Name: 使用大鼠的耳镜可视化和行为拍片启动反应进行验证，对传导性听力损失进行简单手术诱导 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-26T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 s
Description: 学习在大鼠中通过鼓膜穿刺手术诱导传导性听力损失的方法，结合耳镜可视化和拍击惊跳反应进行验证。该标准化方案为研究人类传导性听力障碍提供了可靠的动物模型。

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本工作部分由香港研究资助局早期职业计划项目（项目编号：21201217）资助，授予 C. L.，用于该项目 脑图谱引导的电生理学及其在听觉与噪声污染研究中的应用我们感谢墨西哥国立自治大学（UNAM）神经生物学研究所、墨西哥生物医学科学研究生项目以及墨西哥国家科学与技术委员会（CONACyT）为 FAM Manno 提供的编号为 578458 的研究生奖学金。

本研究及相关操作已获得香港城市大学、香港大学以及香港特别行政区卫生署动物研究伦理委员会的批准。
1. 动物
<ol>
	<li>使用两个月大的 Sprague-Dawley（SD）大鼠（N = 90，200–250 g）。 
	注：实验所用啮齿类动物由香港大学认证的实验动物中心提供。</li>
	<li>将大鼠饲养在恒定的25 &#176;实验室动物研究单元的温度为 C，相对湿度为60-70%。</li>
	<li>将实验大鼠饲养于12小时光照/12小时黑暗循环环境中，自由获取食物和饮用水， 随意.</li>
	<li>在进行传导性听力损失（CHL）手术前，至少将啮齿类动物在饲养环境中适应一天。</li>
	<li>用镊子夹住啮齿类动物的颈背部皮肤以固定，通过腹腔注射给予氯胺酮和赛拉嗪混合物（剂量分别为80–100 mg/kg和5–10 mg/kg）进行麻醉（以1.0 mL氯胺酮与0.5 mL赛拉嗪混合，作为终浓度）。 
	注意：使用1 mL注射器配23-25G针头。按每100 g大鼠体重注射约0.2 mL的剂量，可维持30分钟的麻醉效果。</li>
	<li>通过脚趾夹捏测试以确认痛觉反应并验证麻醉效果。若深部脚趾夹捏引起后肢回缩反应，则表明麻醉不充分。</li>
</ol>
2. 手术准备
<ol>
	<li>手术开始前，将所有器械在高压灭菌器或高温玻璃珠灭菌器中灭菌，并用70%乙醇清洁手术区域。</li>
	<li>操作前佩戴乳胶手套并穿上实验服。</li>
	<li>在洁净工作台面上铺置无菌手术单（图1A）。</li>
	<li>手术前对显微剪刀和耳镜进行灭菌，以最大限度减少耳部感染风险（图1B）。</li>
	<li>将显微剪刀和耳镜放置于无菌区域内。</li>
	<li>将啮齿类动物置于手术区域，并与术者保持对齐。</li>
	<li>进行传导性听力损失（CHL）的手术诱导。</li>
</ol>
3. 传导性听力损失的手术诱导
<ol>
	<li>将啮齿类动物的尾部和头部摆成俯卧位，头部靠近手术者。</li>
	<li>使用耳镜观察啮齿类动物左右耳，确认鼓膜健康（图2a）。在诱导传导性听力损失（CHL）前，需评估每只动物的左右耳，以确认其鼓膜处于健康状态。</li>
	<li>抓住耳廓并牵拉外耳道（即耳道、外耳道，以下简称耳道），使其内部因深度增加而变得模糊且呈黑色。此时，耳道应与鼓膜（TM）表面垂直。 
	注意：确保耳道现在与鼓膜穿刺路径完全平行，且鼓膜与显微剪刀插入轴线成直角。此时耳道应呈现为无光的黑色管状结构。有时需要将耳道相对于颅骨平面倾斜约15°，以确保手术者的手部操作方向与鼓膜表面垂直。</li>
	<li>将显微剪刀从耳道中央缓慢插入，注意避免刮擦或损伤耳道组织，向前推进约≈5 mm，从暗区中心轻柔地穿过鼓膜中央。 
	注意：当显微剪刀尖端刺穿鼓膜时，可听到“啪”的一声，由此可确认鼓膜穿孔。该“啪”声在视频中约≈2分52秒处可听见。此声音并非剪刀本身发出，而是鼓膜穿孔的声音。经事后分析测量，该“啪”声比背景声音高出约≈20 dB SPL，由高频麦克风记录所得。实际操作中无需如此精确验证“啪”声，通过耳镜观察即可充分确认。研究者可能需要练习，以确保每次CHL手术过程中均能听到“啪”声。</li>
	<li>穿刺鼓膜后立即打开弹簧式显微剪刀，并旋转三圈，以确保锤骨头部从鼓膜处移位（仅在需要锤骨移位时进行此步骤）。</li>
	<li>取出显微剪刀，将啮齿类动物置于耳镜下进行观察。 
	注意：手术后不应出现明显出血。若发生出血，应实施安乐死，不得继续进行行为学评估。</li>
	<li>按上述步骤对另一侧耳进行操作，以诱导双侧CHL。</li>
</ol>
4. 耳镜观察
<ol>
	<li>使用小直径耳镜通过耳镜检查确认传导性听力损失（CHL）手术是否成功，以观察啮齿类动物的中耳。</li>
	<li>在CHL手术前后，均需在耳镜下对每只啮齿类动物进行评估。确保确认鼓膜（TM）术前正常（图2a），术后鼓膜受损（图2b）。</li>
	<li>啮齿类动物的术后护理
	<ol>
		<li>将啮齿类动物置于带有保温灯的饲养笼中。</li>
		<li>在诱导CHL后观察啮齿类动物，直至其自行恢复正常体位。</li>
		<li>注射葡萄糖（右旋糖酐/生理盐水）血清以帮助恢复意识，并将动物放回饲养笼中进行恢复。 
		注：CHL手术后，使用23G针头和10 mL注射器注射5 mL生理盐水。</li>
		<li>在术后24小时恢复期内，通过肌肉注射给予抗菌药物恩诺沙星（Enrofloxacin）0.05 mg/kg，每日两次。</li>
		<li>术后定期观察啮齿类动物是否有疼痛行为或相关症状。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 行为学评估（传导性听力损失诱导的验证）——惊跳反应测试
<ol>
	<li>术后24小时，在耳镜确认后，通过击掌惊跳试验进行行为学评估，以证实传导性听力损失。</li>
	<li>将诱导了传导性耳聋的大鼠与正常大鼠分别置于两个相邻的独立笼子中。</li>
	<li>将啮齿类动物置于安静的房间内。</li>
	<li>站在距离啮齿类动物约0.5米处，以相等的时间间隔进行多次拍手（选择5次拍手，间隔1秒）。 
	注意：通过手拍产生的拍手惊吓反应进行测量 &#8776; 比背景声音高40 dB SPL，由高频麦克风记录。</li>
</ol>

<ol><li>Shargorodsky, J., Curhan, S. G., Curhan, G. C., Eavey, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Change+in+prevalence+of+hearing+loss+in+US+adolescents%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+the+American+Medical+Association%22%5BJournal%5D)">Change in prevalence of hearing loss in US adolescents.</a> The Journal of the American Medical Association. 304 (7), 772-778 (2010).</li>
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</ol>

作者声明不存在任何财务或非财务利益冲突。

我们描述了一种通过耳镜观察和行为性拍击惊跳反应来验证大鼠传导性耳聋（CHL）的简单手术诱导方法。本文以大鼠为例演示该方法，此前该方法已应用于沙鼠和小鼠。该方法可轻松推广至其他啮齿类动物。诱导CHL可用于研究一种较轻微的听力损失形式，其表现为听觉皮层的改变以及心理物理学行为学发现4,5,16,17,18。
未能成功诱导传导性听力损失（CHL）可能由以下所列多种原因导致。在每种情况下，我们建议弃用该大鼠。若大鼠一侧耳朵出血，则应实施安乐死。出血表明剪刀接触到了耳道，说明手术操作不够精准。此外，这也可能意味着穿孔深度超过预期，造成内部损伤，甚至可能伤及脑部。内部损伤可能是由于器械插入过深或划伤耳道所致。本手术为微创性鼓膜和/或锤骨切除/移位操作，因此不应出现明显出血...

儿童和成人听力损失的患病率分别约为19.5%1和15.2%2。然而，据美国疾病控制与预防中心报告，约有39.3%通过听力筛查发现异常的新生儿未能接受补救性治疗3。听力损失是一种被广泛研究的疾病，而啮齿类动物是研究正常听力及听力相关疾病的一个可靠模型4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15。传导性听力损失（CHL）等听力障碍会导致听觉皮层短期突触抑制增强4，从而引起与频率调制检测阈值相关的心理测量斜率变浅5。通过手术切除或移位锤骨、鼓膜（TM）穿刺或使用耳塞等方式建立的传导性听力损失模型操作简便，可快速诱导出听力损失模型5,14,15,16,17,18。本实验方案的目标是展示一种在啮齿类动物中简单且可重复的传导性听力损失模型。
本方案成本低廉（&#8776;300 美元即可完成全部工具配置），且可轻松适用于不同的研究目的。大鼠的中耳解剖结构已有详尽评估19,20,21,22,23，手术方法24中耳炎模型25,26,27 和鼓膜穿孔再生16,17,18,28,29,30，使其成为研究听力损失的理想模型。本文描述了一种简单的小鼠传导性听力损失（CHL）诱导方法，并通过耳镜检查及拍击惊跳反应进行行为学评估以验证CHL的建立，该模型可用于进一步探索听力损失的其他继发性影响。&#160;听力损失。通过手术穿刺鼓膜（TM）来诱导传导性听力损失（CHL）。CHL手术的验证通过耳镜观察鼓膜缺失情况进行判断。行为学评估采用高强度分贝（dB）声压级（SPL）的手掌拍击测试。该方法此前已在多种啮齿类动物中应用。&#160;易于复制，可产生显著的心理测量学差异及神经生理反应的变化4,5,16,17,18.

<table><tbody><tr><td>乳胶、聚氯乙烯或丁腈手套</td><td>AMMEX</td><td></td><td>使用无粉、8密耳厚度的手套</td></tr><tr><td>微型弹簧剪刀（见图1b）</td><td>RWD Life Science</td><td>S11035-08</td><td>总长度8.0 cm，切割刃3.5 mm，或类似的微型镊子。带弹簧装置的标准镊子亦可满足要求</td></tr><tr><td>Otoscope mini 3000</td><td>HEINE&amp;nbsp;</td><td>D-008.70.120M</td><td>标准LED耳镜即可满足要求</td></tr><tr><td>大鼠或小鼠</td><td>JAX labs</td><td></td><td>任何小型啮齿类动物&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>小型啮齿类动物笼具</td><td>Tecniplast</td><td>1284L</td><td>需要两个笼子，用于将听力受损的啮齿类动物与听力正常的个体分隔。若动物直接相互接触，会彼此惊扰。笼具尺寸：365 × 207 × 140 mm，底面积：530 cm² / 82.15 in²</td></tr></tbody></table>

通过耳镜观察和行为性拍击惊跳反应验证的大鼠传导性听力损失简易手术诱导方法

Simple Surgical Induction of Conductive Hearing Loss with Verification Using Otoscope Visualization and Behavioral Clap Startle Response in Rat

传导性听力损失（CHL）是人类中常见的一种听力障碍。本实验方案旨在介绍一种在啮齿类动物中诱导传导性听力损失的简单外科手术方法。该方案通过鼓膜穿刺来实现传导性听力损失。手术效果的验证采用耳镜检查和拍手惊跳反应的行为学评估，这两种方法均可重复且可靠，是证明听力损失发生的简便手段。该传导性听力损失造模方法的优势在于其可重复性强，并可根据不同听力损失研究需求灵活调整。通过外科手术诱导传导性听力损失的局限性主要在于操作者需要一定的学习曲线来掌握手术技术，以及对听力学检查的信心。通过传导性听力损失诱导听力障碍，可方便地研究听力损失所引起的神经表现及行为学结果。

对90只大鼠实施了简单的传导性听力损失（CHL）手术，其中2只出现明显出血，2只在术后第二天经行为学拍击惊跳测试评估未出现听力损失。这4只大鼠被剔除。由于手术并发症，大鼠应根据讨论部分所述原因予以剔除。诱导鼓膜穿孔和/或锤骨移位/切除（图2B）可引发CHL，导致行为学表现异常（即CHL大鼠对高强度dB SPL惊跳声无反应）。术前应使用耳镜检查大鼠，确保鼓膜正常；术后也应检查，以确认鼓膜已成功穿孔（图2；补充图1）。注意，不应出现出血或明显炎症（补充图2）。CHL诱导后的大鼠对高强度dB SPL拍击声无反应，而听力正常的对照笼伴则会因响亮拍击声跳跃。CHL大鼠并非完全听不见声音，而是存在传导性听力损失，因此仅表现出细微的行为变化5。听力正常的对照啮齿动物在受到高强度dB SPL声音（...

本文介绍了一种通过手术穿刺鼓膜诱导可重复的传导性听力损失的方案，并通过耳镜观察和拍击惊跳行为评估进行验证。

传导性听力损失（CHL）是人类中常见的一种听力障碍。本实验方案旨在描述一种简单的手术操作，用于……

本研究的总体目标是通过手术穿刺鼓膜诱导听力损失，并通过耳镜观察和拍手惊跳行为学评估来验证其效果。本实验的目的是建立一种人类传导性听力障碍的模型。在本实验中，我们演示了传导性听力损失的手术操作步骤，该方法简化了锤骨切除过程；同时展示了通过耳镜观察验证传导性听力损失的方法，以及一种简单的拍手惊跳行为学检测方法，用以确认传导性听力损失已成功建立。我们所描述方法的主要优势在于其非侵入性操作，通过耳镜验证传导性听力损失，并通过拍击惊吓反应进行确认。本研究及相关操作程序已获得香港城市大学、香港大学以及香港特别行政区卫生署动物研究伦理委员会的批准。在本实验方案中，我们选用大鼠作为实验动物，但您也可选择其他任何啮齿类动物。称量动物以确保腹腔注射麻醉剂量合适。麻醉时，确保动物接受适当剂量至关重要。抓住大鼠颈背部皮肤将其提起。确保使用正确剂量的氯胺酮和赛拉嗪进行腹腔注射，并完成注射。务必通过夹捏足趾来确认无痛觉反应。手术准备包括已麻醉的大鼠、显微剪刀和耳镜。请用乙醇彻底清洁手术区域。将手术巾铺在已清洁的台面上。随后放入剪刀、耳镜和大鼠。剪刀的尺寸取决于啮齿类动物的大小。在耳镜下观察大鼠的左耳和右耳，以确保鼓膜健康。抓住耳廓并拉伸外耳道，使其变得模糊且发黑。在此处引入显微剪刀。将显微剪刀引入外耳道中心，注意避免划伤组织。仔细聆听弹响声，然后旋转以确保锤骨脱位。应使用耳镜确认传导性听力损失手术是否成功。在手术前后，使用带有小直径窥耳器的耳镜评估每只大鼠的耳部。通过耳镜观察时，应仔细研究正常鼓膜与穿孔鼓膜之间的差异。左侧为正常的鼓膜，锤骨头部位置正常，与右侧穿孔的鼓膜有显著差异。右侧鼓膜在传导性听力损失手术后，锤骨发生移位，紧张部破裂，锤骨的鼓膜脐部及头部完全缺失。啮齿类动物的术后护理。将啮齿类动物置于温暖光源下的家中笼内，并注射抗菌剂和葡萄糖。通过行为性拍手惊吓反应验证传导性听力损失。将传导性听力损失大鼠与正常大鼠分别放置在相邻的两个笼子中。将这些放置于一个安静的房间内。站在半米远处，以相等的时间间隔拍手特定的次数。此处我们选择五次。此处为我们的代表性行为学实验结果。注意下方的大鼠对响亮的拍手声没有跳跃反应，而屏幕上方的大鼠则对这些响亮的拍手声表现出惊吓反应。请观察这两只大鼠在拍手前后的差异。未能成功诱导传导性听力损失。未能诱导传导性听力损失的原因可能是一侧或双侧耳朵出血。在此情况下，应实施安乐死。这表明剪刀未接触到鼓膜。操作过程中无爆裂声。没有爆裂声表明传导性听力损失手术操作不佳且不彻底。没有爆裂声意味着你的显微剪刀未与鼓膜直接接触。耳镜观察。如果通过耳镜观察时，鼓膜外观正常，则表明未发生传导性听力损失。对响亮拍手声测试有反应。这表明未发生传导性听力损失，且该啮齿类动物不存在传导性听力障碍。当大鼠跳跃或因突然的响亮拍手声受到惊吓时，就会发生这种情况。我们所描述方法的主要优点在于其非侵入性操作、通过耳镜验证传导性听力损失，以及通过拍手惊吓反应进行验证。完成该实验操作后，您可以在啮齿类动物模型中诱导传导性听力损失，并探究这种听力障碍的行为学和心理物理学表现。

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