 min，同时开始对色谱柱进行清洗。从44.5 min到55 min期间，将流速降低至0.25 mL/min。</li>
		<li>从48.5 min到50.5 min，将溶剂B比例升至95%，继续清洗色谱柱，并在95%条件下保持4.5 min。</li>
		<li>从50.5 min到57 min，以0.5 mL/min的流速使色谱柱重新平衡至初始条件（95%溶剂B）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将45 µL样品注入UPLC系统。</li>
	<li>通过UPLC分离N-糖链，其保留时间范围为15至40 min。</li>
	<li>使用2 mL离心管收集每个观察到的UPLC峰馏分，并通过离心蒸发干燥样品。</li>
	<li>注入约1 pmol的2-AB标记葡聚糖标准品（含2–20个葡萄糖单元），用于校准植物N-糖链谱型分析，并将其洗脱时间转换为标准化的葡萄糖单元数值。</li>
</ol>
7. MALDI-TOF MS 分析
<ol>
	<li>将步骤6.8的样品溶解于5 µL液相色谱-质谱（LCMS）级水中。取1 µL样品溶液与1 µL 6-aza-2-thiothymine（ATT）溶液（0.3% w/v，溶于70% v/v乙腈水溶液）混合，用移液器将混合液点样至MALDI-TOF样品靶板上。</li>
	<li>在正离子模式下，通过按下开始按钮，使用MALDI-TOF质谱仪分析样品。</li>
	<li>使用配套的MALDI-TOF-MS分析软件对质谱图进行分析。</li>
	<li>利用开源聚糖结构解析软件19解读质谱图。设置搜索参数为2-AB标记、[M+Na]+，并将质量精度参数设为2.0 Da。</li>
</ol>

<ol><li>Altmann, F. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17033195">The Role of Protein Glycosylation in Allergy.</a> International Archives of Allergy and Immunology. 142 (2), 99-115 (2007).</li>
<li>Van Ree, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%CE%B2+%281%2C+2%29-xylose+and+%CE%B1+%281%2C+3%29-fucose+residues+have+a+strong+contribution+in+IgE+binding+to+plant+glycoallergens%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">β (1, 2)-xylose and α (1, 3)-fucose residues have a strong contribution in IgE binding to plant glycoallergens.</a> Journal of Biological Chemistry. 275 (15), 11451-11458 (2000).</li>
<li>Biswas, H., Chattopadhyaya, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stability+of+Curcuma+longa+rhizome+lectin%3A+Role+of+N-linked+glycosylation%5BTitle%5D)+AND+%22Glycobiology%22%5BJournal%5D)">Stability of Curcuma longa rhizome lectin: Role of N-linked glycosylation.</a> Glycobiology. 26 (4), 410-426 (2016).</li>
<li>Lefebvre, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+N-glycosylation+sites+and+CXC+motifs+in+trafficking+of+Medicago+truncatula+Nod+factor+perception+protein+to+plasma+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Role of N-glycosylation sites and CXC motifs in trafficking of Medicago truncatula Nod factor perception protein to plasma membrane.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (14), 10812-10823 (2012).</li>
<li>Severino, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+the+glycan+moiety+on+the+structure-function+relationships+of+PD-L1%2C+type+1+ribosome-inactivating+protein+from+P.+dioica+leaves%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+BioSystems%22%5BJournal%5D)">The role of the glycan moiety on the structure-function relationships of PD-L1, type 1 ribosome-inactivating protein from P. dioica leaves.</a> Molecular BioSystems. 6 (3), 570-579 (2010).</li>
<li>Lige, B., Ma, S., Van Huystee, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+the+site-directed+removal+of+N-glycosylation+from+cationic+peanut+peroxidase+on+its+function%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Biochemistry+and+Biophysics%22%5BJournal%5D)">The effects of the site-directed removal of N-glycosylation from cationic peanut peroxidase on its function.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 386 (1), 17-24 (2001).</li>
<li>Ceriotti, A., Duranti, M., Bollini, R. <a target="_blank" href="https://academic.oup.com/jxb/article/49/324/1091/481062">Effects of N-glycosylation on the folding and structure of plant proteins.</a> Journal of Experimental Botany. 49 (324), 1091-1103 (1998).</li>
<li>Kamerling, J. P., Gerwig, G. J. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/46698050_Strategies_for_the_Structural_Analysis_of_Carbohydrates">Strategies for the Structural Analysis of Carbohydrates.</a> Comprehensive Glycoscience. , 1-68 (2007).</li>
<li>Huang, Y., Mechref, Y., Novotny, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microscale+nonreductive+release+of+O-linked+glycans+for+subsequent+analysis+through+MALDI+mass+spectrometry+and+capillary+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Microscale nonreductive release of O-linked glycans for subsequent analysis through MALDI mass spectrometry and capillary electrophoresis.</a> Analytical Chemistry. 73 (24), 6063-6069 (2001).</li>
<li>Triguero, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+and+enzymatic+N-glycan+release+comparison+for+N-glycan+profiling+of+monoclonal+antibodies+expressed+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Chemical and enzymatic N-glycan release comparison for N-glycan profiling of monoclonal antibodies expressed in plants.</a> Analytical Biochemistry. 400 (2), 173-183 (2010).</li>
<li>Tretter, V., Altmann, F., Marz, L. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/1868849">Peptide-N4-(N-acetyl-β-glucosaminyl)asparagine amidase F cannot release glycans with fucose attached α1 → 3 to the asparagine-linked N-acetylglucosamine residue.</a> European Journal of Biochemistry. 199 (3), 647-652 (1991).</li>
<li>Fan, J. -Q., Lee, Y. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detailed+studies+on+substrate+structure+requirements+of+glycoamidases+A+and+F%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Detailed studies on substrate structure requirements of glycoamidases A and F.</a> Journal of Biological Chemistry. 272 (43), 27058-27064 (1997).</li>
<li>Altmann, F., Paschinger, K., Dalik, T., Vorauer, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterisation+of+peptide-N4-%28N-acetyl-%CE%B2-glucosaminyl%29asparagine+amidase+A+and+its+N-glycans%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Characterisation of peptide-N4-(N-acetyl-β-glucosaminyl)asparagine amidase A and its N-glycans.</a> European Journal of Biochemistry. 252 (1), 118-123 (1998).</li>
<li>Altmann, F., Schweiszer, S., Weber, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+comparison+of+peptide%3A+N-glycosidases+F+and+A+reveals+several+differences+in+substrate+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22Glycoconjugate+Journal%22%5BJournal%5D)">Kinetic comparison of peptide: N-glycosidases F and A reveals several differences in substrate specificity.</a> Glycoconjugate Journal. 12 (1), 84-93 (1995).</li>
<li>Wang, T., Voglmeir, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PNGases+as+valuable+tools+in+glycoprotein+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+and+Peptide+Letters%22%5BJournal%5D)">PNGases as valuable tools in glycoprotein analysis.</a> Protein and Peptide Letters. 21 (10), 976-985 (2014).</li>
<li>Wang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+and+characterization+of+a+novel+extremely+acidic+bacterial+N-glycanase+with+combined+advantages+of+PNGase+F+and+A%5BTitle%5D)+AND+%22Bioscience+Reports%22%5BJournal%5D)">Discovery and characterization of a novel extremely acidic bacterial N-glycanase with combined advantages of PNGase F and A.</a> Bioscience Reports. 34 (6), 00149(2014).</li>
<li>Du, Y. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+sample+preparation+methodology+for+plant+N-.glycan+analysis+using+acid-stable+PNGase+H%2B%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Agricultural+and+Food+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Rapid sample preparation methodology for plant N-.glycan analysis using acid-stable PNGase H+.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 63 (48), 10550-10555 (2015).</li>
<li>Wang, T., Hu, X. -C., Cai, Z. -P., Voglmeir, J., Liu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Qualitative+and+Quantitative+Analysis+of+Carbohydrate+Modification+on+Glycoproteins+from+seeds+of+Ginkgo+biloba%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Agricultural+and+Food+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Qualitative and Quantitative Analysis of Carbohydrate Modification on Glycoproteins from seeds of Ginkgo biloba.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 65 (35), 7669-7679 (2017).</li>
<li>Ceroni, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GlycoWorkbench%3A+a+tool+for+the+computer-assisted+annotation+of+mass+spectra+of+glycans%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">GlycoWorkbench: a tool for the computer-assisted annotation of mass spectra of glycans.</a> Journal of Proteome Research. 7 (4), 1650-1659 (2008).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本文所介绍的方案可用于比较不同品种萝卜的 N-聚糖谱型。与现有方案相比，该方法的一个显著优势在于，N-聚糖的酶解释放与使用 2-AB 进行衍生化反应之间无需更换缓冲液。该操作中最关键的步骤是使用固相萃取（SPE）柱对 N-聚糖进行纯化，因为若未能去除反应混合物中的盐类或其他杂质，可能会对荧光衍生化效率产生不利影响。本文所述方法仅可用于评估不同 N-聚糖的相对丰度；若需进行绝对定量，则需在步骤 2.1 中加入内标物（如麦芽五糖）。
此外，此处使用的衍生化试剂（2-AB）也可替换为2-氨基吡啶（2-AP）或其他衍生化试剂。步骤5.3中获得的N-聚糖衍生物还可通过尺寸排阻色谱法（SEC）、强或弱阴离子交换色谱法（SAX或WAX）或反相高效液相色谱法（HPLC）进行分离（尽管分辨率可能较低）。为进一步验证N-聚糖的结构，可在步骤5.3之后采用逐级外切糖苷酶处理，以更详细地表征N-聚糖的结构。最后，步骤6.8的样品可进一步采用基于MALDI-TOF-MSn<...

N植物中的-glycans近年来受到越来越多关注，因为先前的研究已强调 N-glycans 作为可能引发过敏反应的免疫交叉反应潜在来源1,2此前已证明 N植物糖蛋白上的聚糖可能影响其催化活性3,4，热稳定性与折叠5,6 亚细胞定位与分泌7为了将聚糖结构与其相应功能相关联， N-聚糖必须首先通过化学或酶法从糖蛋白中释放。用于释放两者的经典化学方法 N- 和 O-glycans 的方法是β-消除法，该方法通过在碱性条件下处理样品并用硼氢化物还原，生成醛糖醇8然而，该方法无法进行荧光标记，并会导致聚糖结构还原端的单糖单元发生显著降解。基于氢氧化铵/碳酸铵处理的化学去糖基化也是一种常用的替代方法。9这两种化学释放方法均不会降解完整蛋白质，从而可在质谱分析中避免同一质荷比范围内的肽段碎片干扰，实现对未标记糖链混合物的分析。然而，这些方法的一个缺点是会加快α1,3-岩藻糖基化结构的降解速率 N-糖链，一种在植物中常见的碳水化合物结构10或者，使用肽：的酶解法释放N-糖苷酶（PNGases，EC 3.5.1.52）也广泛应用。重组PNGase F（来源于 产黏液金黄杆菌是最常见的选择，可允许释放各种类型 N-糖链，但具有核心α1,3岩藻糖的结构除外11,12因此，通常使用PNGase A（从杏仁种子中分离）进行植物分析 N-糖链13然而，该酶仅能去糖基化蛋白水解产生的糖肽，无法对天然糖蛋白进行去糖基化。14因此，在进一步分析之前需要进行多步样品预处理，这会导致聚糖的大量损失，尤其是低丰度聚糖15该方法的总体目标是提供一个优化的工作流程 N- 以简单且稳健的方式进行糖链释放和荧光标记。其基本原理在于PNGase H+，该物质最近被发现于 Terriglobus roseus 并且可以在重组条件下表达 E. coli，可水解 N在酸性条件下直接从蛋白质骨架上切割-glycans16使用PNGase H的一个关键优势+ 相较于其他方法的优势在于，荧光标记反应可在同一反应管中进行，无需更换反应缓冲液17,18简单的制备条件和对低丰度寡糖的高回收率使该方法成为寡糖分析中的有力工具 N-糖链。本方案适用于分析 N来自多种植物物种的-glycans。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;化学品：&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>三氯乙酸&amp;nbsp;</td><td>SCR，上海</td><td>80132618</td><td></td></tr><tr><td>冰乙酸</td><td>华大，广州</td><td>64-19-7</td><td></td></tr><tr><td>乙腈</td><td>通用试剂</td><td>G80988C</td><td></td></tr><tr><td>三氟乙酸</td><td>能量化学</td><td>W810031</td><td></td></tr><tr><td>2-氨基苯甲酰胺</td><td>和翁，天津</td><td>A41900</td><td></td></tr><tr><td>氰基硼氢化钠</td><td>J&amp;K Scientific Ltd</td><td>314162</td><td></td></tr><tr><td>二甲基亚砜</td><td>华大，广州</td><td>67-68-5</td><td></td></tr><tr><td>2AB标记的葡聚糖标准品，200 pmol</td><td>安捷伦科技</td><td>AT-5190-6998</td><td></td></tr><tr><td>6-氮杂-2-硫代胸腺嘧啶&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>275514</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;仪器/材料：&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>厨房搅拌机</td><td>小熊，广州</td><td>LLJ-A10T1</td><td></td></tr><tr><td>离心机</td><td>天美</td><td>CT15RT</td><td></td></tr><tr><td>离心浓缩仪</td><td>华立达，太仓</td><td>LNG-T120</td><td></td></tr><tr><td>SPE小柱</td><td>Supelco</td><td>Supelclean ENVI Carb SPE小柱</td><td></td></tr><tr><td>MALDI-TOF质谱仪</td><td>Bruker</td><td>Autoflex</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;HPLC分析：&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>高回收率HPLC小瓶</td><td>安捷伦科技</td><td>&amp;nbsp;# 5188-2788</td><td></td></tr><tr><td>HPLC系统</td><td>岛津</td><td>Nexera</td><td></td></tr><tr><td>HPLC荧光检测器</td><td>岛津</td><td>RF-20Axs&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>柱温箱</td><td>恒信</td><td>CO-2000</td><td></td></tr><tr><td>HPLC色谱柱</td><td>沃特世</td><td>Acquity UPLC BEH糖分析色谱柱</td><td>2.1 &amp;times; 150 mm，1.7 &amp;mu;m粒径</td></tr><tr><td>LCMS级水</td><td>默克密理博</td><td>#WX00011</td><td></td></tr><tr><td>LCMS级乙腈</td><td>默克密理博</td><td># 100029</td><td></td></tr><tr><td>甲酸</td><td>阿拉丁</td><td>F112034</td><td></td></tr><tr><td>氨水</td><td>阿拉丁</td><td>A112080</td><td></td></tr></tbody></table>

使用pngase h+分析萝卜（raphanus sativus）品种的n-聚糖

Analysis of N-glycans from Raphanus sativus Cultivars Using PNGase H+

近年来，植物中的碳水化合物部分受到广泛关注，因其可能引发交叉反应性、致敏性的免疫应答。此外，碳水化合物结构在植物代谢中也发挥着关键作用。本文介绍一种简便快速的制备与分析方法 N-不同品种萝卜中的糖类Raphanus sativus) 使用一个 N-一种特异性释放植物来源碳水化合物结构的糖苷酶。为实现此目的，将萝卜匀浆的粗三氯乙酸沉淀物用PNGase H处理+，并使用2-氨基苯甲酰胺作为荧光标记物进行标记。标记后的 N-glycan 样品随后通过超高效液相色谱（UPLC）分离和基质辅助激光解吸电离-飞行时间（MALDI-TOF）质谱法进行分析，以实现详细的结构评估，并定量分析萝卜来源的-glycan 相对丰度 N-糖链结构。本方案也可用于分析 N-来自其他多种植物物种的聚糖，可能有助于进一步研究其功能与效应 N-糖链对人类健康的影响。

图1展示了所述实验方案的示意图，包括从萝卜中分离（糖基化）蛋白质、制备N-聚糖、UPLC分析以及对这些组分进行MALDI-TOF-MS分析。图2展示了所分析萝卜品种衍生化N-聚糖的代表性UPLC色谱图。图3展示了利用MALDI-TOF质谱法获得的2AB衍生化N-聚糖结构结果。图4展示了各萝卜品种N-聚糖的定量组成。
<img alt="使用 MALDI-TOF-MS 和 HILIC-UPLC 方法对萝卜中的 N-聚糖进行质谱分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57979/57979fig1.jp...

我们介绍一种简单快速的方法，用于制备和分析不同品种萝卜（Raphanus sativus）的N-糖链。

使用PNGase H+分析萝卜（Raphanus sativus）品种的N-聚糖

近年来，植物中的碳水化合物部分受到了广泛关注，因为它们可能是交叉反应的潜在来源，……

该方法有助于回答植物糖科学领域中的一些问题，例如如何快速分析和表征植物来源的N-糖链。该技术的主要优势在于，N-糖链的酶法释放与2-氨基苯甲酰胺衍生化反应之间无需更换缓冲液。本次实验操作将由南京农业大学糖组学与糖工程研究中心的两位研究生杜雅敏（Ya-Min Du）和沈丽珍（Shen-Li Zhen）进行演示。开始分离蛋白质时，使用厨房搅拌机将约100克新鲜萝卜匀浆10分钟。将所得浆液转移至50毫升离心管中。在4°C条件下以14,000 ×g离心20分钟，以去除不溶性物质。此后，小心地将上清液转移至一个新的 50 毫升离心管中。加入等体积的 2 摩尔三氯乙酸溶液。在 4 摄氏度下以 14,000 ×g 离心 30 分钟。然后去除上清液。用20毫升去离子水洗涤沉淀。再次在4℃条件下以14,000 ×g离心5分钟，以去除可溶性低聚糖和多糖。然后，用一毫升去离子水重悬沉淀，并将蛋白质溶液转移至新的1.5毫升离心管中。开始制备N-糖链时，取50微升蛋白质溶液，与0.2毫单位的重组PNGase H+在10毫摩尔/升乙酸中混合。在37摄氏度下孵育12小时。然后，在14,000 ×g 条件下离心5分钟，以去除多余的蛋白质和酶。将上清液转移至新的1.5毫升离心管中，待纯化N-聚糖时使用。开始纯化N-糖链时，先用三毫升水清洗固相萃取柱。加入三毫升含三氟乙酸的80%乙腈溶液以活化色谱柱。然后，用三毫升去离子水平衡色谱柱。将样品转移至色谱柱上，并弃去穿流液。加入1.5毫升去离子水洗涤色谱柱。若未能去除样品混合物中的盐分或引入杂质，可能对荧光衍生化反应的效率产生不利影响。然后，加入1.5毫升含有0.1% TFA的20%乙腈水溶液，将N-聚糖洗脱至一个2毫升离心管中。在室温下通过离心蒸发去除溶剂，蒸发至样品完全干燥。开始对N-聚糖进行荧光标记衍生化时，按照文本方案中所述配制2-AB溶液。向已干燥的样品中加入5 µL配制好的2-AB溶液。涡旋振荡直至每个样品完全溶解。在65 °C下孵育2小时。此后，将样品在室温下冷却五分钟。向冷却后的样品中加入 5 µL 去离子水和 40 µL 乙腈。在 14,000 ×g 条件下离心三分钟。然后，将48 µL的上清液转移至一个300 µL的高回收率HPLC小瓶中。在-20 °C下可保存一个月，或保存至准备使用时。开始分析前，使用配备疏水相互作用液相色谱UPLC糖链分析柱的标准UPLC系统，并连接在线荧光检测器以分析样品。将激发波长和发射波长分别设置为 330 纳米和 420 纳米。将色谱柱温度设置为 60 摄氏度。随后，将 45 微升样品注入 UPLC 系统中。使用15分钟和40分钟的保留时间，通过UPLC洗脱N-糖链。用2毫升离心管收集每个观察到的UPLC峰馏分，然后采用离心蒸发法将样品干燥。注入约一皮摩尔的2-AB标记葡聚糖标准品，用于校准植物N-

analysis-of-n-glycans-from-raphanus-sativus-cultivars-using-pngase-h

Research

科研

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

萝卜品种多糖的 PNGase 研究

我们描述了一种分析糖蛋白在哺乳动物细胞中生物合成后早期生命周期内N-连接聚糖变化的方法。该方法通过代谢标记聚糖的脉冲-追踪分析、从糖蛋白上酶法释放聚糖，并利用高效液相色谱（HPLC）进行检测。...

哺乳动物细胞中糖蛋白N-连接糖链的脉冲-追踪分析

本文描述了一种快速了解细胞外基质中多糖结构的方法。该方法利用了糖基水解酶的特异性和质谱技术的高灵敏度，可分析极微量的样品。此技术可直接应用于组织本身。...

细胞外多糖的寡糖质谱分析（OLIMP）

使用特异性糖苷酶从糖蛋白中去除糖链，随后进行SDS-PAGE，是检测蛋白质样品上聚糖修饰的一种有效方法，也是开展初步糖生物学研究的良好选择。去糖基化后的变化可通过凝胶电泳迁移率的改变或使用对聚糖敏感的染色试剂进行染色来检测。...

利用特异性内切和外切糖苷酶鉴定与表征蛋白质糖基化

本文介绍了一种称为综合微阵列多聚物谱型分析（Comprehensive Microarray Polymer Profiling,...

利用微阵列对植物细胞壁多糖进行糖谱分析

开发了一种高通量方案，用于血浆中蛋白质组学与糖组学联合纯化及液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）定量分析。N-连接糖基化基序的脱酰胺分析特异性针对去糖基化位点。通过将滤膜辅助的N-糖链分离与糖链肼基标签标记过程中的个体性归一化策略相结合，实现了对N-糖链的准确定量。...

一种定量糖组学与蛋白质组学结合的纯化策略

本文介绍了一种改进的自下而上糖组学技术，该技术通过将未分级生物流体中的糖链化学降解为其具有连接特异性的单糖组分，并利用气相色谱-质谱法（GC-MS）进行检测，从而分析糖链的总体组成谱型。该方法的潜在应用包括癌症及其他糖链相关疾病的早期诊断。...

聚糖节点分析：糖组学的自下而上方法

本文描述了一种以甘露聚糖为例，通过凝胶电泳（PACE）进行多糖结构分析的实验方案。...

利用PACE对植物细胞壁甘露聚糖的结构表征

采用亲水相互作用色谱超高效液相色谱法（UPLC）对免疫球蛋白G（IgG）N-糖链进行表征。此外，IgG...

基于超高效液相色谱的免疫球蛋白G N-糖链分析

微阵列聚合物分析（MAPP）是一种用于生物样本中糖类成分分析的高通量技术。...

用于高通量聚糖分析的微阵列聚合物谱型分析（MAPP）

本文介绍了一种从黏蛋白中释放...

使用基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱分析全甲基化黏蛋白 O-糖链

了解萝卜N-聚糖快速分析方法，使用PNGase H+酶解和2-氨基苯甲酰胺衍生化技术，无需更换缓冲液即可高效完成植物糖组学研究。该方法适用于Raphanus sativus品种多糖的UPLC和MALDI-TOF质谱分析。

使用PNGase H⁺分析萝卜（Raphanus sativus）品种的N-聚糖

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