磷酸化肽段富集联合非标记定量质谱法研究前列腺癌磷酸化蛋白质组

该方法有助于回答任何关注磷酸化信号的研究领域中的关键科学问题，例如在癌症研究领域中评估治疗耐药后信号网络的变化。该技术的主要优势在于，能够以相对简单且经济的方式鉴定出数千种磷酸化肽，从而对磷酸化蛋白质组进行全局性评估。采集肿瘤组织时，称取肿瘤重量，并在培养试管中每100毫克组织加入2毫升预冷的裂解缓冲液。

然后使用手持式或台式匀浆器对裂解液进行匀浆。为了还原并去除酒精，将离心管置于95摄氏度加热5分钟，随后在冰上冷却样品15分钟。保持样品处于冰上时，对裂解液进行三次超声处理，然后再次于95摄氏度加热5分钟。

将超声处理管放入摆桶式转子中，在15摄氏度下以3,500 g离心15分钟，然后收集上清液并弃去沉淀。为消化裂解液，使用100毫摩尔的Tris将样品稀释12倍，以降低胍盐浓度。对于5毫克蛋白质，加入10微克赖氨酰内肽酶（lysyl endopeptidase）或Lys-C，并在室温下孵育5至6小时。

将TPCK处理的胰蛋白酶以每毫升含一毫克的浓度溶于含20毫摩尔氯化钙的一毫摩尔盐酸溶液中，并按胰蛋白酶与蛋白质1:100的比例加入胰蛋白酶。将样品于37摄氏度孵育三小时。然后向管中再加入一份胰蛋白酶等分试样，并将样品于37摄氏度过夜孵育。

将样品加入一个15毫升、截留分子量为10千道尔顿的滤膜管中。在水平转头或固定角转头离心机中，以3,500 g、15摄氏度离心，直至截留液体积小于250微升。然后收集穿滤液，并弃去截留物。

为了酸化样品，每毫升裂解液中加入约 20 微升的 5% 三氟乙酸（TFA）。充分混匀管内液体，并使用 pH 试纸测定 pH 值。如有需要，可额外加入 5% TFA 将 pH 值调节至 2.5。

接下来，将C18柱的较短一端连接至真空 manifold。将真空压力调节至17至34千帕后，使用3毫升100%乙腈和玻璃移液管润湿柱子。用玻璃移液管加入两份各3毫升的0.1%三氟乙酸（TFA），以平衡柱子。

然后将酸化后的样品上样到柱中。用三份每份三毫升的0.1% TFA溶液洗涤柱子。接着加入两毫升40%乙腈（ACN）含0.1% TFA的溶液洗脱样品，并将洗脱液收集到两个每份两毫升的玻璃培养管中。

用封口膜覆盖洗脱管，并用20号针头在膜上戳3至5个孔，然后将样品冷冻干燥过夜。每份样品用0.5毫升预冷的免疫沉淀或IP结合缓冲液重新溶解冻干粉末。将第二份样品中的0.5毫升重悬液转移至含有第一份样品的离心管中，并保留移液器吸头。

在将内容转移至冻存管之前，使用另外 0.5 毫升 IP 缓冲液冲洗每个冻干管，然后用 2 毫升 IP 缓冲液重复冲洗一次。使用剪去尖端的 P200 移液器将 0.5 毫克/毫升的抗体磁珠悬液原液转移至微量离心管后，加入 450 微升预冷的 IP 结合缓冲液，以洗涤 50 微升 4G10 抗体磁珠悬液和 25 微升 27 B10.4 抗体磁珠悬液。在 4°C 条件下，以 100 ×g 离心 1 分钟。

吸去上清液后，加入与原始浆液等体积的免疫沉淀结合缓冲液重悬珠子。将预洗过的pY珠子加入螺口冻存管中的重悬样品溶液，然后在4摄氏度下于翻转摇床中孵育过夜。离心沉淀珠子后，保留上清液，用于富集pST肽段。

接下来，使用 300 微升 IP 结合缓冲液重悬磁珠，并将其转移至一个 2 毫升微量离心管中。在 4 摄氏度、100 ×g 条件下离心 1 分钟，使样品沉淀。随后用 500 微升 IP 结合缓冲液洗涤磁珠 3 次。

用450微升25毫摩尔的碳酸氢铵（pH 7.5）洗涤磁珠四次。将加样枪头轻轻插入磁珠表面以下，彻底吸除上清液。向磁珠中加入四倍于磁珠体积的0.1%三氟乙酸（TFA）。

然后充分混匀，并将离心管置于恒温混匀仪中，在 1,000 rpm、37 摄氏度条件下孵育 15 分钟。将重悬液转移至 0.2 微米离心滤膜管中，在 850 ×g 条件下离心 1 分钟。将洗脱液转移至低蛋白吸附的微量离心管后，于 40 摄氏度下真空浓缩至干燥，加热时间为 300 分钟，可过夜进行。

为制备尖端内含有的二氧化钛微珠，加入 200 微升 100% 乙腈。然后将尖端倒置，并轻弹窄端，使液体移向帽端。使用剃刀刀片切割尖端，并将其置于低蛋白结合力离心管上方。

然后取下盖子，插入微量移液器，吸出残留的乙腈，再重复洗涤步骤。用 500 微升 100% 乙腈预处理二氧化钛两次。然后用 500 微升 0.2 摩尔磷酸钠缓冲液（pH 7）平衡二氧化钛两次。

最后，用 300 微升平衡缓冲液洗涤磁珠三次。向低蛋白结合管中加入 400 微升 50%乙腈 0.1%三氟乙酸。然后加入 84 微升乳酸。

将重悬的磷酸化肽转移至低蛋白结合管中，使用翻转混合仪在室温下孵育一小时。离心沉淀微珠后，用300 µL平衡缓冲液洗涤两次，并离心沉淀。再用300 µL漂洗缓冲液将微珠漂洗两次。

然后将它们转移至0.2微米的离心滤膜管中。离心后，将滤膜单元转移至一支洁净的1.5毫升低蛋白结合离心管中，加入200微升0.9%的氨水，重复洗脱两次。检测pH值后，将洗脱液在真空条件下浓缩过夜，以彻底蒸发氨。

为了进行质谱分析而对肽段进行脱盐，需将磷酸化肽段用15微升含0.1%三氟乙酸（TFA）的溶液重新溶解。使用结合容量为5微克的C18吸附小柱对样品进行纯化，并按照制造商提供的操作步骤进行。最后，通过真空浓缩将洗脱液完全干燥，再将干燥后的磷酸化肽段重新悬浮于12.5微升质谱分析用溶液中。

该预先消化裂解液的考马斯亮蓝染色凝胶证实了蛋白质的存在，而消化后裂解液的染色则用于确认消化是否完全。在完全消化的情况下，除lys-C对应的30千道尔顿条带和胰蛋白酶对应的23.3千道尔顿条带外，15千道尔顿以上不应出现任何条带。添加lys-C还可减少漏切位点的数量。

pY 免疫沉淀能有效分离 pY 和 pST 肽段，pY 制备样品中鉴定出的磷酸化肽段平均有 85% 为 pY，而 pST 制备样品中鉴定出的磷酸化肽段超过 99% 为 pST。两种样品均使用二氧化钛富集磷酸化肽段。质谱就绪样品中磷酸化肽段的预期比例为 30% 至 50%，且检测到的大多数磷酸化肽段含有单个或两个磷酸基团。

进行质谱分析后，将质谱原始文件载入质谱分析软件。如图所示，设定定位概率阈值大于0.75，可分别过滤掉约5%的pY肽段、15%的pS肽段和34%的pT肽段。在应用这些过滤条件后，质谱分析结束时预期的磷酸化肽段鉴定数量约为：起始蛋白量为5毫克时，可鉴定到约300个pY肽段；在相应的富集样品中，起始肽段量为2.5毫克时，可鉴定到约7,500个pS肽段和640个pT肽段。

一旦掌握，如果 pY 和 pST 步骤并行进行，则该技术可在六天内完成。然而，当样本数量超过八个时，为降低技术误差，应将步骤按顺序执行，额外需要四天时间。在进行这些操作时，重要的是要牢记关注细节。

每一步都至关重要，可能影响最终样品的质量，包括必要的质量控制环节尤为关键。观看本视频后，您应能够充分掌握如何提取并消化蛋白质，继而进行磷酸化肽段的富集，以通过质谱分析研究磷酸化蛋白质组的全局变化。