Name: 大鼠体内部分肝工程的外科技术基础 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 27 s
Description: 学习大鼠体内单叶肝脏灌注的外科手术技术，用于部分肝工程研究。该方法通过建立血管旁路实现选择性灌注，为肝脏支架再细胞化和长期功能维持提供创新平台。

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作者谨此感谢耶拿大学医院解剖学研究所 I 的 Jens Geiling，他绘制了大鼠肝脏解剖结构的示意图。

饲养和所有操作均符合德国动物福利法规。所有纱布、覆盖衣物和手术器械均在手术前经过高压灭菌并做好准备。所有操作均在无菌条件下进行。
1. 手术前大鼠的准备
<ol>
	<li>将大鼠放入诱导室中，使用4%异氟烷蒸气和100%氧气（流速0.5 L/min）麻醉约3分钟，直至大鼠完全麻醉。</li>
	<li>将大鼠从诱导室中取出，并测量其体重。</li>
	<li>剃除腹部手术区域的毛发。</li>
	<li>将动物再次放入异氟烷诱导室中额外麻醉2分钟，以加深麻醉程度。</li>
	<li>将大鼠仰卧位放置于手术台上。</li>
	<li>将麻醉面罩固定在大鼠口鼻部位，并以2%异氟烷蒸气和100%氧气持续供气（流速0.5 L/min）维持麻醉状态。</li>
	<li>用胶带固定四肢。</li>
	<li>在双眼涂抹兽用眼膏，防止角膜干燥。</li>
	<li>皮下注射0.05 mg/kg的丁丙诺啡，以缓解手术期间的疼痛。</li>
	<li>用碘酊对腹部手术区域进行三遍消毒，再用70%酒精进行两遍脱碘处理。</li>
	<li>在切口周围放置无菌纱布，仅暴露腹部手术区域。</li>
	<li>当大鼠足趾夹捏回缩反射消失时，开始进行手术操作。</li>
</ol>
2. 大鼠剖腹手术
<ol>
	<li>使用剪刀和电凝器做腹部横向皮肤和肌肉切口。</li>
	<li>用4-0聚丙烯缝线将剑突固定并向头侧牵拉。 
	注意：注意将剑突垂直上提，以更好地暴露肝脏，但操作时需谨慎，避免造成严重的呼吸受限和窒息。</li>
	<li>用两把肋下牵开钩将腹壁两侧向头侧牵拉，打开腹腔，暴露肝脏。</li>
	<li>用湿润纱布覆盖腹腔内的十二指肠和小肠，防止干燥。</li>
	<li>用湿润纱布提起肝脏左中叶和右中叶，并将其固定于胸壁，以更好地暴露肝门。</li>
	<li>将大鼠置于体视显微镜下（8倍放大）。</li>
	<li>每隔几分钟向腹腔及肝脏和肠道表面滴加温生理盐水，以防止整个操作过程中组织干燥。</li>
</ol>
3. 建立左外叶内的旁路通道
<ol>
	<li>解剖左侧门静脉，并在其根部用6-0丝线结扎（图2A).</li>
	<li>用微型夹夹闭左肝动脉、左胆管以及左中门静脉、左中肝动脉和左中胆管，以阻止灌注液流入左内叶图2B).</li>
	<li>用显微剪刀剪断左外侧叶周围的韧带，分离左外侧叶。</li>
	<li>用微型血管夹在左外叶基底部夹闭左肝静脉图2C). 
	注意：务必避免误夹左侧门静脉。</li>
	<li>使用蚊式钳夹住左门静脉的结扎线，保持静脉适当张力，以备后续插管。</li>
	<li>用24G带针芯的导管小心刺穿左侧门静脉前壁，形成切口 图3A). 
	注意：为建立旁路，需要在左门静脉和左肝静脉上创建血管通路。此步骤建议使用针头穿刺血管的方式建立通路，而非使用剪刀做较大的切口。这种方法可降低出血及后续狭窄的风险。</li>
	<li>撤出导管并取出导管内的针头，以获得无针的24G导管。</li>
	<li>将导管连接至灌注管，灌注管的另一端连接装有15 mL浓度为40 U/mL肝素化生理盐水的20 mL注射器，并置于灌注泵上。</li>
	<li>打开泵以灌注导管，排出导管和无针导管中的空气。</li>
	<li>关闭灌注泵。</li>
	<li>再次将无针导管插入左侧门静脉 通过 静脉上的穿刺切口（图3B). 
	注意：由于固定导管的空间非常有限，此时暂不固定导管。因此，外科医生应小心操作，避免已插入的导管发生移位。</li>
	<li>用22或24号留置针导管小心穿刺左肝外静脉暴露区域的边缘，再做一次切口图3C). 
	注意：建议导管略小于血管。</li>
	<li>撤出导管，将针头从导管中取出，以获得无针的22-G导管。</li>
	<li>开启灌注泵，将肝素化生理盐水灌注至左侧肝叶 通过 以0.5 mL/min的流速通过左侧门静脉的24-G无针套管针</li>
	<li>使用干纱布吸收左肝静脉切口周围流出的废液。</li>
	<li>插管左肝外静脉 通过 使用22G无针导管对静脉进行穿刺切口，以建立液体流出通道，从而最大限度减少腹腔内污染图3D). 
	注意：将套管导管固定在肝叶上在技术上较为困难，因此手术者应注意避免导管移位。 alternatively，可不通过导管插管左外侧肝静脉，仅用干燥纱布在静脉切口处吸收废液。</li>
	<li>用肝素化生理盐水持续灌注左侧外侧叶约20分钟（第1组），随后仅用生理盐水灌注2小时、3小时或4小时（分别为第2组、第3组和第4组）。</li>
	<li>关闭泵以停止灌注。</li>
</ol>
4. 左外叶的生理再灌注
<ol>
	<li>移除左侧门静脉和左外侧肝静脉上的两根导管。</li>
	<li>使用11-0聚酰胺缝线闭合左侧门静脉的切口。</li>
	<li>同样使用11-0聚酰胺缝线闭合左外侧肝静脉的切口。</li>
	<li>松开左外侧肝静脉的血管夹。</li>
	<li>松开左中门静脉、左胆管和左肝动脉的血管夹。</li>
	<li>剪断左侧门静脉上的结扎线，以重新开放该静脉。</li>
</ol>
5. 腹壁关闭
<ol>
	<li>使用4-0可吸收聚乳酸-羟基乙酸共聚物（polyglactin 910）缝线，通过间断缝合关闭腹壁的肌层。</li>
	<li>使用4-0可吸收聚对二氧环己酮（polydioxanone）缝线，通过间断缝合关闭腹壁的皮肤层。</li>
	<li>关闭腹腔后，用70%酒精对皮肤切口进行消毒。</li>
</ol>
6. 大鼠的术后处理
<ol>
	<li>将动物置于保温垫上复苏约10分钟，然后放入新笼中。</li>
	<li>术后连续3天每天皮下注射0.05 mg/kg的丁丙诺啡2次，以缓解疼痛。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

通过使用导管阻断并插管左门静脉作为液体入口，同时使用另一导管阻断并插管左外侧肝静脉作为液体出口，我们成功建立了 体内 左外叶存在液体旁路，表明尽管该技术因血管细小难以插管且出血风险较高而极具挑战性，但仍具有可行性。即使接受长达4小时灌注的实验大鼠，术后至少存活1周，说明大鼠能够耐受该手术操作。
在下述部分中，我们将描述技术上最具挑战性且最关键的三个步骤，以及如何成功掌握它们。首先，在分离和结扎左门静脉的过程中，由于目标门静脉与周围肝实质存在紧密的空间关系，分离血管时有较高的出血风险。我们建议使用显微镊子而非剪刀来分离左门静脉，通过仔细撕开左门静脉周围相连的无血管组织实现。其次，在左门静脉前壁切口的操作中，若前壁切口过大，可能增加切口修复的难度，并提高血管吻合后发生狭窄的概率。我们建议使用带针导管而非剪刀，以制作大小合适的切口。第三，在阻断左肝外侧静脉时，若对左肝外侧静脉暴露段的阻断位置不当，则无法为后续插管操作留出足够的暴露空间。我们建议夹闭位置应靠近左肝中叶侧，而非位于左肝外侧静脉暴露段的中央区域。
我们比...

器官移植的适应证正在不断扩大。相比之下，器官捐献率和器官总体质量却在下降，导致移植物需求日益增加。加入肝移植等待名单的患者数量持续上升（例如，2016年美国新增患者11,340例，而2015年为10,636例1尽管付出了巨大努力，可用器官的数量仍无法满足临床需求。由于肝病发病率上升，许多终末期肝病患者在等到供体器官之前，便在移植等待名单上死亡。为了满足对供体肝移植物的巨大需求，研究人员正在积极探索基于肝脏组织工程原理的替代方案。2如今，一种新开发的肝脏组织工程技术有望克服这一短缺问题。
肝脏组织工程包含两个步骤：首先生成无细胞支架，然后对支架进行细胞重植。为了获得生物来源的无细胞肝脏支架，需对离体肝脏进行灌注 通过 通过灌注离子型或非离子型去垢剂来处理血管系统，从而去除肝脏中的细胞成分。在以往大多数研究中，通常采用十二烷基硫酸钠与Triton X-100联合灌注肝脏，以获得生物来源的无细胞肝脏支架。该方法可完全清除所有细胞，同时保留细胞外基质的结构。随后，将器官支架重新接种成熟细胞，包括肝细胞、内皮细胞系，以及原代肝细胞，可同时或不同时联合应用内皮细胞或间充质干细胞（MSC）。大多数研究人员关注于 离体 肝脏组织工程3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14然而，在以往大多数研究中，仅将重新细胞化的支架小块移植到不同的异位植入部位。少数研究将部分重新细胞化的支架作为辅助移植物进行移植，但所报道的最长存活时间仅为72小时。8,14据我们所知，尚未有已发表的关于再细胞化全肝移植物原位移植的研究或报道。工程化器官的长期功能及其移植仍处于起步阶段。因此，一种替代性方法是 离体 需要进行肝脏组织工程。
体内肝脏工程可能代表了一种在生理条件下研究肝细胞重殖的替代方法。体内肝脏工程相较于体外肝脏工程具有多种优势。体内重殖的部分肝脏支架处于生理性的血液灌注环境中，具备适宜的温度、充足的氧气、营养物质和生长因子，而体外灌注则依赖人工培养基。此外，残存的部分正常肝脏可维持基本的肝功能，从而原则上支持长期存活。由于目前植入的体外工程化肝脏移植物仍无法通过其肝功能维持实验动物的长期存活8,&#160;我们预计，体内部分肝脏工程最终将成为一个极具前景的模型，可用于进一步研究工程化肝脏的演化过程，并实现比体外模型更长时间的存活观察。
最近，一个研究团队（Pan 及其同事）首次提出了一种技术 体内 肝脏组织工程15他们在克服解剖学和技术上的挑战后，成功实现了活体大鼠右肝下叶的孤立灌注。他们报道了首例术中结果 体内 使用大鼠原代肝细胞系进行再群体化。然而，该 体内 胰腺手术灌注模型 等 存在缺点。他们虽然实现了大鼠单个肝叶的灌注，但代价是完全阻断门静脉和下腔静脉，这可能对动物造成严重伤害。实验大鼠在术中仅观察6小时后即被处死。因此，该方法 体内 肝叶灌注技术需要进一步改进以实现术后存活。
我们开发了一种新型的生存模型 体内 肝叶灌注，基于大鼠肝脏解剖学的既往研究16小鼠门静脉插管技术用于血流动力学监测17和肝脏生物工程18,19该操作的关键步骤如图所示。 图&#160;1A - 1E.
该技术适用于希望利用这种in vivo灌注模型开展以下基础研究的研究人员：通过药物灌注进行器官部分治疗、利用in vivo脱细胞作为器官疾病的化学切除方法（例如，肝癌）、在脱细胞基质中进行in vivo细胞培养，并与ex vivo二维和三维细胞培养系统进行比较20,21,22,23,24,25,26，以及通过脱细胞与再细胞化实现in vivo肝脏组织工程。

<table><tbody><tr><td>灌注泵</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Perfusor VI</td><td>B. Braun, Melsungen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>导管</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Versatus-W&amp;nbsp; 导管</td><td>Terumo</td><td>SR+DU2419PX</td><td>24G, 0.74&amp;times;19mm</td></tr><tr><td>Versatus-W&amp;nbsp; 导管</td><td>Terumo</td><td>SR+DU2225PX</td><td>22G, 0.9&amp;times;25mm</td></tr><tr><td>显微外科器械</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>显微剪刀</td><td>F&amp;middot;S&amp;middot;L</td><td>No. 14058-09</td><td></td></tr><tr><td>显微止血夹钳</td><td>F&amp;middot;S&amp;middot;L</td><td>No.18055-05</td><td></td></tr><tr><td>显微夹钳施加器</td><td>F&amp;middot;S&amp;middot;L</td><td>No. 18057-14</td><td></td></tr><tr><td>直头显微镊</td><td>F&amp;middot;S&amp;middot;L</td><td>No. 00632-11</td><td></td></tr><tr><td>弯头显微镊</td><td>F&amp;middot;S&amp;middot;L</td><td>No. 00649-11</td><td></td></tr><tr><td>显微持针器</td><td>F&amp;middot;S&amp;middot;L</td><td>No. 12061-01</td><td></td></tr><tr><td>普通外科器械</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>标准剪刀</td><td>F&amp;middot;S&amp;middot;L</td><td></td><td></td></tr><tr><td>蚊式钳</td><td>F&amp;middot;S&amp;middot;L</td><td></td><td></td></tr><tr><td>有齿镊</td><td>F&amp;middot;S&amp;middot;L</td><td></td><td></td></tr><tr><td>带齿镊</td><td>F&amp;middot;S&amp;middot;L</td><td></td><td></td></tr><tr><td>持针器</td><td>F&amp;middot;S&amp;middot;L</td><td></td><td></td></tr><tr><td>缝线</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>4-0 Prolene</td><td>ethicon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>4-0 ETHICON*II</td><td>ethicon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>6-0 丝线</td><td>ethicon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>11-0 聚酰胺</td><td>ethicon</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

一种新型外科技术的基础研究 在体实验 大鼠部分肝脏组织工程

A Novel Surgical Technique As a Foundation for In Vivo Partial Liver Engineering in Rat

器官工程是一种用于生成可移植肝脏替代物的新型策略。近年来， 体内 肝脏组织工程，包括 体内 器官脱细胞后重新接种细胞的方法，已成为一种颇具前景的策略 离体 肝脏组织工程。然而，术后存活尚未实现。本研究旨在开发一种新型外科手术技术 体内 大鼠选择性肝叶灌注作为前提条件 体内 肝脏组织工程。我们仅通过左外叶建立旁路循环，随后用肝素化生理盐水灌注左外叶。实验共分为4组（n 每组3只大鼠，根据不同的灌注时间（20分钟、2小时、3小时和4小时）进行分组。模型建立成功的指标包括动物存活情况，以及肉眼可见的颜色变化和组织学上门管区及肝窦内红细胞的缺失。在对左外叶进行选择性灌注后，我们观察到左外叶确实由红色变为淡黄色。组织学评估显示，门静脉分支、中央静脉及肝窦内均无可见的血细胞。当重新开放被阻断的血管后，左外叶恢复为红色。12只大鼠中有12只在手术后存活超过一周。我们是首个报道该手术模型的团队 体内 单个肝叶灌注，可实现超过一周的长期存活。与先前发表的报道相比，本技术最重要的优势在于在整个操作过程中维持了70%肝脏的灌注。该技术的建立为 体内 大鼠部分肝脏组织工程，包括脱细胞与再细胞化

十二只雄性（12-13周龄）Lewis大鼠用于评估选择性肝叶灌注的效果。实验分为四组（n 每组3只大鼠。通过采用20分钟、2小时、3小时和4小时的不同灌注时间，按照上述步骤操作，我们成功实现了 体内 单叶灌注
在体实验 左外叶灌注：
肝素化生理盐水灌注后，可通过观察结果确认左门静脉与左肝外侧静脉的准确解剖定位及成功插管。成功定位与插管的首个指标是观察到左外侧肝叶流出的液体为含有灌注液的血液混合物 通过 流体出口（图4A）。通过观察肝素化生理盐水灌注后左外叶颜色的变化，进一步验证了手术灌注模型的成功。左外叶的颜色由鲜红色变为淡黄色，表明左...

我们建立了一种新的手术技术用于 在体 大鼠单个肝叶灌注模型作为深入研究的前提 体内 未来部分肝脏组织工程

器官工程是一种用于生成可移植肝脏替代物的新型策略。近年来，体内肝脏……

近年来，由于肝脏组织工程在生成可用于移植的肝脏移植物方面具有巨大潜力，已成为全球研究的热点。然而，工程化器官的长期功能性存活及其移植目前仍是未来的目标。最近，体内肝脏叶灌注技术已成为启动肝脏组织工程的一种有前景的策略。该技术的一个主要优势在于，体内再细胞化的部分肝脏支架接受了肠系膜血液灌注。与体外人工培养基灌注相比，这为支架提供了适宜的温度、充足的氧气、营养物质和生长因子。另一个优势是残余肝脏能够维持肝功能，从而原则上支持长期存活。然而，体内单叶肝脏灌注模型在技术上具有挑战性，目前尚未实现术后存活。本文将介绍另一种可实现长期存活的手术模型，为后续的体内单叶肝脏工程研究奠定基础。在展示该手术模型之前，我们先简要介绍大鼠肝脏的解剖结构。为了建立我们的单个肝叶灌注模型，我们选择了左侧外叶。这是唯一具有独立血管供应和引流的肝叶，可实现旁路的建立。这是大鼠门静脉系统的三维重建图像。我们的关注点是左侧门静脉，它将在后续作为液体入口。这是大鼠肝静脉系统的三维重建图像。此处我们的关注点是左肝外侧静脉，它将在后续作为液体出口。该肝脏血管解剖示意图突出了用于我们部分灌注模型的血管入路。此动画展示了构建体内左外侧肝叶灌注模型的方案。为了建立该手术模型，我们将在左外侧肝叶内构建一个旁路循环。为此，我们需要阻断以下血管：左门静脉、左肝动脉、左胆管、左中叶门静脉、肝动脉和胆管，以及左外侧肝静脉。随后，使用24号导管插管左门静脉。之后，使用22号导管插管左外侧肝静脉。然后将左门静脉内的导管连接至灌注泵。在左肝外侧静脉导管出口处放置干燥纱布，以吸收废液。由此建立旁路。然后以每分钟0.5毫升的流速用肝素化生理盐水灌注左侧外侧叶。在重新开放阻塞的血管后，恢复对左侧外侧叶的生理性灌注。此时，手术灌注模型已建立。本视频中演示的所有操作步骤均已通过当地主管部门的评估和批准。腹部手术区域使用碘酊消毒三遍，随后用70%酒精脱碘两遍。腹部覆盖无菌纱布，仅暴露手术区域。在大鼠的腹壁上做一横向切口。使用4-0 Prolene缝线固定剑突并将其向头部方向牵拉。使用两个肋下牵开器向两侧牵拉上腹部腹壁，以充分暴露器官。然后我们可以看到肝叶。这是用于选择性灌注的左外叶。我们用湿润的纱布覆盖腹腔内的十二指肠和小肠，以避免干燥。用湿润的纱布抬起肝脏的中叶，暴露肝门。将大鼠置于无菌显微镜下。解剖左侧门静脉。随后，我们使用6-0丝线结扎左门静脉。采用微型钳夹闭左肝动脉、左胆管，以及左中门静脉、左中肝动脉和左中胆管。在左外侧叶基底部，用微型钳夹闭左外侧肝静脉。为了建立流体入口，使用带有留置导管的24号针头穿刺门静脉主干，但不插入导管。随后将针头从导管中取出，并将导管连接至灌注泵。为了排出导管和管路中的空气，我们用肝素化生理盐水灌注一分钟。然后关闭泵。接下来，将已连接至灌注泵的无针导管插入左门静脉。通过这种方式，我们可尽量减少对

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一种在显微镜辅助下建立用于分阶段肝切除术的肝脏联合分割和门静脉结扎小鼠模型

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利用输尿管肝管吻合术的异位辅助性全肝大鼠移植模型用于同种异体移植物排斥研究

学习大鼠体内单叶肝脏灌注的外科手术技术，用于部分肝工程研究。该方法通过建立血管旁路实现选择性灌注，为肝脏支架再细胞化和长期功能维持提供创新平台。

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