Name: 酿酒酵母4-硫尿嘧啶代谢标记及新合成 mRNA 作为 RNA 聚合酶 II. 活性的一种代理 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 21 s
Description: 学习利用4-硫尿嘧啶代谢标记技术定量分析酿酒酵母新合成mRNA的方法，以RNA聚合酶II活性为指标。该技术可准确测量转录水平，不受RNA降解影响，适用于高通量测序研究基因表达调控。

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我们感谢拉斯洛·托拉（Laszlo Tora）的支持，以及 V. Fisher、K. Schumacher 和 F. El Saafin 的有益讨论。T.B. 获得了玛丽·居里-ITN 奖学金（PITN-GA-2013-606806，NR-NET）和 ARC 基金会的资助。本工作得到了法国国家科研署（ANR-15-CE11-0022 SAGA2）基金的支持。本研究还得到了法国国家科研署管理的“未来投资计划”框架项目（ANR-10-IDEX-0002-02）下的法国国家科研署卓越实验室基金（ANR-10-LABX-0030-INRT）的支持。

1. 细胞培养及SAGA亚基的雷帕霉素耗竭
<ol>
	<li>对于每种 S. cerevisiae 菌株及重复实验，包括野生型或对照菌株，从新鲜平板上挑取单菌落接种至 5 mL YPD 培养基（2% 蛋白胨、1% 酵母提取物和 2% 葡萄糖）中。</li>
	<li>在 30 °C 条件下，以持续振荡（150 rpm）培养 S. cerevisiae 细胞过夜。</li>
	<li>测定 600 nm 处的光密度（OD600），并将菌液用 YPD 培养基稀释至 OD600 约为 0.1，总体积为 100 mL，继续培养至 OD600 达到约 0.8。</li>
	<li>同时，从新鲜平板上挑取一单菌落 S. pombe 细胞接种至 50 mL YES 培养基（0.5% 酵母提取物；250 mg/L 腺嘌呤、组氨酸、尿嘧啶、亮氨酸和赖氨酸；3% 葡萄糖）中，并在 32 °C 条件下以持续振荡（150 rpm）过夜培养。</li>
	<li>测定 S. pombe 过夜培养物的 OD600，并将菌液用 YES 培养基稀释至 OD600 约为 0.1，总体积为 500 mL，继续培养至 OD600 约为 0.8。</li>
	<li>对于每种 S. cerevisiae 锚定去除（anchor-away）菌株及重复实验，包括野生型或对照菌株，从新鲜平板上挑取单菌落接种至 5 mL YPD 培养基（2% 蛋白胨、1% 酵母提取物和 2% 葡萄糖）中。</li>
	<li>在 30 °C 条件下以持续振荡（150 rpm）过夜培养细胞。</li>
	<li>次日早晨，测定 OD600，将菌液用 YPD 培养基稀释至 OD600 约为 0.1，总体积为 100 mL，并继续培养至 OD600≈ 0.8。</li>
	<li>向菌液中加入 100 µL 雷帕霉素（来自 1 mg/mL 的储存液，终浓度为 1 µg/mL），并在 30 °C 条件下持续振荡孵育一定时间，以实现目标蛋白在细胞核中的条件性耗竭（通常 30 分钟已足够）。对照组使用类似的酵母培养物，不添加雷帕霉素，而是加入等体积的二甲基亚砜（DMSO）。</li>
</ol>
2. 以 S. pombe 作为内参的 4tU 标记（计数）
<ol>
	<li>配制新鲜的2 M 4-硫代尿嘧啶溶液。配制完成后，于室温避光保存。
	<ol>
		<li>准确称取每份 64.1 mg 的 4-硫代尿嘧啶 S. cerevisiae 培养并溶于250 µL二甲基甲酰胺（DMF）或250 µL DMSO中。</li>
		<li>对于 S. pombe 将用于加标对照的培养物，称取320.5 mg的4-硫代尿嘧啶，溶于1,250 µL DMSO中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>加入4-硫代尿嘧啶溶液 S. cerevisiae 和 S. pombe 培养物中加入终浓度为5 mM的试剂，并分别在30 °C和32 °C下持续振荡孵育6分钟。</li>
	<li>6分钟后，从每种培养物中取出少量样品用于细胞计数。使用自动细胞计数仪或血球计数板进行细胞计数。</li>
	<li>通过离心收集细胞（2,500 x g在 4 °C 下离心 5 分钟。</li>
	<li>弃去上清液，用预冷的1×PBS洗涤细胞，再次离心（2,500 × g，4 °C，5 分钟。</li>
	<li>计算每个中的细胞总数 S. cerevisiae 和 S. pombe 样本。</li>
	<li>将细胞重悬于 5 mL 冰冷的 1x PBS 中并混匀 S. cerevisiae 与 S. pombe 细胞以3:1的比例混合。</li>
	<li>离心细胞（2,500 x g，4 °C，5 分钟），移除 PBS，将细胞在液氮中速冻2并将样品于 -80 °C 保存，直至后续使用。</li>
</ol>
3. RNA 提取与DNase处理
<ol>
	<li>将细胞在冰上解冻约20–30分钟。</li>
	<li>使用酵母RNA提取试剂盒进行RNA提取材料表)并稍作修改。</li>
	<li>每个样品中，向试剂盒提供的1.5 mL螺口管加入750 µL预冷的氧化锆珠。请注意，每管可提取最多10个9 细胞可以被高效提取。因此，应为每个样本准备所需的试管数量。例如，一个 S. cerevisiae 100 mL 培养液（OD600≈ 0.8）可产生约 2 × 109 至 3 × 109 细胞，总计达到 2.7 x 109 至 4 × 109 总共的细胞数（在加入三分之一的 spike-in 后） S. pombe 细胞）。在这种情况下，每个样本/条件/突变体/重复需要准备3-4个反应管。</li>
	<li>每 1 x 109 细胞中加入480 µL试剂盒提供的裂解缓冲液、48 µL 10% SDS以及480 µL苯酚:氯仿:异戊醇（25:24:1，v/v/v）。</li>
	<li>使用涡旋混合器混匀细胞，然后转移至含有冰冻氧化锆珠的离心管中。</li>
	<li>将试管置于涡旋混合器适配器上，在4 °C室温下以最大速度涡旋振荡10分钟，以裂解酵母细胞。或者，可使用自动珠磨破碎仪进行细胞裂解。</li>
	<li>在16,000下离心试管 x g 室温孵育5分钟，小心收集上层相（含RNA相）至新的15 mL离心管中。通常每管回收的体积约为500–600 µL。</li>
	<li>向含有部分纯化RNA的15 mL离心管中加入试剂盒提供的结合缓冲液，并充分混匀。每100 µL RNA溶液加入350 µL结合缓冲液（即，当水相溶液体积为600 µL时，应加入2.1 mL结合缓冲液。</li>
	<li>向上述混合物中加入100%乙醇并充分混匀。每100 µL RNA溶液加入235 µL 100%乙醇（即，当水相溶液体积为600 µL时，加入1.41 mL乙醇。</li>
	<li>将步骤3.9中所得混合物最多700 µL加入滤芯中，滤芯置于收集管内，两者均由试剂盒提供。</li>
	<li>离心1分钟，16,000 x g如果离心时间不足以使全部体积通过滤膜，则重复离心30秒。</li>
	<li>弃去穿流液，并重复使用同一收集管。向滤膜中加入700 µL RNA结合缓冲液-乙醇溶液，再次于16,000 x g离心 g 1 分钟。</li>
	<li>弃去穿流液，重复步骤 3.11 和 3.12，直至完成全部 RNA 溶液处理。</li>
	<li>用700 µL洗涤液1洗涤滤膜2次，收集洗涤液。 通过 16,000 x 离心 g 1 分钟，并始终保留收集管。</li>
	<li>用500 µL洗涤液2洗涤滤膜2次，收集洗涤液。 通过 16,000 x 离心 g 1 分钟，并始终保留收集管。</li>
	<li>再次以16,000 x g离心试管 g 1分钟，以彻底干燥滤膜。</li>
	<li>将滤芯转移至最终收集管（适用于RNA的管子），用50 µL经DEPC处理且无RNase的H₂O洗脱RNA2O（预热至100 °C）。</li>
	<li>离心1分钟，16,000 x g.</li>
	<li>用 50 µL 预热的 DEPC 处理、无 RNase 的 H₂O 再次洗脱 RNA（至同一管中）2O. 确保所有液体体积均已通过滤膜；否则，延长离心时间。</li>
	<li>若一个样本使用了多个试管，需将所有试管中的样本合并至一个试管中。</li>
	<li>使用适当的设备对样品进行定量并检测其纯度。 
	注意：虽然4tU仅掺入新合成的RNA中，但仍可能存在少量DNA污染。因此，建议始终用DNase I处理样品。可使用RNA提取试剂盒中提供的试剂进行处理材料表按照制造商的建议进行。</li>
</ol>
4. 新合成RNA的硫醇特异性生物素标记
<ol>
	<li>将按照本方案第3节获得的RNA浓度调整至2 mg/mL。取200 µg总RNA，于60 °C加热10分钟，立即置于冰上冷却2分钟。</li>
	<li>向RNA分装液中按以下顺序加入下列试剂：600 µL经DEPC处理且无RNase的H2O、100 µL生物素化缓冲液（含100 mM Tris-HCl [pH 7.5] 和10 mM EDTA，溶于经DEPC处理且无RNase的H2O中）、以及200 µL来自1 mg/mL生物素-HPDP（溶于DMSO或DMF）储备液的生物素-HPDP。
	<ol>
		<li>在某些情况下，生物素-HPDP溶液容易发生沉淀，可能是由于其在水中的溶解度较低所致。此时，可将DMSO/DMF的体积增加至反应总体积的40%（向RNA样品中加入400 µL经DEPC处理的H2O、100 µL生物素化缓冲液，以及400 µL来自0.5 mg/mL储备液的生物素-HPDP）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将样品在室温下避光孵育3小时，并轻轻振荡。</li>
	<li>孵育结束后，向各管中加入等体积的氯仿，并剧烈混匀。</li>
	<li>在4 °C条件下，以13,000 x g离心5分钟。此步骤可去除未与RNA结合的过量生物素。或者，可使用相分离锁管（重相型）进行该步骤：先将相分离锁管在13,000 x g下离心1分钟，然后向管中加入RNA混合物和等体积的氯仿，剧烈混匀后，在4 °C、13,000 x g下离心5分钟。</li>
	<li>小心将上层水相转移至新的2 mL离心管中。</li>
	<li>加入终体积十分之一的5 M NaCl，并混匀样品。</li>
	<li>加入等体积的异丙醇，充分混匀后，在4 °C、13,000 x g下离心至少30分钟。</li>
	<li>小心弃去上清液，加入1 mL预冷的75%乙醇。</li>
	<li>在4 °C条件下，以13,000 x g离心10分钟。</li>
	<li>小心弃去上清液，短暂离心后，彻底去除残留的乙醇溶液。注意确保RNA沉淀不干燥。</li>
	<li>将RNA溶解于100 µL经DEPC处理且无RNase的H2O中。</li>
</ol>
5. 使用链霉亲和素包被的磁珠从总RNA和未标记RNA中纯化新合成的RNA组分
<ol>
	<li>将生物素标记的RNA在65 °C下加热10分钟，然后将样品置于冰上冷却5分钟。</li>
	<li>向生物素标记的RNA（终体积为200 µL）中加入100 µL链霉亲和素包被的磁珠。特别建议使用材料表中列出的磁珠，因为根据与其他实验室的交流，这些磁珠表现出更高的稳定性和可靠性。</li>
	<li>在室温下轻轻振荡孵育样品90分钟。</li>
	<li>将试剂盒提供的柱子（材料表）放置于磁力架上。</li>
	<li>向柱子中加入900 µL室温洗涤缓冲液（含100 mM Tris-HCl [pH 7.5]、10 mM EDTA、1 M NaCl和0.1% Tween 20的DEPC处理且无RNase的H2O溶液），并预先冲洗和平衡柱子。</li>
	<li>将磁珠/RNA混合物（200 µL）加入柱子中。</li>
	<li>收集穿流液至1.5 mL离心管中，并将其再次加入同一磁力柱中。如有需要，可保留此穿流液，因其代表未标记的RNA组分。</li>
	<li>用逐渐增加体积的洗涤缓冲液（600、700、800、900和1,000 µL）洗涤柱子5次。</li>
	<li>用200 µL 0.1 M DTT洗脱新合成的RNA。</li>
	<li>3分钟后，用等体积的0.1 M DTT进行第二次洗脱。</li>
	<li>洗脱RNA后，加入0.1倍体积的3 M NaOAc（pH 5.2）、3倍体积的预冷100%乙醇以及2 µL 20 mg/mL糖原（RNA级），并在-20 °C下过夜沉淀RNA。</li>
	<li>通过离心（4 °C下13,000 x g离心10分钟）回收RNA，并将其重悬于15 µL DEPC处理且无RNase的H2O中。标记RNA占总RNA的比例预计约为2%–4%（通常偏向较低范围），可获得约2.0 µg的新合成RNA。该产量足以进行多次qPCR实验，也可用于微阵列或测序分析。</li>
</ol>
6. 不同组分的 RT-qPCR 验证
<ol>
	<li>根据制造商的说明（材料表），使用随机六聚体引物和选定的逆转录酶，从 2 µg 总 RNA 或 10 µL 标记 RNA 中合成 cDNA。</li>
	<li>采用标准方案通过实时定量 PCR 扩增 cDNA（材料表）。 
	注意：所有样品应至少来自两个生物学重复，并每个设置三个技术重复。所有原始数据需根据 S. pombe 微管蛋白基因的表达水平进行校正。</li>
</ol>
7. 微阵列杂交
<ol>
	<li>根据制造商说明，将RNA样本杂交至选定的微阵列芯片上（本具体方案参见材料表）。简言之，使用Premier RNA扩增试剂盒（材料表）按照制造商说明，从150 ng RNA制备生物素标记的cRNA靶标。将4 mg片段化的cRNA在45 °C、60 rpm条件下于微阵列芯片上杂交16小时。</li>
	<li>使用指定的洗涤站和扫描仪（材料表）对芯片进行洗涤、染色和扫描。利用命令控制台（AGCC，版本4.1.2）从扫描图像中提取原始数据（CEL信号强度文件）。</li>
	<li>使用Expression Console软件（版本1.4.1）进一步处理CEL文件，采用基于统计学的MAS 5.0算法（默认参数）并以全局标准化法进行归一化，计算探针组的信号强度。 
	注意：每张芯片的修剪平均目标信号强度被任意设定为100。所有实验均应至少进行两次独立的生物学重复。将原始数据归一化至S. pombe信号，并计算总RNA和新合成RNA水平的倍数变化。</li>
</ol>
8. 使用现有 R 分析流程进行数据分析
<ol>
	<li>使用公开可用的分析流程和 R/Bioconductor 软件包计算合成速率和降解速率，方法如前所述8,10。</li>
</ol>

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<li>Schwalb, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TT-seq+maps+the+human+transient+transcriptome%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">TT-seq maps the human transient transcriptome.</a> Science. 352 (6290), 1225-1228 (2016).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

尽管全基因组水平分析转录变化的工具仍在不断改进，但仅通过定量RNA稳态水平来分析转录组，可能无法准确反映RNA聚合酶II活性的变化。事实上，mRNA水平不仅受RNA合成的调控，还受到其成熟和降解过程的影响。为了在排除mRNA降解干扰的情况下测量mRNA的合成，近年来已开发出多种不同的实验方案，用于分析酵母和哺乳动物中的新生转录。
用于定量新生转录的最广泛使用方案之一是GRO-seq1。尽管GRO-seq的主要优势在于能够以高分辨率和低背景揭示处于转录活跃状态的RNA聚合酶，但它存在两个明显缺点，降低了其吸引力：（i）该技术操作难度较高，需要分离细胞核；（ii）细胞核的操作会对系统引入一定干扰28。另一种替代方法是NET-seq，该方法依赖于对新生RNA、模板DNA和RNA聚合酶II之间形成的极为稳定的三元复合物进行免疫沉淀，随后对所获得转录本的3'末端进行测序。该方法能够在单碱基分辨率下表征新生RNA，并可通过免疫沉淀修饰形式的RNA聚合酶II（例如丝氨酸-5磷酸化）来研究mRNA加工事...

细胞通过动态改变其基因表达程序，对内源性和外源性信号作出响应。近年来，全基因组范围的研究方法取得了巨大进展，使得能够在不同条件下精确而全面地描述转录组的变化。在大多数转录组学研究中，通常采用微阵列杂交或高通量测序技术来定量总稳态RNA组分中的RNA水平。在特定扰动下的转录变化可能表现出多种结果，包括特定基因的表达改变，或大量基因的上调或下调。基因表达是RNA聚合酶及其他影响RNA水平的过程共同作用所形成的精细调控平衡——即稳态——的结果。RNA聚合酶II的转录过程包含三个不同阶段（起始、延伸和终止），并与mRNA加工、胞质转运、翻译及降解过程高度关联且相互交织。
最近的多项研究表明，mRNA 的合成与降解是相互偶联的机制，且在量化总稳态 RNA 时，可能会忽略突变或刺激条件下的转录效应。首先，通过分析 mRNA 稳态水平来检测转录变化，始终依赖于 mRNA 的半衰期。一旦引入扰动，具有较长半衰期的 mRNA 的稳态水平受到的影响远小于半衰期较短的 mRNA。因此，对 RNA 合成变化的检测明显偏向于短寿命转录本，而对长寿命 mRNA 物种的分析可能无法揭示转录速率的动态变化。其次，已有若干研究报道，在酵母和哺乳动物中，分析 mRNA 稳态水平时可能忽略转录的全局性变化。这很可能是由于 mRNA 合成与降解之间存在偶联机制，导致 mRNA 水平被缓冲所致。上述局限性促使研究人员开发了新的实验方案，通过分析新转录的 mRNA 来独立于降解过程地定量 mRNA 合成。近年来，已提出多种替代方法，包括全局延伸测序（GRO-seq）1 和天然延伸转录本测序（NET-seq）2,3。本文介绍的方案最初在哺乳动物细胞中建立4,5,6，随后被改进并适用于酵母7,8,9,10,11，其原理基于使用硫代核苷或碱基类似物 4-硫代尿苷（4sU）或 4-硫代尿嘧啶（4tU）对 RNA 进行标记。
该方法可特异性纯化在细胞中经4sU脉冲标记的新生RNA，且几乎不会干扰细胞的稳态。因此，当细胞暴露于4sU后，该分子会迅速被细胞摄取，并磷酸化为4sU-三磷酸，进而掺入正在转录的RNA中。完成脉冲标记后，可提取总细胞RNA（对应RNA的稳态水平），随后对4sU标记的RNA组分进行巯基特异性修饰，从而在生物素与新生转录的RNA之间形成二硫键4,5。然而，只有表达核苷转运蛋白（如人平衡型核苷转运蛋白hENT1）的细胞才能摄取4sU，这限制了其在芽殖酵母或裂殖酵母中的直接应用。尽管可以在S. pombe或S. cerevisiae中异源表达hENT1，但更简便的方法是使用修饰碱基4tU，因为酵母细胞能够直接摄取4tU，无需额外表达核苷转运蛋白10,11,12,13。事实上，4tU的代谢依赖于尿嘧啶磷酸核糖转移酶（UPRT）的活性。在包括酵母在内的多种生物中（但哺乳动物除外），UPRT是嘧啶补救途径中的关键酶，负责将尿嘧啶回收转化为尿苷一磷酸。
在并行分析不同样本的转录组研究中，样本间的归一化可能引入重要偏差。事实上，多种偏差因素可影响突变株与野生型菌株转录组的比较分析：细胞裂解效率、RNA提取与回收率的差异，以及微阵列分析中扫描仪校准的变异等。如上所述，当预期对RNA聚合酶II转录产生全局性影响时，此类变异尤其容易导致错误结论。为精确比较不同样本间的mRNA合成速率，研究人员设计了一种巧妙的方法，即利用进化关系较远的裂殖酵母 裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe） 作为内标。为此，使用固定数量的标记 S. pombe 细胞被添加到 S. cerevisiae 样品，包括野生型或突变型细胞，在细胞裂解和RNA提取之前10随后，分别提取稳态和新合成的RNA S. pombe 和 S. cerevisiae 通过 RT-qPCR 或其他方法进行定量 通过 微阵列芯片或高通量测序的使用10结合这些数据与动力学建模，可测定酿酒酵母中mRNA合成与降解的绝对速率。
在本论文的框架中，我们将展示新转录RNA的分析如何揭示共激活因子复合物SAGA和TFIID在芽殖酵母RNA聚合酶II转录中的全局性作用14,15,16。重要的是，以往的研究通过定量酿酒酵母（S. cerevisiae）中mRNA的稳态水平，提出SAGA主要在一组有限的酵母基因上发挥功能，这些基因对SAGA的突变高度敏感，但对TFIID突变相对耐受17,18,19。然而，令人意外的是，SAGA的酶活性被证明作用于整个转录基因组，提示该共激活因子在RNA聚合酶II转录中具有更广泛的作用。当SAGA或TFIID失活时，大多数表达基因上的RNA聚合酶II招募减少，表明这两种共激活因子在大多数基因上协同发挥作用。因此，对新转录mRNA的定量分析揭示，SAGA和TFIID对于RNA聚合酶II介导的几乎所有基因的转录都是必需的14,15,16。补偿机制的启动成为细胞应对mRNA合成全局性下降的一种方式，这种下降被mRNA降解的同步全局性降低所缓冲。SAGA因此加入了一系列对RNA聚合酶II转录具有全局影响的因子行列，包括RNA聚合酶II亚基10、Mediator共激活复合物20、通用转录因子TFIIH21,22，以及间接参与的mRNA降解机制组分9,10,23。这类补偿事件在SAGA突变体中普遍存在，解释了尽管mRNA合成出现全局性且严重的下降，但稳态mRNA水平的变化却较为轻微且有限的现象14。类似分析也在BRE1基因缺失菌株中进行，导致组蛋白H2B泛素化的完全丧失。有趣的是，在缺乏Bre1的情况下，仍可检测到较轻微但一致的RNA聚合酶II转录全局效应，表明在酵母中对新转录RNA进行代谢标记能够检测并量化mRNA合成速率的广泛变化。

<table><tbody><tr><td>4-硫代尿嘧啶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat# 440736</td><td></td></tr><tr><td>雷帕霉素</td><td>Euromedex</td><td>Cat# SYN-1185</td><td></td></tr><tr><td>Countess II FL 全自动细胞计数仪</td><td>ThermoFisher</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>RiboPure RNA 纯化试剂盒（酵母）</td><td>ThermoFisher</td><td>Cat# AM1926</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 2000 分光光度计</td><td>ThermoFisher</td><td>ND-2000</td><td></td></tr><tr><td>TURBO DNA-free 试剂盒</td><td>ThermoFisher</td><td>AM1907</td><td></td></tr><tr><td>EZ-Link HPDP 生物素</td><td>ThermoFisher</td><td>Cat# 21341</td><td></td></tr><tr><td>硫芦丁</td><td>Abcam</td><td>ab143556</td><td></td></tr><tr><td>&amp;micro;MACS 链霉亲和素试剂盒</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>Cat# 130-074-101</td><td></td></tr><tr><td>Transcriptor 逆转录酶</td><td>Roche</td><td>03 531 295 001</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Green I Master</td><td>Roche</td><td>4707516001</td><td></td></tr><tr><td>GeneChip 酵母基因组 2.0 芯片</td><td>ThermoFisher</td><td>900555</td><td></td></tr><tr><td>GeneChip 液体处理工作站 450</td><td>ThermoFisher</td><td>00-0079</td><td></td></tr><tr><td>GeneChip 扫描仪 3000 7G</td><td>ThermoFisher</td><td>00-0210</td><td></td></tr></tbody></table>

saccharomyces cerevisiae 中利用 4-硫代尿嘧啶进行代谢标记及新合成 mrna 的定量作为 rna 聚合酶 ii 活性的替代指标

Saccharomyces cerevisiae Metabolic Labeling with 4-thiouracil and the Quantification of Newly Synthesized mRNA As a Proxy for RNA Polymerase II Activity

转录组学研究在分析稳态RNA时，可能会忽略RNA聚合酶II转录的整体缺陷。事实上，mRNA合成的全局性降低可能被mRNA降解速率的同步下降所补偿，从而恢复正常的稳态水平。因此，独立于mRNA降解的全基因组mRNA合成定量，是反映RNA聚合酶II转录活性的最佳直接指标。本文介绍一种在Saccharomyces cerevisiae（S. cerevisiae）中对新生RNA进行非干扰性代谢标记的方法。具体而言，细胞在含有尿嘧啶类似物4-硫尿嘧啶的培养基中培养6分钟，随后纯化并定量标记的新生转录RNA，以测定每种个体mRNA的合成速率。此外，通过使用标记的Schizosaccharomyces pombe细胞作为内参标准，可实现不同S. cerevisiae菌株间mRNA合成水平的比较。结合本实验方案，并将数据拟合至动态动力学模型，还可推导出相应的mRNA降解速率。

在进行新转录RNA的代谢标记时，需要控制多个方面：标记的时间和效率、外参加入比例、提取方案以及生物素化效率（包括信噪比）等。这些条件已被其他研究者广泛而系统地验证过7,10,11。本文主要关注样本经RT-qPCR、微阵列或测序处理后可立即进行的数据解读与初步分析。对不同突变菌株的分析表明，该方法不仅能够检测到mRNA合成的显著全局性下降（例如在SAGA突变的S. cerevisiae菌株中），还能在组蛋白H2B单泛素化受到抑制时，检测到RNA聚合酶II活性的轻微降低。
我们对SAGA酶活性的分析表明其在染色质上具有广泛的招募作用15，而这一现象在SAGA突变株的稳态mRNA水平分析中并未显现。由于SAG...

本文所述方案基于对经4-硫尿嘧啶标记的酵母细胞中纯化的新生mRNA进行全基因组水平的定量分析。该方法能够将mRNA合成与mRNA降解过程分离，从而准确测量RNA聚合酶II的转录活性。

Saccharomyces cerevisiae 中利用 4-硫代尿嘧啶进行代谢标记及新合成 mRNA 的定量作为 RNA 聚合酶 II 活性的替代指标

RNA聚合酶II转录的全局性缺陷可能会被分析稳态RNA的转录组学研究忽略。事实上，……的全局性下降

该技术的主要优势在于通过检测新合成的mRNA来反映RNA聚合酶II的活性，从而避免了RNA降解带来的影响。该方案最初采用微阵列杂交技术进行描述，但也可轻松适用于新转录mRNA的高通量测序。本实验操作将由本实验室前研究生Tiago Baptista进行演示。接种酿酒酵母（S.cerevisiae）细胞后，在30摄氏度下以150转/分钟的恒定振荡培养过夜。次日，测定600纳米处的光密度值。将培养物用100毫升YPD培养基稀释至OD600约为0.1。将细胞培养至 OD600 约为 0.8。随后，测定 S.pombe 过夜培养物的 OD600。将该培养物用 500 毫升 YAS 培养基稀释至 OD600 约为 0.1，并继续培养至 OD600 约为 0.8。首先，配制新鲜的 2 M 四硫尿嘧啶溶液。将配制好的溶液置于室温下，并避光保存。向酿酒酵母（S.cerevisiae）和粟酒裂殖酵母（S.pombe）培养物中加入四硫尿嘧啶溶液，使其终浓度为 5 mM。将酿酒酵母（S.cerevisiae）和粟酒裂殖酵母（S.pombe）培养物分别在30°C和32°C下以恒定振荡培养六分钟。随后，分别取少量培养物，使用自动细胞计数器或血球计数板进行细胞计数。在2,500 × g、4°C条件下离心五分钟，收集细胞。弃去上清液，用冰预冷的1× PBS洗涤细胞一次。在2,500 × g、4 °C条件下离心5分钟。随后，将细胞重悬于5 mL冰预冷的1× PBS中。将酿酒酵母（S.cerevisiae）和裂殖酵母（S.pombe）细胞按三比一的比例混合。在4°C条件下，以2,500 × g离心混合样品5分钟。然后弃去PBS，将细胞在液氮中迅速冷冻。将样品保存在负80摄氏度，直至准备使用。准备进行下一步时，将细胞置于冰上解冻约20至30分钟。按照文本方案中的说明，使用改良的酵母RNA提取试剂盒提取RNA。此后，将滤芯转移至最终收集管中。用 50 微升预热至 100 摄氏度的经 DEPC 处理的无 RNase 水洗脱 RNA。在 16,000 × g 离心 1 分钟。然后使用 50 µL 预热的经 DEPC 处理的无 RNase 水，再次将 RNA 洗脱至同一离心管中。以 16,000 × g 离心 1 分钟，确保全部样品体积均已通过滤膜。若未完全通过，则延长离心时间再次离心。实验完成后，使用适当的设备对样品进行定量并检测其纯度。使用经DEPC处理的无核酸酶水将先前获得的RNA浓度调整至2毫克/毫升。分装200微克总RNA，并在60摄氏度加热10分钟。立即在冰上冷却两分钟。加入 600 µL 经 DEPC 处理的无 RNase 水。加入 100 µL 生物素化缓冲液，然后加入 200 µL 生物素 HPDP。如果生物素HPDP溶液从溶液中析出沉淀，可按照文本方案所述，将DMSO或DMF的体积增加至反应总体积的40%。避光保护样品，并在室温下轻轻振荡孵育三小时。此后，向各管中加入与水相大致等体积的氯仿，剧烈混合。在 13,000 ×g 及 4 °C 条件下离心 5 分钟。随后，小心地将上层相转移至新的 2 mL 离心管中。加入约等于样品体积 1/10 的 5 mol/L 氯化钠溶液。然后混合样品。首先，将生物素标记的RNA在65摄氏度加热10分钟。随后将样品置于冰上冷却5分钟。向生物素标记的 RNA 中加入 100 微升链霉亲和素包被的磁珠。在室温下轻轻振荡孵育 90 分钟。将试剂盒提供的柱子置于磁力架上。接下来，向柱中加入 900 微升室温洗涤缓冲液。将 200 微升磁珠与 RNA 混合物加入柱中。用 1.5 毫升离心管收集穿流液，然后将其再次加入同一磁力柱中。如有需要，保留此流穿液，因其代表未标记的RNA组分。为开始对不同组分进行RT-qPCR验证，首先按照文中所述合成cDNA，然后采用标准方案通过实时qPCR扩增cDNA。通过检测在有或无四硫尿嘧啶培养的野生型细胞中分离得到的组分中的转录本水平，证实该方法可特异性纯化标记的RNA。对spt20 delta突变株的分析显示，所检测基因的总稳态RNA量基本不变或仅有轻微减少。在bre1基因缺失的菌株中也观察到类似结果。然而，对 spt20 delta 菌株中新转录的 RNA 进行分析显示，所有检测基因的 mRNA 合成减少了三到五倍。与此同时，bre1 的缺失导致更轻微但仍可见的减少。在诱导性耗竭 saga 复合物的结构亚基 spt7 后，新转录的 mRNA 水平降低程度与缺失菌株相似。通过全基因组分析检测总RNA水平时，仅发现少数基因在删除spt20后其表达水平发生改变，表现为上调或下调。然而，对新转录RNA的分析显示，在删除spt20后，超过4,000个基因的表达水平显著降低至少两倍，这表明SAGA复合物在芽殖酵母中对RNA聚合酶II的转录具有全局性的正向调控作用。尽管该方法可为酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的转录研究提供深入见解，但此前仅以微小变异的形式应用于其他体系。通过使用本方案，我们能够检测到mRNA合成的全局性下降，而这一变化被mRNA降解速率的全局性降低所补偿。

saccharomyces-cerevisiae-metabolic-labeling-with-4-thiouracil

Research

科研

JoVE Journal

Genetics

遗传学

酿酒酵母4-硫尿嘧啶代谢标记及新合成 mRNA 作为 RNA 聚合酶 II. 活性的一种代理

总细胞RNA作为研究RNA合成与降解的短期变化以及RNA加工动力学的模板效果较差。本文介绍了一种利用4-硫代尿苷对新转录RNA进行代谢标记，随后通过巯基特异性生物素化并纯化新转录RNA的方法，从而克服上述局限性。...

细胞培养中新生转录RNA的代谢标记：用于高分辨率RNA合成、加工与降解的基因表达谱分析

本方案描述了一种进行荧光检测的实验操作流程 原位...

mRNA分子的荧光可视化与分析 原位 杂交在 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）

本文描述了利用萤火虫荧光素酶-GFP融合蛋白进行研究的方法 体内 蛋白质折叠在...

监测蛋白质复性过程的偶联检测方法 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）

特定mRNA的稳态水平由其合成速率和降解速率共同决定。通过测定mRNA的半衰期，可测量全基因组范围内的mRNA降解速率或特定mRNA的降解速率。本方案重点介绍在Saccharomyces...

使用 rpb1-1 菌株测定 Saccharomyces cerevisiae 中 mRNA 降解速率

本方案描述了染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）、4-硫代尿苷测序（4sU-seq）、总RNA测序（total...

转录因子结合、转录、翻译及降解的实时分析以展示细胞激活过程中的全局事件

利用硫代尿嘧啶从酵母Saccharomyces...

体内利用4-硫尿嘧啶进行极快速且特异的RNA代谢标记（Ers4tU）

面包酵母线粒体基因组编码八种多肽。本实验方案的目标是对所有这些多肽进行标记，随后将它们作为独立的条带进行可视化观察。...

酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）线粒体基因组表达产物的标记与可视化

本文介绍了一种利用14C-乙酸对酵母进行代谢标记的实验方案，并结合薄层色谱法分离中性脂质。...

中性脂质合成分析 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae） 通过代谢标记和薄层色谱法

我们描述了两种互补的实验方案，可准确测定S期持续时间 S. cerevisiae 使用EdU（一种胸苷类似物），其可被掺入 体内...

利用5-乙炔基-2'-脱氧尿苷掺入法测定酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的S期持续时间

RNA二级结构主要通过结构探针技术在成熟RNA中进行观察。共转录结构追踪测序技术（CoSTseq）将已用于研究聚合酶在新生RNA上位置的核内延伸技术与结构探针技术相结合，从而实现了对处于活跃转录过程中的RNA的二级结构的观测。...

新生转录本与成熟转录本的RNA结构比较分析 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）

学习利用4-硫尿嘧啶代谢标记技术定量分析酿酒酵母新合成mRNA的方法，以RNA聚合酶II活性为指标。该技术可准确测量转录水平，不受RNA降解影响，适用于高通量测序研究基因表达调控。

Saccharomyces cerevisiae 中利用 4-硫代尿嘧啶进行代谢标记及新合成 mRNA 的定量作为 RNA 聚合酶 II 活性的替代指标

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