Name: 小鼠原代多元体的体外模拟？ (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 43 s
Description: 了解小鼠原代运动神经元的分离与转染技术，通过密度梯度离心和磁转染方法实现高纯度培养。该技术为研究运动神经元极性、轴突导向及神经退行性疾病机制提供了可靠的实验平台。

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我们感谢“&#34;神经遗传学发展协会&#34;为Jacquier博士提供的博士后资助，以及AFM-Telethon通过MyoNeurAlp战略计划提供的支持。我们还要感谢Chris Henderson博士、William Camu博士、Brigitte Pettmann博士、Cedric Raoul博士和Georg Haase博士，他们参与了该技术的开发与改进，并传播了相关知识。

所有涉及动物的实验程序均获得本机构伦理委员会的批准。
1. 溶液配制
<ol>
	<li>准备10 mL用L-15培养基透析的4% BSA溶液。
	<ol>
		<li>将牛血清白蛋白粉末以4%（w/v）浓度溶解于10 mL L-15培养基中。</li>
		<li>将溶液加入截留分子量为20 kDa的20 mL透析盒中，于4 °C下在500 mL L-15培养基中透析3天，并持续搅拌。每天更换一次L-15培养基。</li>
		<li>用0.22 µm滤膜过滤溶液，并分装至15 mL离心管中。于-20 °C保存。 
		注：本方案中使用以下命名方式：未修饰的原始L-15培养基 = L-15培养基，酸性L-15培养基 = pH L-15，碱性L-15培养基 = 碳酸氢盐L-15。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>准备200 mL pH L-15培养基。
	<ol>
		<li>调节L-15培养基的pH值：首先，在洗瓶中放入若干块干冰。向L-15培养基中通入气体（CO2），直至溶液变为橙色（约pH 6.4，约40个压力单位）。也可使用标准pH计调节pH值。</li>
		<li>用0.22 µm滤膜过滤培养基，于4 °C保存一个月。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>准备100 mL碳酸氢盐L-15培养基。
	<ol>
		<li>将2.5 mL 7%碳酸氢钠溶液加入97.5 mL L-15培养基中，于4 °C保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>制备IPCS（胰岛素-腐胺-转铁蛋白-亚硒酸钠）补充剂。
	<ol>
		<li>将2.5 mg胰岛素溶解于0.5 mL 0.1 M HCl中，再加入4.5 mL双蒸水。</li>
		<li>将8 mg腐胺溶解于5 mL磷酸盐缓冲液（PBS）中。</li>
		<li>将100 mg转铁蛋白溶解于10 mL PBS中。</li>
		<li>将1 mg亚硒酸钠溶解于19.3 mL水中，调节pH至7.4，然后将溶液稀释10倍。</li>
		<li>取1 mL胰岛素溶液、1 mL腐胺溶液、1 mL转铁蛋白溶液和0.1 mL亚硒酸钠溶液混合，得到3.1 mL IPCS补充剂溶液。于-20 °C保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>制备0.02 mM孕酮溶液。
	<ol>
		<li>将1 mg孕酮溶解于1.6 mL 80%乙醇中。</li>
		<li>用100%乙醇将溶液稀释100倍，于-20 °C保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>制备100 mL完全L-15培养基。
	<ol>
		<li>将1.8 mL D-葡萄糖溶液（200 mg/mL）加入92 mL pH L-15中，使终浓度为3.5 mg/mL葡萄糖。</li>
		<li>加入1 mL 100倍青霉素-链霉素溶液（10,000 U/mL）、2 mL热灭活马血清、3.1 mL IPCS混合液和0.1 mL孕酮溶液（2 × 10-5 M）。</li>
		<li>用0.22 µm滤膜过滤培养基，于4 °C保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>每项实验准备5 mL密度梯度溶液（终浓度为5.5%）。
	<ol>
		<li>将476 µL商品化的60%密度梯度介质加入4524 µL L-15培养基中（如可能，应使用不含酚红的L-15以增强界面处的视觉对比度；稀释比例为1:10.5）。</li>
		<li>于4 °C保存2周，或于-20 °C冷冻保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>制备10 mL培养基。
	<ol>
		<li>将200 µL补充剂加入9.6 mL神经元细胞培养基中。</li>
		<li>将200 µL热灭活马血清（该成分倾向于诱导胶质前体细胞分化并抑制其增殖）加入25 µL谷氨酰胺和10 µL 2-巯基乙醇中。</li>
		<li>用0.22 µm滤膜过滤培养基。</li>
		<li>加入以下神经营养因子：睫状神经营养因子（CNTF）至终浓度10 ng/mL，脑源性神经营养因子（BDNF）和胶质细胞源性神经营养因子（GDNF）至终浓度均为1 ng/mL。</li>
		<li>于4 °C保存培养基。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>制备50 mL解剖用培养基。
	<ol>
		<li>将2.25 mL葡萄糖溶液（200 mg/mL）加入47.05 mL HBSS中，再加入700 µL 1 M HEPES（pH 7.4）。于4 °C保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>制备4% PFA溶液。
	<ol>
		<li>将20 g PFA溶解于500 mL PBS中。</li>
		<li>在化学通风橱中将溶液加热至60 °C，并逐滴加入几滴1 M NaOH，直至溶液澄清。</li>
		<li>用滤纸过滤溶液，并调节pH至7.2。于-20 °C保存。 
		注：也可使用其他市售PFA溶液，用PBS稀释至4%。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用前用70%乙醇清洁解剖工具（包括镊子、剪刀和硅胶培养皿），使用后用肥皂和清水清洗。</li>
</ol>
2. 多聚鸟氨酸/层粘连蛋白（Po/L）培养皿包被
注意：体积已调整为适用于包被24孔板。
<ol>
	<li>如有需要，将一片无菌的12 mm盖玻片放入孔中。</li>
	<li>用500 µL溶于水中的10 µg/mL多聚-L-鸟氨酸溶液包被各孔。</li>
	<li>室温静置1小时。</li>
	<li>吸除多聚-L-鸟氨酸溶液，室温晾干30分钟。</li>
	<li>加入500 µL含3 µg/mL层粘连蛋白的碳酸氢盐L-15培养基，于37 °C孵育过夜。 
	注意：包被后的孔可在37 °C培养箱中保存7天。对于长时间孵育，可在孔之间加入无菌PBS，以减少培养基蒸发。</li>
</ol>
3. 解剖
<ol>
	<li>当胚胎处于E12.5胚胎期时，处死一只怀孕小鼠，并用70%乙醇清洁腹部。</li>
	<li>切断两侧输卵管和阴道以取出子宫，并将其放入盛有冷PBS（不含Ca2+和Mg2+）的培养皿中。</li>
	<li>收集所有胚胎，并转移至另一盛有新鲜冷PBS（不含Ca2+和Mg2+）的培养皿中。</li>
	<li>将一个胚胎放入涂有硅胶并盛有解剖培养基（含HBSS、4.5 g/L葡萄糖和7 mM HEPES，pH 7.4）的培养皿中。 
	注意：胚胎解剖应在显微镜下使用洁净的精细镊子和剪刀进行。也可使用未涂硅胶的普通培养皿进行解剖。</li>
	<li>使用镊子代替剪刀，去除头部、尾部及内脏组织。</li>
	<li>用镊子将胚胎腹部朝下固定在硅胶表面。</li>
	<li>用另一对镊子，将其中一个尖端插入头端脊髓中央管内。</li>
	<li>闭合镊子，撕开几毫米的背侧组织。</li>
	<li>重复此操作，向尾端方向推进，直至整个脊髓完全打开（图1B）。</li>
	<li>将头端脊髓（脑干部分）从身体上分离。</li>
	<li>翻转胚胎，使打开的脊髓面紧贴硅胶表面。</li>
	<li>夹住脊髓头端，用镊子夹住胚胎头部并向外拉，以完整取出脊髓。 
	注意：脑膜和背根神经节（DRGs）应保留在胚胎残体上。若仍有残留附着于脊髓，则需小心将其剥离。在此步骤中，也可收集DRGs用于感觉神经元培养（见讨论部分）。</li>
	<li>将脊髓在硅胶表面展平，使用手术刀沿两侧中线切开，去除背侧半部分。再用手术刀将中间部分切成10段，转移至新离心管中。</li>
</ol>
4. 脊髓细胞悬液
<ol>
	<li>重复此解剖步骤，共处理6至8根脊髓。</li>
	<li>让脊髓组织块沉降至离心管底部，吸除HBSS，加入1 mL Ham-F10培养基。</li>
	<li>加入10 µL胰蛋白酶（2.5% w/v；终浓度0.025%），于37 °C孵育10分钟。</li>
	<li>为终止酶消化反应，将组织碎片转移至新的15 mL离心管中，该管预先加入800 µL完全L-15培养基、100 µL 4%（w/v）BSA和100 µL DNase（1 mg/mL溶于L-15培养基）。</li>
	<li>使用P1000移液器吸取1 mL液体，吹打混悬两次。静置2分钟使碎片沉降，将上清液收集至新的15 mL离心管中。</li>
	<li>向残留的组织碎片中加入900 µL完全L-15培养基、100 µL 4%（w/v）BSA和100 µL DNase（1 mg/mL溶于L-15培养基）。</li>
	<li>使用P1000移液器吸取1 mL液体，吹打混悬6次。静置2分钟使碎片沉降，将上清液加入第4.5步获得的15 mL离心管中。</li>
	<li>向残留的组织碎片中加入900 µL完全L-15培养基、100 µL 4%（w/v）BSA和100 µL DNase（1 mg/mL溶于L-15培养基）。</li>
	<li>使用P1000移液器吸取1 mL液体，吹打混悬10次。静置2分钟使碎片沉降，将上清液加入第4.5步获得的15 mL离心管中。后续操作使用此上清液。</li>
	<li>使用P1000移液器，轻轻将2 mL 4%（w/v）BSA垫层加至含有上清液的离心管底部。以470 × g离心5分钟。</li>
	<li>吸除上清液，用2 mL完全L-15培养基重悬细胞沉淀。</li>
</ol>
5. 通过梯度密度进行MN富集
<ol>
	<li>将细胞悬液分装至两个15 mL离心管中（每管1 mL），然后每管加入2 mL完全L-15培养基。若起始样本为6枚胚胎，则每管加入相当于3枚胚胎的样本，置于3 mL培养基中。</li>
	<li>缓慢将密度梯度溶液加入每根试管底部，加入量为2 mL，以获得清晰的界面。</li>
	<li>在室温下以830 × g离心15分钟。此步骤后，小细胞应位于管底，而运动神经元（MNs）等大细胞应位于密度梯度溶液与培养基的界面处。</li>
	<li>收集界面处的细胞，吸取1至2 mL转移至新的15 mL离心管中。调整体积&#160;用L-15培养基调pH至10 mL。</li>
	<li>向离心管底部加入 2 mL 4% BSA 垫层&#160;在室温下以470 × g离心5分钟。</li>
	<li>移除上清液，并将沉淀重悬于3 mL完全L-15培养基中。</li>
	<li>重复步骤 5.5。</li>
	<li>吸除上清液，将细胞沉淀重悬于2 mL完全培养基中。使用血细胞计数板在相差显微镜下对细胞数量和活力进行计数。 
	注意：对于6个脊髓样本，预期细胞数量约为1 x 105 运动神经元。</li>
</ol>
6. MN 培养
<ol>
	<li>将运动神经元（MNs）稀释至适当密度，通常在24孔板中每孔加入500 µL培养基，含5,000至10,000个细胞。 
	注意：6孔板和96孔板的接种密度分别约为30,000个和1,500个细胞。</li>
	<li>使用P1000移液器吸除层粘连蛋白（laminin）溶液。</li>
	<li>立即将稀释于培养基中的运动神经元（MNs）转移至包被好的培养板中，避免干燥。</li>
	<li>在37 °C条件下培养2天。</li>
</ol>
7. MNs 的磁转染
注意：以下步骤中使用的试剂用量适用于24孔板的一个孔的转染。如需其他规格，请参考生产商的说明书。
<ol>
	<li>进行DNA制备时，将1 µg DNA重悬于50 µL神经元培养基中，并涡旋振荡5秒。</li>
	<li>进行微珠管制备时，将1.5 µL微珠重悬于50 µL神经元培养基中。</li>
	<li>将50 µL微珠溶液加入50 µL DNA溶液中，室温孵育20分钟（总体积 = 100 µL）。</li>
	<li>孵育期间，从将要转染的孔中吸出100 µL培养基。 
	注意：将磁力板放入培养箱中，使其预热至37 °C。</li>
	<li>将100 µL DNA/微珠混合液转移至孔中，并将培养板置于37 °C磁力板上孵育20–30分钟。</li>
	<li>在检测cDNA表达前，至少等待24小时。</li>
</ol>
8. 固定与染色
<ol>
	<li>用 PBS 洗涤培养物 2 次。</li>
	<li>在4% PFA/PBS中室温孵育培养物20分钟。</li>
	<li>用 PBS 洗涤培养物 2 次。</li>
	<li>在室温下，将样品在500 µL封闭缓冲液（PBS，4% BSA，2%正常血清，0.3% Triton X-100，0.1 M甘氨酸）中孵育1小时。 
	注意：正常血清应来源于与二抗相同的物种（例如， 正常山羊血清</li>
	<li>在4 °C下用250 µL封闭缓冲液稀释的一抗溶液孵育过夜。 
	注意：例如，TUJ1 的使用浓度为 1/1000，SMI32 的使用浓度为 1/1,000，Lc3b 的使用浓度为 1/200。</li>
	<li>用 PBS 洗涤培养物 3 次。</li>
	<li>在250 µL封闭缓冲液中，将培养物与荧光素标记的二抗稀释后于室温孵育1小时。</li>
	<li>用 PBS 洗涤培养物 3 次。</li>
	<li>使用封片剂将样本封固于玻璃载玻片上。</li>
</ol>

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<li>Malin, S. A., Davis, B. M., Molliver, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+dissociated+sensory+neuron+cultures+and+considerations+for+their+use+in+studying+neuronal+function+and+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Production of dissociated sensory neuron cultures and considerations for their use in studying neuronal function and plasticity.</a> Nature Protocols. 2 (1), 152-160 (2007).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

该方案的一个关键点在于，小鼠胚胎必须在发育的特定时间窗口（E12.5）进行解剖，以最大化最终获得的运动神经元（MNs）数量。此外，为获得最佳产量，解剖操作应于上午或下午早些时候进行。在E12.5之前（例如， 在E11.5之后，解剖难度增加，尤其是去除脑膜的操作更为困难。E12.5之后，所获得的运动神经元数量显著下降。为控制胚胎发育阶段，首先于每日结束时将成年雌鼠与雄鼠合笼。次日早晨将成年鼠分笼，并检查雌鼠是否存在阴道栓。若发现阴道栓，则认定胚胎发育处于E0.5阶段。本实验通常采用一种活力强且繁殖性能优良的小鼠品系。本方案所用的繁殖群体源自美国密苏里州培育的种群，品系命名为CF1（Carworth Farms strain 1）。该品系于1967年引入法国Charles River Laboratories，并被命名为OF1（Oncins France 1）。
第二个关键点是离心步骤，其对培养物的纯度有显著影响。运动神经元（MNs）在脊髓细胞中所占比例较低（约1%），目标是获得一个在其他脊髓神经元细胞中包含40%至50%运动神经元、且胶质细胞前体少于5%的培养物。为...

神经肌肉疾病包含多种在临床表现和遗传特征上各不相同的病理类型，其共同特征是肌肉和/或神经系统发生异常。随着测序技术的进步，在过去十年中已鉴定出数百个导致这些罕见疾病的相关基因（基因列表可参见神经肌肉疾病中心：http://neuromuscular.wustl.edu/index.html）。已发现的突变类型表明，同一基因的不同突变可导致不同的表型和疾病1,2,3，而不同基因的突变也可能产生相似的表型4,5。在此背景下，研究人员正致力于开发细胞模型，以期成为分析突变后果及病理机制的有力工具。
脊髓运动神经元的胞体较大，位于脊髓前角，其轴突较长，支配骨骼肌纤维，并通过在神经肌肉接头处释放乙酰胆碱实现随意运动。由于运动神经元会受到肌萎缩侧索硬化症、腓骨肌萎缩症（CMT）和脊髓性肌萎缩症等神经肌肉疾病的影响，Henderson 博士及其同事开发了首个实验方案6 可实现培养的 体外 脊髓运动神经元及神经营养因子GDNF的发现7 （胶质细胞源性神经营养因子）。自那以后，技术上的改进使得利用FACS对脊髓运动神经元及其亚型进行更精确的纯化成为可能8，但利用密度梯度进行富集的方法在目前从事原代脊髓运动神经元研究的实验室中仍然具有强大效力并被广泛使用9,10,11,12,13,14随后，还可利用表面标志物p75通过免疫淘选获得更高纯度的运动神经元。（NTR） 15,16,17.
脊髓包含不同亚型的颈段、胸段和腰段运动神经元（MNs），以及位于前角背腹轴上不同位置且支配不同靶标的内侧和外侧运动柱8,18。初级运动神经元培养物能够以生理比例回收所有这些运动神经元亚型。该技术的主要局限在于最终获得的运动神经元数量较少；事实上，从六个胚胎中大约可获得105个运动神经元，适用于显微镜观察，但对生物化学实验而言数量有限。若需进行具有更标准化亚型且运动神经元数量更充足（&#62;106个细胞）的实验，应考虑使用胚胎干细胞来源的运动神经元18。
将野生型/突变型转基因转染至原代运动神经元（MNs），或对内源基因进行敲低，是解析生理病理通路的一种快速且有效的工具，尤其在缺乏小鼠模型的情况下尤为适用。磁转染（magnetofection）是一种可用于原代神经元转染的技术，其效果类似于脂质体转染（lipofection），但不具有相应的神经毒性。此外，该转染操作可在培养数天后的成熟神经元上进行 体外，与基于电穿孔的技术不同9然而，该技术的一个缺点是磁珠会结合培养物中的核酸，导致DAPI标记时产生背景噪音。病毒感染可能是转染运动神经元（MNs）最有效的方法；然而，磁转染无需病毒制备和细胞感染所需的一些安全操作步骤。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;&lt;u&gt;材料&lt;/u&gt;&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>硅胶解剖皿</td><td>生命系统仪器设备</td><td>DD-90-S-BLK-3PK</td><td>Sylgard</td></tr><tr><td>圆形盖玻片</td><td>NeuVitro，Knittel 玻璃</td><td>GG-12-Pre</td><td>12 mm</td></tr><tr><td>滑动Lyzer小室</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>66030</td><td>20,000 MWCO ；30 mL</td></tr><tr><td>滤器单元</td><td>Millipore</td><td>SCGVU02RE</td><td></td></tr><tr><td>GP 无菌注射器滤器</td><td>Millipore</td><td>SLGP033RS</td><td></td></tr><tr><td>4孔板</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>167063</td><td>Nunclon Delta 处理板</td></tr><tr><td>镊子</td><td>杜蒙特的FST</td><td>11252-20</td><td>#5 镊子</td></tr><tr><td>剪刀</td><td>杜蒙特的FST</td><td>14060-10</td><td>精细剪刀</td></tr><tr><td>手术刀</td><td>杜蒙特的FST</td><td>10035-20</td><td>弯形刀片</td></tr><tr><td>手术刀</td><td>杜蒙特的FST</td><td>10316-14</td><td>微型手术刀</td></tr><tr><td>培养皿</td><td>格赖纳</td><td>663102</td><td>&amp;oslash; x h = 100 x 15 mm</td></tr><tr><td>15 mL 聚丙烯管</td><td>Falcon</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>滤纸</td><td>Watman</td><td>1001125</td><td>圆形，直径125毫米</td></tr><tr><td>玻璃培养皿载玻片</td><td>Lab-Tek</td><td>154526</td><td>4孔板</td></tr><tr><td>质粒 pCAGEN</td><td>Addgene</td><td>#11160</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;脊髓运动神经元的原代培养、磁转染及免疫染色方法&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;目录编号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;评论&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;&lt;u&gt;溶液与培养基&lt;/u&gt;&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9418</td><td></td></tr><tr><td>L-15 培养基</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11415056</td><td></td></tr><tr><td>L-15 培养基，无酚红</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>21083027</td><td></td></tr><tr><td>胰岛素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I6634</td><td></td></tr><tr><td>腐胺</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5780</td><td></td></tr><tr><td>伴清蛋白</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7786</td><td></td></tr><tr><td>亚硒酸钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5261</td><td></td></tr><tr><td>孕酮</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8783</td><td></td></tr><tr><td>聚-DL-鸟氨酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8638</td><td></td></tr><tr><td>层粘连蛋白</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L2020</td><td></td></tr><tr><td>2.5% 胰蛋白酶，10 倍浓度</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15090046</td><td></td></tr><tr><td>DNA酶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DN25</td><td></td></tr><tr><td>不含 Ca、Mg 的 PBS</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14190144</td><td>不含 Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; 钙&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>碳酸氢钠</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>25080094</td><td></td></tr><tr><td>神经元细胞培养基</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A3582901</td><td>Neurobasal Plus 培养基</td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H6648-500ML</td><td></td></tr><tr><td>HEPES缓冲液 1 M</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15630056</td><td></td></tr><tr><td>密度梯度介质</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1556</td><td>Optiprep</td></tr><tr><td>补充培养基</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A3582801</td><td>B-27 Plus</td></tr><tr><td>马血清，热灭活</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>26050-088</td><td></td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺 200 mM</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>25030024</td><td></td></tr><tr><td>2-巯基乙醇</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>31350010</td><td></td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15140122</td><td>10,000 U/mL</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;目录编号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;评论&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;&lt;u&gt;免疫荧光&lt;/u&gt;&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS，10 倍浓缩液</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>X0515</td><td>不含 Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>多聚甲醛（PFA）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>441244</td><td></td></tr><tr><td>正常山羊血清</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G6767</td><td></td></tr><tr><td>甘氨酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7126</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>胆碱乙酰转移酶（CHAT）</td><td>Chemicon</td><td>Ab144P</td><td></td></tr><tr><td>非磷酸化神经丝蛋白H（SMI32）</td><td>Biolegends</td><td>SMI-32P</td><td>IF 1:1000</td></tr><tr><td>Islet-1</td><td>DSHB</td><td>40.2D6</td><td></td></tr><tr><td>Islet-2</td><td>DSHB</td><td>39.4D5</td><td></td></tr><tr><td>Hb9</td><td>DSHB</td><td>81.5C10</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield 封片剂</td><td>Vector Lab</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>β3微管蛋白（Tuj1克隆）</td><td>Biolegends</td><td>801201</td><td>IF 1/1000</td></tr><tr><td>Lc3b</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>#2775</td><td>免疫荧光，1:200</td></tr></tbody></table>

建模查理-玛丽-图斯病 体外 通过转染小鼠原代运动神经元

Modeling Charcot-Marie-Tooth Disease In Vitro by Transfecting Mouse Primary Motoneurons

脊髓运动神经元（MNs）的神经退行性变与多种神经系统疾病相关，包括肌萎缩侧索硬化症、腓骨肌萎缩症（Charcot-Marie-Tooth病）和脊髓性肌萎缩症，这些疾病均伴有肌肉萎缩。脊髓运动神经元的原代培养已被广泛用于验证特定基因在上述疾病中的作用，并表征其突变所导致的细胞学后果。本实验方案基于Henderson及其同事二十多年前的开创性工作，建立了一种原代运动神经元培养模型。首先，我们详细描述了从小鼠胚胎脊髓前角分离运动神经元的方法，并利用密度梯度离心技术将运动神经元与邻近细胞分离。随后，我们介绍了一种利用磁转染技术高效转染运动神经元表达质粒的新方法。最后，我们展示了如何对原代培养的运动神经元进行固定和免疫染色。通过使用导致2型腓骨肌萎缩症的神经丝蛋白突变，本方案展示了一种定性研究目的蛋白表达及其在运动神经元生长、维持和存活中作用的方法。

培养24小时后，运动神经元（MNs）应已表现出显著的轴突生长（长度至少为胞体大小的6倍以上）。在随后的几天中，轴突应继续生长并出现分支（图2）。由于亚型特异性，不同亚型的运动神经元会呈现不同的形态。例如，支配躯干肌肉的中柱运动神经元，其轴突较短且分支较多，而支配肢体肌肉的外侧柱运动神经元则具有更长且分支较少的轴突18。
上述分离与培养技术最近被用于鉴定神经丝蛋白基因 NEFH 中一种新的突变，该突变导致常染色体显性遗传的轴突型腓骨肌萎缩症（CMT）13。在此研究中，铺板后两天，将纯化的运动神经元转染表达突变型 NEFH 与 eGFP 融合的质粒，或野生型 NEFH 与 eGFP 融合的质粒。两天后，突变型 NEFH-eGFP 沿细胞骨架网络形成聚集体。磁转染四天后，这些聚集体进一步发展为显著的核周包...

该技术的目的是从鼠类脊髓中制备高度富集的原代运动神经元（MNs）培养物。为了评估导致运动神经元疾病突变的影响，本文描述了这些分离的运动神经元的获取及其通过磁转染法进行转染的方法。

脊髓运动神经元（MNs）的神经退行性变与多种神经系统疾病相关，包括肌萎缩侧索硬化症……

该方法有助于解决神经生物学中的关键问题，例如运动神经元的极性、轴突导向、轴突运输以及神经退行性机制。该技术的主要优势在于能够获得高度富集的运动神经元培养物，同时通过微小影响实现目标蛋白的表达下调。开始此操作时，将一个胚胎置于含有硅编码的解剖培养基的培养皿中。在显微镜下，用镊子将胚胎腹部朝下固定在硅胶上。用第二把镊子将其中一端插入头侧脊髓的中央管中，然后闭合镊子，轻微撕裂背侧组织。向吻侧重复此操作，直至整个脊髓完全打开。接着，调整胚胎位置，使打开的脊髓紧贴硅胶基底。随后，将脊髓的头侧部分从身体上分离。捏住脊髓的头侧部分，通过头部牵拉胚胎以取出脊髓。小心剥离仍附着在脊髓上的残留脑膜和背根神经节。将脊髓平铺在硅胶上，用手术刀沿两侧中线切开，去除脊髓的背侧半部分。将中间部分切成十块，并转移至新管中。为制备脊髓细胞悬液，将脊髓组织块收集于管底。弃去HBSS，加入一毫升Ham F-10培养基，并添加十微升胰蛋白酶。将试管在37摄氏度下孵育10分钟。为终止酶消化反应，将组织碎片转移至一个新的15毫升离心管中，管内含有800微升完全L-15培养基、100微升4% BSA以及100微升DNase I，混匀后重复处理两次。静置碎片2分钟，随后将上清液收集至一个新的15毫升离心管中。在上清液管底部轻轻加入两毫升 4% BSA。在 470 × g 离心力下离心 5 分钟。5 分钟后，弃去上清液，并用 2 毫升完全 L-15 培养基重悬细胞沉淀。为了富集运动神经元，将细胞悬液分装到两个15毫升的离心管中。然后，向每管加入2毫升L-15 PH培养基。如果起始材料为六个胚胎，则每管使用相当于三个胚胎的细胞，并加入3毫升培养基。缓慢加入 2 毫升密度梯度溶液至每根试管底部，以获得清晰的界面。接着，在室温下以 830 × g 离心 15 分钟。此步骤完成后，小细胞应位于试管底部，而大细胞（如运动神经元）则应位于密度梯度溶液与培养基的界面处。吸取1至2毫升界面处的细胞，转移至新的15毫升离心管中。用L-15培养基将体积调至10毫升。随后，向两支试管底部各加入2毫升4% BSA垫层溶液。在室温下以470 × g离心5分钟。5分钟后，弃去上清液，将沉淀重悬于3毫升完全L-15培养基中。再次在室温下以470 × g离心5分钟。然后，弃去上清液，用2毫升完全培养基重悬细胞沉淀。培养运动神经元时，将细胞稀释至每孔5,000–10,000个细胞，每孔加入500微升培养基，接种于24孔板中。随后，使用P-1000移液器吸头吸除基底膜溶液。立即将用培养基稀释的运动神经元转移至包被好的培养板中，以避免干燥。为制备DNA，将1微克DNA重新悬浮于50微升神经元培养基中。涡旋5秒。准备B管时，将1.5微升磁珠重悬于50微升神经元培养基中。将50微升磁珠溶液加入50微升DNA溶液中，室温孵育20分钟。孵育期间，从将要转染的孔中吸出100微升培养基。随后，将100微升DNA磁珠混合物转移至每个孔中。将24孔板置于37摄氏度的磁力板上孵育20至30分钟。图中显示的是培养四天后，通过内源性非磷酸化神经丝重链的表达所揭示的成熟神经元形态。这些图像展示了体外培养四天并经磁转染法在第二天转染 EGFP 转基因后的成熟神经元形态。成熟神经元经 SMI-32 标记物或泛神经元标记物 TUJ-1 进行反向染色，箭头指示神经元的胞体。这些是经磁转染表达野生型或突变型 EGFP NEFH 构建体并用自噬标志物 LC-3B 染色的运动神经元的共聚焦图像。箭头显示也呈 LC-3B 阳性的突变型 EGFP NEFH 蛋白聚集体。按照此方案，可通过视频显微镜分析 montoholda curcha，以观察轴突运输并提供一定指导。该技术最初为解决神经生物学中的基本问题而开发，随后被证明是研究涉及多种运动神经元疾病（如中毒性休克综合征、Samuel 营养不良性侧索硬化或脊髓性肌萎缩）的生理病理机制的有力工具。

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科研

JoVE Journal

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神经科学

小鼠原代多元体的体外模拟？

培养的肌细胞作为模拟神经支配肌肉的模型存在不足 体内一个功能性的运动单位可以被复制 体外...

培养皿中的功能性运动单位：脊髓外植体与肌细胞的共培养

表型正常的星形胶质细胞和神经干细胞取自携带floxed条件性致癌等位基因的基因工程小鼠，通过病毒介导的Cre重组进行转化，可用于建立星形细胞瘤发病机制的模型 体外 和 体内...

星形细胞瘤发病机制建模 体外 和 体内 利用条件性基因工程小鼠的皮层星形胶质细胞或神经干细胞

在本实验方案中，我们介绍了建立强直性肌营养不良症1型成肌细胞模型的步骤，包括优化的C2C12细胞培养、基因转染/转导以及肌细胞分化。...

在C2C12成肌细胞中建立强直性肌营养不良症1型模型

本方案描述了一种从6-7日龄幼鼠中分离和培养原代小鼠大脑颗粒神经元（CGNs）的简单方法，可高效转导CGNs以进行功能缺失和功能获得研究，并利用同一培养模型模拟NMDA诱导的神经元兴奋性毒性、低钾诱导的细胞死亡、DNA损伤以及氧化应激。...

建立小鼠原代小脑颗粒神经元的神经元死亡与变性模型

神经传导测量是评估神经退行性疾病小鼠模型的有用工具，但通常仅用于刺激后肢坐骨神经。本文介绍了一种测量复合肌肉动作电位（CMAP）的技术 体内...

体内电生理记录小鼠运动神经元变性模型前肢复合肌肉动作电位

本方案通过可诱导的piggyBac载体异位表达转录因子，可快速高效地将诱导性多能干细胞转化为具有脊髓或颅脑特征的运动神经元。...

利用PiggyBac载体将人诱导性多能干细胞（iPSCs）转化为功能性脊髓和颅脑运动神经元

本研究提出了一种用于获得均一的原代动眼神经、滑车神经及脊髓运动神经元细胞培养物的实验方案。这些细胞培养物可用于比较分析眼外肌运动神经元与脊髓运动神经元在形态学、细胞学、分子生物学以及电生理学特性方面的差异。...

从产前 Islmn:GFP 转基因小鼠中分离与培养动眼神经、滑车神经及脊髓运动神经元

本文提供了一种利用人诱导性多能干细胞（iPSCs）在体外生成神经肌肉接头（NMJs）的实验方案。该方法可在单个孔中于一个月内诱导形成具有成熟形态和功能的神经肌肉接头。所获得的神经肌肉接头有望用于相关疾病的建模、病理机制的研究，或用于药物化合物的治疗性筛选。...

由人诱导性多能干细胞体外诱导生成神经肌肉接头

我们描述了一种在市售微流控装置中生成人类运动单位的方法，该方法通过共培养人诱导多能干细胞来源的运动神经元与人原代中血管母细胞来源的肌管细胞，从而形成功能性活跃的神经肌肉接头。...

在微流控装置中生成具有功能性神经肌肉接头的人类运动单元

我们描述了一种可重复、自动化且无偏倚的成像系统，该系统利用人源工程化骨骼肌组织和光遗传学运动神经元来表征神经肌肉接头功能。该系统能够随时间对神经肌肉连接的功能进行定量分析，并可检测由神经毒素及重症肌无力患者血清引起的神经肌肉功能下降。...

构建与表征人源神经肌肉接头的光遗传学模型

利用具有常见患者突变驱动的免疫健全、同源性肿瘤模型进行临床前测试，对免疫治疗研究至关重要。本方案描述了一种通过电穿孔递送质粒DNA来构建脑肿瘤小鼠模型的方法，该模型可模拟常见患者突变，从而提供一种准确、可重复且稳定的小鼠模型。...

建立脑肿瘤模型 体内 利用电穿孔法递送代表患者突变特征的质粒DNA

了解小鼠原代运动神经元的分离与转染技术，通过密度梯度离心和磁转染方法实现高纯度培养。该技术为研究运动神经元极性、轴突导向及神经退行性疾病机制提供了可靠的实验平台。

建模查理-玛丽-图斯病体外通过转染小鼠原代运动神经元

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