磷酸浓缩结合无标签定量质谱法研究前列腺癌的 Phosphoproteome

该方法可以帮助回答磷酸化信号感兴趣的任何研究领域（例如癌症领域）中的关键问题，以评估治疗耐药后信号转导网络的变化。该技术的主要优点是，可以以相对简单且廉价的方式鉴定数千种磷酸肽，以全面评估磷酸化蛋白质组。要收获肿瘤组织，请称量肿瘤并在培养试管中，每 100 毫克组织添加 2 毫升冰冷的裂解缓冲液。

然后使用手持式或台式均质器对裂解物进行均质化。要减少样品并使其醇化，请将试管在 95 摄氏度下加热 5 分钟，然后将样品在冰上冷却 15 分钟。在冰上，对裂解物进行超声处理 3 次，然后在 95 摄氏度下加热样品 5 分钟。

将超声处理管放入摆动的桶式转子中，将裂解物在 3、500 g 和 15 摄氏度下离心 15 分钟，然后收集上清液并丢弃沉淀。要消化裂解物，请使用 100 毫摩尔 tris 将样品稀释 12 倍，以减少胍的量。对于 5 mg 蛋白质，加入 10 μg 赖氨酰内肽酶或 lys-C，并在室温下孵育样品 5 至 6 小时。

在 1 毫摩尔 HCL 中制备 1 毫克/毫升 TPCK 处理的胰蛋白酶，其中含有 20 毫摩尔氯化钙和胰蛋白酶，以 1 比 100 的胰蛋白酶与蛋白质比例添加。将样品在 37 摄氏度下孵育 3 小时。然后向试管中加入额外的胰蛋白酶等分试样，并将样品在 37 摄氏度下孵育过夜。

将样品添加到 15 ml 10 kdalton 截止过滤器中。将样品放入水平桶或固定角转子中，以 3、500 g 和 15 摄氏度离心，直到截留物体积小于 250 μL。然后收集流出物并丢弃截留物。

要使样品酸化，每毫升裂解物中加入约 20 微升 5% 三氟乙酸或 TFA。将试管充分混合并使用 pH 试纸测量 pH 值。如有必要，添加额外的 5% TFA 以将 pH 值调节至 2.5。

接下来，将 C18 色谱柱的短端连接到真空歧管。将真空设置在 17 至 34 千帕之间后，使用 3 毫升 100% 乙腈和玻璃移液管润湿色谱柱。使用玻璃移液管并应用两个 3 ml 的 0.1% TFA 等分试样来平衡色谱柱。

然后将酸化的样品加载到色谱柱上。使用三个 3 mL 体积的 0.1 TFA 清洗色谱柱。然后加入 2 毫升 40% ACN 0.1%TFA 洗脱样品，并将两个 2 mL 馏分收集到玻璃培养管中。

用封口膜盖住洗脱液管，用 20 号针头在盖子上打 3 到 5 个孔，然后将样品冻干过夜。在每个组分中用 0.5 毫升冰冷免疫沉淀或 IP 结合缓冲液重悬冻干粉。将 0.5 mL 重悬体积从第二个组分转移到具有第一个组分的试管中，并保存移液器吸头。

在将内容物转移到冻干管之前，再使用另外 0.5 mL 的 IP 缓冲液冲洗每个冻干管，然后使用 2 mL 的 IP 缓冲液重复冲洗。使用带有切割尖端的 P200 将每毫升 0.5 毫克抗体微珠浆液转移到微量离心管中后，加入 450 微升冰冷的 IP 结合缓冲液，在微量离心管中洗涤 50 微升 4G10 抗体微珠浆液和 25 微升 27 B10.4 抗体微珠浆液。将试管以 100 g 和 4 摄氏度离心 1 分钟。

吸出上清液后，加入与 IP 结合缓冲液的原始浆液相等体积的 IP 结合缓冲液，以重悬珠子。将预洗的 pY 珠子添加到螺旋盖冻存管中重悬的样品溶液中，然后在 4 摄氏度下在端对端旋转器上孵育过夜。旋转珠子后，保存将用于富集 pST 肽的上清液。

接下来，使用 300 μL IP 结合缓冲液重悬珠子，并将其转移到 2 mL 微量离心管中。将样品在 100 g 和 4 摄氏度下离心 1 分钟。然后用 500 μL 的 IP 结合缓冲液，洗涤珠子 3 次。

用 450 微升 25 毫摩尔碳酸氢铵 pH 7.5 洗涤珠子四次。将凝胶上样尖端浸入微珠表面略低于微珠表面，并完全吸出上清液。向珠子中加入四倍体积的 0.1% TFA。

然后将它们充分混合，并将试管在热混合器中以 1， 000 rpm 和 37 摄氏度的温度孵育 15 分钟。将重悬液转移到 0.2 微米离心过滤器中，并以 850 g 离心过滤器 1 分钟。将洗脱液转移到低蛋白结合微量离心管中后，将洗脱液在 40 摄氏度下真空浓缩至干燥，加热时间为 300 分钟过夜。

要制备吸头中包含的氧化钛珠，请添加 200 微升 100% ACN。然后将其倒置并轻弹窄端，将液体移向盖子。使用剃须刀片切开尖端并将其放在低蛋白结合管上。

然后取下盖子并插入微量移液器，在重复洗涤之前取出剩余的 ACN。用 500 微升 100% 乙腈对二氧化钛进行两次预处理。然后用 500 微升 0.2 摩尔磷酸钠缓冲液 pH 7 对二氧化钛进行两次调节。

最后，使用 300 μL 平衡缓冲液洗涤珠子 3 次。向低蛋白结合管中加入 400 微升 50% ACN 0.1%TFA。然后加入 84 微升乳酸。

将重悬的磷酸肽转移到低蛋白结合管中，并使用端到端旋转器在室温下孵育 1 小时。沉淀珠子后，使用 300 μL 平衡缓冲液洗涤两次并离心。用 300 μL 冲洗缓冲液，冲洗珠子两次。

然后将它们转移到 0.2 微米的自旋过滤器中。离心后，将过滤单元转移到干净的 1.5 ml 低蛋白结合管中，用 200 μL 0.9% 铵水溶液洗脱内容物两次。检查 pH 值后，将洗脱液真空浓缩至干燥过夜以蒸发氨。

要对肽进行脱盐以进行 MS 分析，请用 15 微升 0.1% TFA 重构磷酸肽。使用结合能力为 5 μg 的 C18 吸头清洁样品，并遵循制造商的方案。最后，通过真空浓缩完全干燥洗脱体积后，将干燥的磷酸肽重悬于 12.5 μL 质谱溶液中。

这种预消化裂解物的考马斯染色凝胶可确认蛋白质的存在，而消化后裂解物的染色可确认完全消化。为了完全消化，除了 lys-C 和胰蛋白酶的 30 kdalton 和 23.3 kdalton 条带外，不应出现在 15 kdalton 以上。加入 lys-C 还可以减少漏缺切割的数量。

pY 免疫沉淀可有效分离 pY 和 pST 肽，平均从 pY 制备物中鉴定出的磷酸肽中有 85% 是 pY，从 pST 制备物中鉴定出的磷酸肽中超过 99% 是 pST。在两种制剂中，二氧化钛都用于富集磷酸肽。MS 即用型制备物中磷酸化肽的预期百分比在 30% 至 50% 之间，并且检测到的大多数磷酸肽具有单磷酸基团或双磷酸基团。

执行质谱分析后，将 MS 原始文件加载到 MS 分析软件中。如此处所示，将定位概率截止值设置为大于 0.75 可分别过滤掉大约 5% 的 pY 肽以及 15% 和 34% 的 pS 和 pT 肽。应用这些过滤器后，MS 分析结束时的预期磷酸肽鉴定数量约为 5 mg 起始蛋白的 300 pY 肽，以及来自相应富集制剂的 2.5 mg 起始肽量的磷酸肽鉴定约 7， 500 pS 肽和 640 pT 肽。

一旦掌握，如果 pY 和 pST 步骤同时进行，则可以在 6 天内完成这项技术。但是，对于超过 8 个样品，请按顺序执行这些步骤，以减少额外四天内的技术错误。在尝试这些程序时，请务必记住关注细节。

每个步骤都很重要，并且会影响最终制剂的质量，包括必要的质量控制至关重要。观看此视频后，您应该对如何提取和消化蛋白质有很好的了解，然后通过质谱法进行磷酸肽富集分析，以研究磷酸化蛋白质组的整体变化。