Name: 酿酒酵母4-硫尿嘧啶代谢标记及新合成 mRNA 作为 RNA 聚合酶 II. 活性的一种代理 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 21 s
Description: 学习利用4-硫尿嘧啶代谢标记技术定量分析酿酒酵母新合成mRNA的方法，以RNA聚合酶II活性为指标。该技术可准确测量转录水平，不受RNA降解影响，适用于高通量测序研究基因表达调控。

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我们感谢拉斯洛·托拉（Laszlo Tora）的支持，以及 V. Fisher、K. Schumacher 和 F. El Saafin 的有益讨论。T.B. 获得了玛丽·居里-ITN 奖学金（PITN-GA-2013-606806，NR-NET）和 ARC 基金会的资助。本工作得到了法国国家科研署（ANR-15-CE11-0022 SAGA2）基金的支持。本研究还得到了法国国家科研署管理的“未来投资计划”框架项目（ANR-10-IDEX-0002-02）下的法国国家科研署卓越实验室基金（ANR-10-LABX-0030-INRT）的支持。

1. 细胞培养及SAGA亚基的雷帕霉素耗竭
<ol>
	<li>对于每种 S. cerevisiae 菌株及重复实验，包括野生型或对照菌株，从新鲜平板上挑取单菌落接种至 5 mL YPD 培养基（2% 蛋白胨、1% 酵母提取物和 2% 葡萄糖）中。</li>
	<li>在 30 °C 条件下，以持续振荡（150 rpm）培养 S. cerevisiae 细胞过夜。</li>
	<li>测定 600 nm 处的光密度（OD600），并将菌液用 YPD 培养基稀释至 OD600 约为 0.1，总体积为 100 mL，继续培养至 OD600 达到约 0.8。</li>
	<li>同时，从新鲜平板上挑取一单菌落 S. pombe 细胞接种至 50 mL YES 培养基（0.5% 酵母提取物；250 mg/L 腺嘌呤、组氨酸、尿嘧啶、亮氨酸和赖氨酸；3% 葡萄糖）中，并在 32 °C 条件下以持续振荡（150 rpm）过夜培养。</li>
	<li>测定 S. pombe 过夜培养物的 OD600，并将菌液用 YES 培养基稀释至 OD600 约为 0.1，总体积为 500 mL，继续培养至 OD600 约为 0.8。</li>
	<li>对于每种 S. cerevisiae 锚定去除（anchor-away）菌株及重复实验，包括野生型或对照菌株，从新鲜平板上挑取单菌落接种至 5 mL YPD 培养基（2% 蛋白胨、1% 酵母提取物和 2% 葡萄糖）中。</li>
	<li>在 30 °C 条件下以持续振荡（150 rpm）过夜培养细胞。</li>
	<li>次日早晨，测定 OD600，将菌液用 YPD 培养基稀释至 OD600 约为 0.1，总体积为 100 mL，并继续培养至 OD600≈ 0.8。</li>
	<li>向菌液中加入 100 µL 雷帕霉素（来自 1 mg/mL 的储存液，终浓度为 1 µg/mL），并在 30 °C 条件下持续振荡孵育一定时间，以实现目标蛋白在细胞核中的条件性耗竭（通常 30 分钟已足够）。对照组使用类似的酵母培养物，不添加雷帕霉素，而是加入等体积的二甲基亚砜（DMSO）。</li>
</ol>
2. 以 S. pombe 作为内参的 4tU 标记（计数）
<ol>
	<li>配制新鲜的2 M 4-硫代尿嘧啶溶液。配制完成后，于室温避光保存。
	<ol>
		<li>准确称取每份 64.1 mg 的 4-硫代尿嘧啶 S. cerevisiae 培养并溶于250 µL二甲基甲酰胺（DMF）或250 µL DMSO中。</li>
		<li>对于 S. pombe 将用于加标对照的培养物，称取320.5 mg的4-硫代尿嘧啶，溶于1,250 µL DMSO中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>加入4-硫代尿嘧啶溶液 S. cerevisiae 和 S. pombe 培养物中加入终浓度为5 mM的试剂，并分别在30 °C和32 °C下持续振荡孵育6分钟。</li>
	<li>6分钟后，从每种培养物中取出少量样品用于细胞计数。使用自动细胞计数仪或血球计数板进行细胞计数。</li>
	<li>通过离心收集细胞（2,500 x g在 4 °C 下离心 5 分钟。</li>
	<li>弃去上清液，用预冷的1×PBS洗涤细胞，再次离心（2,500 × g，4 °C，5 分钟。</li>
	<li>计算每个中的细胞总数 S. cerevisiae 和 S. pombe 样本。</li>
	<li>将细胞重悬于 5 mL 冰冷的 1x PBS 中并混匀 S. cerevisiae 与 S. pombe 细胞以3:1的比例混合。</li>
	<li>离心细胞（2,500 x g，4 °C，5 分钟），移除 PBS，将细胞在液氮中速冻2并将样品于 -80 °C 保存，直至后续使用。</li>
</ol>
3. RNA 提取与DNase处理
<ol>
	<li>将细胞在冰上解冻约20–30分钟。</li>
	<li>使用酵母RNA提取试剂盒进行RNA提取材料表)并稍作修改。</li>
	<li>每个样品中，向试剂盒提供的1.5 mL螺口管加入750 µL预冷的氧化锆珠。请注意，每管可提取最多10个9 细胞可以被高效提取。因此，应为每个样本准备所需的试管数量。例如，一个 S. cerevisiae 100 mL 培养液（OD600≈ 0.8）可产生约 2 × 109 至 3 × 109 细胞，总计达到 2.7 x 109 至 4 × 109 总共的细胞数（在加入三分之一的 spike-in 后） S. pombe 细胞）。在这种情况下，每个样本/条件/突变体/重复需要准备3-4个反应管。</li>
	<li>每 1 x 109 细胞中加入480 µL试剂盒提供的裂解缓冲液、48 µL 10% SDS以及480 µL苯酚:氯仿:异戊醇（25:24:1，v/v/v）。</li>
	<li>使用涡旋混合器混匀细胞，然后转移至含有冰冻氧化锆珠的离心管中。</li>
	<li>将试管置于涡旋混合器适配器上，在4 °C室温下以最大速度涡旋振荡10分钟，以裂解酵母细胞。或者，可使用自动珠磨破碎仪进行细胞裂解。</li>
	<li>在16,000下离心试管 x g 室温孵育5分钟，小心收集上层相（含RNA相）至新的15 mL离心管中。通常每管回收的体积约为500–600 µL。</li>
	<li>向含有部分纯化RNA的15 mL离心管中加入试剂盒提供的结合缓冲液，并充分混匀。每100 µL RNA溶液加入350 µL结合缓冲液（即，当水相溶液体积为600 µL时，应加入2.1 mL结合缓冲液。</li>
	<li>向上述混合物中加入100%乙醇并充分混匀。每100 µL RNA溶液加入235 µL 100%乙醇（即，当水相溶液体积为600 µL时，加入1.41 mL乙醇。</li>
	<li>将步骤3.9中所得混合物最多700 µL加入滤芯中，滤芯置于收集管内，两者均由试剂盒提供。</li>
	<li>离心1分钟，16,000 x g如果离心时间不足以使全部体积通过滤膜，则重复离心30秒。</li>
	<li>弃去穿流液，并重复使用同一收集管。向滤膜中加入700 µL RNA结合缓冲液-乙醇溶液，再次于16,000 x g离心 g 1 分钟。</li>
	<li>弃去穿流液，重复步骤 3.11 和 3.12，直至完成全部 RNA 溶液处理。</li>
	<li>用700 µL洗涤液1洗涤滤膜2次，收集洗涤液。 通过 16,000 x 离心 g 1 分钟，并始终保留收集管。</li>
	<li>用500 µL洗涤液2洗涤滤膜2次，收集洗涤液。 通过 16,000 x 离心 g 1 分钟，并始终保留收集管。</li>
	<li>再次以16,000 x g离心试管 g 1分钟，以彻底干燥滤膜。</li>
	<li>将滤芯转移至最终收集管（适用于RNA的管子），用50 µL经DEPC处理且无RNase的H₂O洗脱RNA2O（预热至100 °C）。</li>
	<li>离心1分钟，16,000 x g.</li>
	<li>用 50 µL 预热的 DEPC 处理、无 RNase 的 H₂O 再次洗脱 RNA（至同一管中）2O. 确保所有液体体积均已通过滤膜；否则，延长离心时间。</li>
	<li>若一个样本使用了多个试管，需将所有试管中的样本合并至一个试管中。</li>
	<li>使用适当的设备对样品进行定量并检测其纯度。 
	注意：虽然4tU仅掺入新合成的RNA中，但仍可能存在少量DNA污染。因此，建议始终用DNase I处理样品。可使用RNA提取试剂盒中提供的试剂进行处理材料表按照制造商的建议进行。</li>
</ol>
4. 新合成RNA的硫醇特异性生物素标记
<ol>
	<li>将按照本方案第3节获得的RNA浓度调整至2 mg/mL。取200 µg总RNA，于60 °C加热10分钟，立即置于冰上冷却2分钟。</li>
	<li>向RNA分装液中按以下顺序加入下列试剂：600 µL经DEPC处理且无RNase的H2O、100 µL生物素化缓冲液（含100 mM Tris-HCl [pH 7.5] 和10 mM EDTA，溶于经DEPC处理且无RNase的H2O中）、以及200 µL来自1 mg/mL生物素-HPDP（溶于DMSO或DMF）储备液的生物素-HPDP。
	<ol>
		<li>在某些情况下，生物素-HPDP溶液容易发生沉淀，可能是由于其在水中的溶解度较低所致。此时，可将DMSO/DMF的体积增加至反应总体积的40%（向RNA样品中加入400 µL经DEPC处理的H2O、100 µL生物素化缓冲液，以及400 µL来自0.5 mg/mL储备液的生物素-HPDP）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将样品在室温下避光孵育3小时，并轻轻振荡。</li>
	<li>孵育结束后，向各管中加入等体积的氯仿，并剧烈混匀。</li>
	<li>在4 °C条件下，以13,000 x g离心5分钟。此步骤可去除未与RNA结合的过量生物素。或者，可使用相分离锁管（重相型）进行该步骤：先将相分离锁管在13,000 x g下离心1分钟，然后向管中加入RNA混合物和等体积的氯仿，剧烈混匀后，在4 °C、13,000 x g下离心5分钟。</li>
	<li>小心将上层水相转移至新的2 mL离心管中。</li>
	<li>加入终体积十分之一的5 M NaCl，并混匀样品。</li>
	<li>加入等体积的异丙醇，充分混匀后，在4 °C、13,000 x g下离心至少30分钟。</li>
	<li>小心弃去上清液，加入1 mL预冷的75%乙醇。</li>
	<li>在4 °C条件下，以13,000 x g离心10分钟。</li>
	<li>小心弃去上清液，短暂离心后，彻底去除残留的乙醇溶液。注意确保RNA沉淀不干燥。</li>
	<li>将RNA溶解于100 µL经DEPC处理且无RNase的H2O中。</li>
</ol>
5. 使用链霉亲和素包被的磁珠从总RNA和未标记RNA中纯化新合成的RNA组分
<ol>
	<li>将生物素标记的RNA在65 °C下加热10分钟，然后将样品置于冰上冷却5分钟。</li>
	<li>向生物素标记的RNA（终体积为200 µL）中加入100 µL链霉亲和素包被的磁珠。特别建议使用材料表中列出的磁珠，因为根据与其他实验室的交流，这些磁珠表现出更高的稳定性和可靠性。</li>
	<li>在室温下轻轻振荡孵育样品90分钟。</li>
	<li>将试剂盒提供的柱子（材料表）放置于磁力架上。</li>
	<li>向柱子中加入900 µL室温洗涤缓冲液（含100 mM Tris-HCl [pH 7.5]、10 mM EDTA、1 M NaCl和0.1% Tween 20的DEPC处理且无RNase的H2O溶液），并预先冲洗和平衡柱子。</li>
	<li>将磁珠/RNA混合物（200 µL）加入柱子中。</li>
	<li>收集穿流液至1.5 mL离心管中，并将其再次加入同一磁力柱中。如有需要，可保留此穿流液，因其代表未标记的RNA组分。</li>
	<li>用逐渐增加体积的洗涤缓冲液（600、700、800、900和1,000 µL）洗涤柱子5次。</li>
	<li>用200 µL 0.1 M DTT洗脱新合成的RNA。</li>
	<li>3分钟后，用等体积的0.1 M DTT进行第二次洗脱。</li>
	<li>洗脱RNA后，加入0.1倍体积的3 M NaOAc（pH 5.2）、3倍体积的预冷100%乙醇以及2 µL 20 mg/mL糖原（RNA级），并在-20 °C下过夜沉淀RNA。</li>
	<li>通过离心（4 °C下13,000 x g离心10分钟）回收RNA，并将其重悬于15 µL DEPC处理且无RNase的H2O中。标记RNA占总RNA的比例预计约为2%–4%（通常偏向较低范围），可获得约2.0 µg的新合成RNA。该产量足以进行多次qPCR实验，也可用于微阵列或测序分析。</li>
</ol>
6. 不同组分的 RT-qPCR 验证
<ol>
	<li>根据制造商的说明（材料表），使用随机六聚体引物和选定的逆转录酶，从 2 µg 总 RNA 或 10 µL 标记 RNA 中合成 cDNA。</li>
	<li>采用标准方案通过实时定量 PCR 扩增 cDNA（材料表）。 
	注意：所有样品应至少来自两个生物学重复，并每个设置三个技术重复。所有原始数据需根据 S. pombe 微管蛋白基因的表达水平进行校正。</li>
</ol>
7. 微阵列杂交
<ol>
	<li>根据制造商说明，将RNA样本杂交至选定的微阵列芯片上（本具体方案参见材料表）。简言之，使用Premier RNA扩增试剂盒（材料表）按照制造商说明，从150 ng RNA制备生物素标记的cRNA靶标。将4 mg片段化的cRNA在45 °C、60 rpm条件下于微阵列芯片上杂交16小时。</li>
	<li>使用指定的洗涤站和扫描仪（材料表）对芯片进行洗涤、染色和扫描。利用命令控制台（AGCC，版本4.1.2）从扫描图像中提取原始数据（CEL信号强度文件）。</li>
	<li>使用Expression Console软件（版本1.4.1）进一步处理CEL文件，采用基于统计学的MAS 5.0算法（默认参数）并以全局标准化法进行归一化，计算探针组的信号强度。 
	注意：每张芯片的修剪平均目标信号强度被任意设定为100。所有实验均应至少进行两次独立的生物学重复。将原始数据归一化至S. pombe信号，并计算总RNA和新合成RNA水平的倍数变化。</li>
</ol>
8. 使用现有 R 分析流程进行数据分析
<ol>
	<li>使用公开可用的分析流程和 R/Bioconductor 软件包计算合成速率和降解速率，方法如前所述8,10。</li>
</ol>

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<li>Darzacq, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+dynamics+of+RNA+polymerase+II+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">In vivo dynamics of RNA polymerase II transcription.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 14 (9), 796-806 (2007).</li>
<li>Fuchs, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+measurement+of+genome-wide+transcription+elongation+speeds+and+rates+of+RNA+polymerase+II+transition+into+active+elongation+with+4sUDRB-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Simultaneous measurement of genome-wide transcription elongation speeds and rates of RNA polymerase II transition into active elongation with 4sUDRB-seq.</a> Nature Protocols. 10 (4), 605-618 (2015).</li>
<li>Singh, J., Padgett, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rates+of+in+situ+transcription+and+splicing+in+large+human+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Rates of in situ transcription and splicing in large human genes.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 16 (11), 1128-1133 (2009).</li>
<li>Schwalb, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TT-seq+maps+the+human+transient+transcriptome%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">TT-seq maps the human transient transcriptome.</a> Science. 352 (6290), 1225-1228 (2016).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

尽管全基因组水平分析转录变化的工具仍在不断改进，但仅通过定量RNA稳态水平来分析转录组，可能无法准确反映RNA聚合酶II活性的变化。事实上，mRNA水平不仅受RNA合成的调控，还受到其成熟和降解过程的影响。为了在排除mRNA降解干扰的情况下测量mRNA的合成，近年来已开发出多种不同的实验方案，用于分析酵母和哺乳动物中的新生转录。
用于定量新生转录的最广泛使用方案之一是GRO-seq1。尽管GRO-seq的主要优势在于能够以高分辨率和低背景揭示处于转录活跃状态的RNA聚合酶，但它存在两个明显缺点，降低了其吸引力：（i）该技术操作难度较高，需要分离细胞核；（ii）细胞核的操作会对系统引入一定干扰28。另一种替代方法是NET-seq，该方法依赖于对新生RNA、模板DNA和RNA聚合酶II之间形成的极为稳定的三元复合物进行免疫沉淀，随后对所获得转录本的3'末端进行测序。该方法能够在单碱基分辨率下表征新生RNA，并可通过免疫沉淀修饰形式的RNA聚合酶II（例如丝氨酸-5磷酸化）来研究mRNA加工事...

细胞通过动态改变其基因表达程序，对内源性和外源性信号作出响应。近年来，全基因组范围的研究方法取得了巨大进展，使得能够在不同条件下精确而全面地描述转录组的变化。在大多数转录组学研究中，通常采用微阵列杂交或高通量测序技术来定量总稳态RNA组分中的RNA水平。在特定扰动下的转录变化可能表现出多种结果，包括特定基因的表达改变，或大量基因的上调或下调。基因表达是RNA聚合酶及其他影响RNA水平的过程共同作用所形成的精细调控平衡——即稳态——的结果。RNA聚合酶II的转录过程包含三个不同阶段（起始、延伸和终止），并与mRNA加工、胞质转运、翻译及降解过程高度关联且相互交织。
最近的多项研究表明，mRNA 的合成与降解是相互偶联的机制，且在量化总稳态 RNA 时，可能会忽略突变或刺激条件下的转录效应。首先，通过分析 mRNA 稳态水平来检测转录变化，始终依赖于 mRNA 的半衰期。一旦引入扰动，具有较长半衰期的 mRNA 的稳态水平受到的影响远小于半衰期较短的 mRNA。因此，对 RNA 合成变化的检测明显偏向于短寿命转录本，而对长寿命 mRNA 物种的分析可能无法揭示转录速率的动态变化。其次，已有若干研究报道，在酵母和哺乳动物中，分析 mRNA 稳态水平时可能忽略转录的全局性变化。这很可能是由于 mRNA 合成与降解之间存在偶联机制，导致 mRNA 水平被缓冲所致。上述局限性促使研究人员开发了新的实验方案，通过分析新转录的 mRNA 来独立于降解过程地定量 mRNA 合成。近年来，已提出多种替代方法，包括全局延伸测序（GRO-seq）1 和天然延伸转录本测序（NET-seq）2,3。本文介绍的方案最初在哺乳动物细胞中建立4,5,6，随后被改进并适用于酵母7,8,9,10,11，其原理基于使用硫代核苷或碱基类似物 4-硫代尿苷（4sU）或 4-硫代尿嘧啶（4tU）对 RNA 进行标记。
该方法可特异性纯化在细胞中经4sU脉冲标记的新生RNA，且几乎不会干扰细胞的稳态。因此，当细胞暴露于4sU后，该分子会迅速被细胞摄取，并磷酸化为4sU-三磷酸，进而掺入正在转录的RNA中。完成脉冲标记后，可提取总细胞RNA（对应RNA的稳态水平），随后对4sU标记的RNA组分进行巯基特异性修饰，从而在生物素与新生转录的RNA之间形成二硫键4,5。然而，只有表达核苷转运蛋白（如人平衡型核苷转运蛋白hENT1）的细胞才能摄取4sU，这限制了其在芽殖酵母或裂殖酵母中的直接应用。尽管可以在S. pombe或S. cerevisiae中异源表达hENT1，但更简便的方法是使用修饰碱基4tU，因为酵母细胞能够直接摄取4tU，无需额外表达核苷转运蛋白10,11,12,13。事实上，4tU的代谢依赖于尿嘧啶磷酸核糖转移酶（UPRT）的活性。在包括酵母在内的多种生物中（但哺乳动物除外），UPRT是嘧啶补救途径中的关键酶，负责将尿嘧啶回收转化为尿苷一磷酸。
在并行分析不同样本的转录组研究中，样本间的归一化可能引入重要偏差。事实上，多种偏差因素可影响突变株与野生型菌株转录组的比较分析：细胞裂解效率、RNA提取与回收率的差异，以及微阵列分析中扫描仪校准的变异等。如上所述，当预期对RNA聚合酶II转录产生全局性影响时，此类变异尤其容易导致错误结论。为精确比较不同样本间的mRNA合成速率，研究人员设计了一种巧妙的方法，即利用进化关系较远的裂殖酵母 裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe） 作为内标。为此，使用固定数量的标记 S. pombe 细胞被添加到 S. cerevisiae 样品，包括野生型或突变型细胞，在细胞裂解和RNA提取之前10随后，分别提取稳态和新合成的RNA S. pombe 和 S. cerevisiae 通过 RT-qPCR 或其他方法进行定量 通过 微阵列芯片或高通量测序的使用10结合这些数据与动力学建模，可测定酿酒酵母中mRNA合成与降解的绝对速率。
在本论文的框架中，我们将展示新转录RNA的分析如何揭示共激活因子复合物SAGA和TFIID在芽殖酵母RNA聚合酶II转录中的全局性作用14,15,16。重要的是，以往的研究通过定量酿酒酵母（S. cerevisiae）中mRNA的稳态水平，提出SAGA主要在一组有限的酵母基因上发挥功能，这些基因对SAGA的突变高度敏感，但对TFIID突变相对耐受17,18,19。然而，令人意外的是，SAGA的酶活性被证明作用于整个转录基因组，提示该共激活因子在RNA聚合酶II转录中具有更广泛的作用。当SAGA或TFIID失活时，大多数表达基因上的RNA聚合酶II招募减少，表明这两种共激活因子在大多数基因上协同发挥作用。因此，对新转录mRNA的定量分析揭示，SAGA和TFIID对于RNA聚合酶II介导的几乎所有基因的转录都是必需的14,15,16。补偿机制的启动成为细胞应对mRNA合成全局性下降的一种方式，这种下降被mRNA降解的同步全局性降低所缓冲。SAGA因此加入了一系列对RNA聚合酶II转录具有全局影响的因子行列，包括RNA聚合酶II亚基10、Mediator共激活复合物20、通用转录因子TFIIH21,22，以及间接参与的mRNA降解机制组分9,10,23。这类补偿事件在SAGA突变体中普遍存在，解释了尽管mRNA合成出现全局性且严重的下降，但稳态mRNA水平的变化却较为轻微且有限的现象14。类似分析也在BRE1基因缺失菌株中进行，导致组蛋白H2B泛素化的完全丧失。有趣的是，在缺乏Bre1的情况下，仍可检测到较轻微但一致的RNA聚合酶II转录全局效应，表明在酵母中对新转录RNA进行代谢标记能够检测并量化mRNA合成速率的广泛变化。

<table><tbody><tr><td>4-硫代尿嘧啶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat# 440736</td><td></td></tr><tr><td>雷帕霉素</td><td>Euromedex</td><td>Cat# SYN-1185</td><td></td></tr><tr><td>Countess II FL 全自动细胞计数仪</td><td>ThermoFisher</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>RiboPure RNA 纯化试剂盒（酵母）</td><td>ThermoFisher</td><td>Cat# AM1926</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 2000 分光光度计</td><td>ThermoFisher</td><td>ND-2000</td><td></td></tr><tr><td>TURBO DNA-free 试剂盒</td><td>ThermoFisher</td><td>AM1907</td><td></td></tr><tr><td>EZ-Link HPDP 生物素</td><td>ThermoFisher</td><td>Cat# 21341</td><td></td></tr><tr><td>硫芦丁</td><td>Abcam</td><td>ab143556</td><td></td></tr><tr><td>&amp;micro;MACS 链霉亲和素试剂盒</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>Cat# 130-074-101</td><td></td></tr><tr><td>Transcriptor 逆转录酶</td><td>Roche</td><td>03 531 295 001</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Green I Master</td><td>Roche</td><td>4707516001</td><td></td></tr><tr><td>GeneChip 酵母基因组 2.0 芯片</td><td>ThermoFisher</td><td>900555</td><td></td></tr><tr><td>GeneChip 液体处理工作站 450</td><td>ThermoFisher</td><td>00-0079</td><td></td></tr><tr><td>GeneChip 扫描仪 3000 7G</td><td>ThermoFisher</td><td>00-0210</td><td></td></tr></tbody></table>

saccharomyces cerevisiae 中利用 4-硫代尿嘧啶进行代谢标记及新合成 mrna 的定量作为 rna 聚合酶 ii 活性的替代指标

Saccharomyces cerevisiae Metabolic Labeling with 4-thiouracil and the Quantification of Newly Synthesized mRNA As a Proxy for RNA Polymerase II Activity

转录组学研究在分析稳态RNA时，可能会忽略RNA聚合酶II转录的整体缺陷。事实上，mRNA合成的全局性降低可能被mRNA降解速率的同步下降所补偿，从而恢复正常的稳态水平。因此，独立于mRNA降解的全基因组mRNA合成定量，是反映RNA聚合酶II转录活性的最佳直接指标。本文介绍一种在Saccharomyces cerevisiae（S. cerevisiae）中对新生RNA进行非干扰性代谢标记的方法。具体而言，细胞在含有尿嘧啶类似物4-硫尿嘧啶的培养基中培养6分钟，随后纯化并定量标记的新生转录RNA，以测定每种个体mRNA的合成速率。此外，通过使用标记的Schizosaccharomyces pombe细胞作为内参标准，可实现不同S. cerevisiae菌株间mRNA合成水平的比较。结合本实验方案，并将数据拟合至动态动力学模型，还可推导出相应的mRNA降解速率。

在进行新转录RNA的代谢标记时，需要控制多个方面：标记的时间和效率、外参加入比例、提取方案以及生物素化效率（包括信噪比）等。这些条件已被其他研究者广泛而系统地验证过7,10,11。本文主要关注样本经RT-qPCR、微阵列或测序处理后可立即进行的数据解读与初步分析。对不同突变菌株的分析表明，该方法不仅能够检测到mRNA合成的显著全局性下降（例如在SAGA突变的S. cerevisiae菌株中），还能在组蛋白H2B单泛素化受到抑制时，检测到RNA聚合酶II活性的轻微降低。
我们对SAGA酶活性的分析表明其在染色质上具有广泛的招募作用15，而这一现象在SAGA突变株的稳态mRNA水平分析中并未显现。由于SAG...

本文所述方案基于对经4-硫尿嘧啶标记的酵母细胞中纯化的新生mRNA进行全基因组水平的定量分析。该方法能够将mRNA合成与mRNA降解过程分离，从而准确测量RNA聚合酶II的转录活性。

Saccharomyces cerevisiae 中利用 4-硫代尿嘧啶进行代谢标记及新合成 mRNA 的定量作为 RNA 聚合酶 II 活性的替代指标

RNA聚合酶II转录的全局性缺陷可能会被分析稳态RNA的转录组学研究忽略。事实上，……的全局性下降

该技术的主要优势在于通过检测新合成的mRNA来反映RNA聚合酶II的活性，从而避免了RNA降解带来的影响。该方案最初采用微阵列杂交技术进行描述，但也可轻松适用于新转录mRNA的高通量测序。本实验操作将由本实验室前研究生Tiago Baptista进行演示。接种酿酒酵母（S.cerevisiae）细胞后，在30摄氏度下以150转/分钟的恒定振荡培养过夜。次日，测定600纳米处的光密度值。将培养物用100毫升YPD培养基稀释至OD600约为0.1。将细胞培养至 OD600 约为 0.8。随后，测定 S.pombe 过夜培养物的 OD600。将该培养物用 500 毫升 YAS 培养基稀释至 OD600 约为 0.1，并继续培养至 OD600 约为 0.8。首先，配制新鲜的 2 M 四硫尿嘧啶溶液。将配制好的溶液置于室温下，并避光保存。向酿酒酵母（S.cerevisiae）和粟酒裂殖酵母（S.pombe）培养物中加入四硫尿嘧啶溶液，使其终浓度为 5 mM。将酿酒酵母（S.cerevisiae）和粟酒裂殖酵母（S.pombe）培养物分别在30°C和32°C下以恒定振荡培养六分钟。随后，分别取少量培养物，使用自动细胞计数器或血球计数板进行细胞计数。在2,500 × g、4°C条件下离心五分钟，收集细胞。弃去上清液，用冰预冷的1× PBS洗涤细胞一次。在2,500 × g、4 °C条件下离心5分钟。随后，将细胞重悬于5 mL冰预冷的1× PBS中。将酿酒酵母（S.cerevisiae）和裂殖酵母（S.pombe）细胞按三比一的比例混合。在4°C条件下，以2,500 × g离心混合样品5分钟。然后弃去PBS，将细胞在液氮中迅速冷冻。将样品保存在负80摄氏度，直至准备使用。准备进行下一步时，将细胞置于冰上解冻约20至30分钟。按照文本方案中的说明，使用改良的酵母RNA提取试剂盒提取RNA。此后，将滤芯转移至最终收集管中。用 50 微升预热至 100 摄氏度的经 DEPC 处理的无 RNase 水洗脱 RNA。在 16,000 × g 离心 1 分钟。然后使用 50 µL 预热的经 DEPC 处理的无 RNase 水，再次将 RNA 洗脱至同一离心管中。以 16,000 × g 离心 1 分钟，确保全部样品体积均已通过滤膜。若未完全通过，则延长离心时间再次离心。实验完成后，使用适当的设备对样品进行定量并检测其纯度。使用经DEPC处理的无核酸酶水将先前获得的RNA浓度调整至2毫克/毫升。分装200微克总RNA，并在60摄氏度加热10分钟。立即在冰上冷却两分钟。加入 600 µL 经 DEPC 处理的无 RNase 水。加入 100 µL 生物素化缓冲液，然后加入 200 µL 生物素 HPDP。如果生物素HPDP溶液从溶液中析出沉淀，可按照文本方案所述，将DMSO或DMF的体积增

saccharomyces-cerevisiae-metabolic-labeling-with-4-thiouracil

Research

科研

JoVE Journal

Genetics

遗传学

酿酒酵母4-硫尿嘧啶代谢标记及新合成 mRNA 作为 RNA 聚合酶 II. 活性的一种代理

总细胞RNA作为研究RNA合成与降解的短期变化以及RNA加工动力学的模板效果较差。本文介绍了一种利用4-硫代尿苷对新转录RNA进行代谢标记，随后通过巯基特异性生物素化并纯化新转录RNA的方法，从而克服上述局限性。...

细胞培养中新生转录RNA的代谢标记：用于高分辨率RNA合成、加工与降解的基因表达谱分析

本方案描述了一种进行荧光检测的实验操作流程 原位...

mRNA分子的荧光可视化与分析 原位 杂交在 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）

本文描述了利用萤火虫荧光素酶-GFP融合蛋白进行研究的方法 体内 蛋白质折叠在...

监测蛋白质复性过程的偶联检测方法 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）

特定mRNA的稳态水平由其合成速率和降解速率共同决定。通过测定mRNA的半衰期，可测量全基因组范围内的mRNA降解速率或特定mRNA的降解速率。本方案重点介绍在Saccharomyces...

使用 rpb1-1 菌株测定 Saccharomyces cerevisiae 中 mRNA 降解速率

本方案描述了染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）、4-硫代尿苷测序（4sU-seq）、总RNA测序（total...

转录因子结合、转录、翻译及降解的实时分析以展示细胞激活过程中的全局事件

利用硫代尿嘧啶从酵母Saccharomyces...

体内利用4-硫尿嘧啶进行极快速且特异的RNA代谢标记（Ers4tU）

面包酵母线粒体基因组编码八种多肽。本实验方案的目标是对所有这些多肽进行标记，随后将它们作为独立的条带进行可视化观察。...

酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）线粒体基因组表达产物的标记与可视化

本文介绍了一种利用14C-乙酸对酵母进行代谢标记的实验方案，并结合薄层色谱法分离中性脂质。...

中性脂质合成分析 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae） 通过代谢标记和薄层色谱法

我们描述了两种互补的实验方案，可准确测定S期持续时间 S. cerevisiae 使用EdU（一种胸苷类似物），其可被掺入 体内...

利用5-乙炔基-2'-脱氧尿苷掺入法测定酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的S期持续时间

RNA二级结构主要通过结构探针技术在成熟RNA中进行观察。共转录结构追踪测序技术（CoSTseq）将已用于研究聚合酶在新生RNA上位置的核内延伸技术与结构探针技术相结合，从而实现了对处于活跃转录过程中的RNA的二级结构的观测。...

新生转录本与成熟转录本的RNA结构比较分析 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）

学习利用4-硫尿嘧啶代谢标记技术定量分析酿酒酵母新合成mRNA的方法，以RNA聚合酶II活性为指标。该技术可准确测量转录水平，不受RNA降解影响，适用于高通量测序研究基因表达调控。

Saccharomyces cerevisiae 中利用 4-硫代尿嘧啶进行代谢标记及新合成 mRNA 的定量作为 RNA 聚合酶 II 活性的替代指标

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