强迫流涎法分析蚊虫的载体能力
2018年8月7日
为有效控制蚊媒传播病毒, 有关蚊子的矢量电位的知识尤其值得关注。本文将强迫流涎作为一种分析白纹伊蚊和三种不同淡色类群对 Zika 病毒传播的载体能力的方法。
这种方法可以帮助回答蚊媒疾病领域的关键问题，例如蚊子物种是否是某种病毒的竞争媒介。这种方法的主要优点是可以同时分析大量蚊子，而无需使用小鼠等实验动物。一般来说，刚接触这种方法的人会很挣扎，因为它需要只能通过练习获得的精细运动技能。
这种技术的视觉演示至关重要，因为关键步骤很难学习;他们需要处理蚊子和病毒的经验，以及精细运动技能。首先，稀释病毒原液。然后，将过期的人血与果糖、滤过的牛血清和病毒原液混合。
冷冻 140 微升血粉混合物，以便通过 TCID50 进一步分析。接下来，将两滴 50 微升的血粉混合物放入塑料瓶中，让蚊子进食两个小时。麻醉蚊子后，对完全充血的个体进行计数，并将它们转移到一个装有浸泡在果糖中的化妆棉的新小瓶中。
然后，将蚊子保持在 27 摄氏度和 80% 湿度下 14 或 21 天。每 72 小时用 1.5 毫升果糖补充果糖饱和的化妆棉。首先，在补充生长培养基的 96 孔板中每孔接种 20， 000 个 Vero 细胞。
要准备流涎装置，请将方形玻璃板以 30 度角放在工作台上。然后，将双面胶带粘在玻璃板的顶部。接下来，将造型粘土滚动至直径为 0.5 厘米，然后将其水平贴在距离双面胶带 1 厘米的板上。
从所需数量的 10 微升过滤吸头上剪掉吸头，并在每个吸头中填充 10 微升 PBS。然后，将尖端放在建模粘土上，并轻轻按压固定它们。接下来，通过去除蚊子的腿和翅膀来固定蚊子。
将蚊子固定在过滤嘴头上方的胶带上。轻轻地将每只蚊子的喙放入过滤嘴中。30 分钟后，取下过滤器尖端，丢弃粘土和胶带。
将收集的唾液转移到含有 10 微升 PBS 的反应管中。轻轻混合唾液和 PBS，然后将混合物转移到 96 孔板的孔中。将板在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳中孵育 7 天。
使用光学显微镜检查细胞是否存在细胞病变效应。一旦孔的细胞病变效应呈阳性，使用移液管收获 140 μL 上清液。然后，将上清液转移到反应管中。
接下来，将 140 μL 上清液与 560 μL AVL 缓冲液混合，并在室温下孵育 10 分钟。最后，加入 560 微升乙醇，倒置样品混合。使用该协议，在各种气候条件下测试了几种蚊子物种的寨卡病毒感染和传播。
在 27 摄氏度的培养条件下，所有伊蚊物种都显示出寨卡病毒阳性的唾液。相反，来自库蚊分类群的唾液样本均不包含病毒的证据。一旦掌握，如果作得当，可以在一小时内对 50 只蚊子执行这项技术。
观看此视频后，您应该对如何进行强制流涎实验有很好的了解。不要忘记，与受感染的蚊子一起工作可能非常危险，因此在进行任何实验时，应始终采取在 BSA-3 条件下处理蚊子的特殊安全措施。
概述
本文讨论了一种分析蚊子的载体能力的方法，特别是白纹伊蚊和各种库蚊属的蚊子，用于寨加病毒传播。强制唾液分泌技术允许同时分析多只蚊子，而无需使用实验动物。
关键研究组成部分
科学领域
- 载体生物学
- 病毒学
- 蚊媒疾病
背景
- 理解载体能力对于控制蚊媒病毒至关重要。
- 强制唾液分泌是一种评估蚊子传播潜力的新方法。
- 以前的方法通常需要实验动物，而该技术旨在消除这一点。
- 精细的运动技能对这种方法至关重要，需要练习和经验。
研究目的
- 评估不同蚊子物种对寨加病毒的载体能力。
- 展示一种允许高通量分析蚊子唾液的方法。
- 为新接触该技术的研究人员提供视觉指南。
使用的方法
- 准备蚊子喂养的血液混合物。
- 强制唾液分泌技术以收集蚊子的唾液。
- 细胞培养方法以评估寨加病毒的存在。
- 孵化和分析样品的细胞病变效应。
主要结果
- 在受控条件下，白纹伊蚊属显示寨加病毒的阳性唾液。
- 库蚊属的唾液中没有展示寨加病毒的证据。
- 一旦掌握，该方法允许在一小时内测试多达50只蚊子。
- 视觉演示显著有助于学习该技术。
结论
- 强制唾液分泌是研究蚊媒病毒传播的有效方法。
- 培训和练习对于成功实施该技术至关重要。
- 在处理受感染蚊子时必须遵守安全措施。
常见问题
Executive Industry Relevance
Forced salivation assays enable high-throughput evaluation of mosquito vector competence without animal models, supporting early-stage target validation in antiviral discovery. The method provides quantitative, replication-competent virus detection from individual insects, informing go/no-go decisions for prophylactic or therapeutic candidates against arboviruses. Its scalability and reproducibility enhance predictive confidence in preclinical de-risking of transmission-blocking interventions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by measuring virus transmission potential in individual disease vectors.
- Operational Value: Enables biological de-risking of targets through direct assessment of vector competence under controlled conditions.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by identifying non-competent vector species, reducing false-positive leads in arbovirus programs.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream antiviral screening by confirming virus susceptibility in vector models.
- Operational Value: Standardizes saliva collection and virus detection, ensuring reproducible quantitative outputs across large mosquito cohorts.
- Scalability: Facilitates platform reuse for high-throughput evaluation of transmission-blocking compounds or vaccines.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Aligns with disease-relevant systems by testing vector competence under epidemiologically relevant temperatures (18–27°C).
- Operational Value: Ensures continuity from discovery to preclinical validation via consistent saliva-based virus readouts.
- Risk Mitigation: Informs advancement decisions by establishing temperature-dependent transmission thresholds for lead candidates.
Pipeline & Workflow Integration
The forced salivation method fits within the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical evaluation, particularly for arbovirus-directed interventions.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by quantifying virus presence in mosquito saliva as a functional readout of transmission potential.
- Screening: Delivers assay readiness and reproducibility through standardized saliva collection and TCID50-equivalent virus detection in Vero cells.
- Analytics: Generates quantitative dependent variable measurements (viral titer in saliva) enabling comparison across species, strains, and environmental conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity via temperature-stratified transmission data that mirrors field-relevant transmission windows.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable capability for screening multiple arboviruses (e.g., ZIKV, DENV, CHIKV) across vector species without reoptimization.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation, reduction of mechanistic ambiguity in transmission biology.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability across entomology and virology teams.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk in antiviral programs.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on empirical vector competence data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in mosquito handling, virology, and microsurgical techniques under BSL-3 containment.
- Dependent on specialized instrumentation including salivation devices, incubators with precise humidity control, and microscopy for cytopathic effect scoring.
- Necessitates cross-team standardization of bloodmeal preparation, incubation timelines, and saliva collection intervals.
- Adaptation considerations include species-specific proboscis size, feeding behavior, and salivary gland morphology across vector models.
- Practical limitations include the need for extensive training to achieve proficiency and the method’s dependence on viable virus recovery from saliva.
