小鼠蛛网膜下腔出血模型脑血管痉挛量化的容积法
2018年7月28日
本文的目的是提出一种方法, 允许3维脑血管树重建后, 小鼠的微计算机断层扫描和确定的整个血管段, 可用于量化脑血管痉挛的数量小鼠蛛网膜下腔出血模型。
该程序的总体目标是量化诱导蛛网膜下腔出血后小鼠的脑输精管痉挛。这是通过使用不透射线的铸型剂对动物进行经心灌注和血管内石膏固定来实现的。下一步是通过对大脑进行微计算机断层扫描来获取横截面图像数据。
然后处理图像和数据。Miro 软件用于虚拟重建颅内血管树并计算确定的血管段的体积，这代表了量化血管痉挛的客观测量方法。在异氟醚麻醉下，通过血管内细丝穿孔诱导小鼠蛛网膜下腔出血。
左颈外动脉通过手术准备。然后将细丝插入颈外动脉并通过颈内动脉向颅内推进，颈内动脉在颈动脉 t 处穿孔，诱发蛛网膜下腔出血。颅内压升高被视为血管内穿孔成功的指标。
要分析输精管痉挛，请诱导麻醉。只有在达到足够的麻醉水平后才继续，这可以通过对疼痛刺激没有反应来证实。使用以下解决方案进行经心灌注。
一种生理盐溶液，含有生理浓度的钠、钾、钙和镁，pH 值为 7 点 4。然后，使用 4% PFA 溶液。从 1 号溶液开始 2 分钟，然后继续使用 2 号溶液 4 分钟。
在 37 摄氏度的温度下注入溶液，并使用具有可变灌注速率的压力控制泵以 70 毫米汞柱的恒定压力灌注。避免在从溶液 1 切换到溶液 2 时压力损失。用两种溶液灌注后，在室温下以每分钟 2 毫升的恒定速率，用不透射线的灌注剂继续灌注 20 分钟。
将样品保持在 4 摄氏度下以固化不透射线的铸造材料过夜。并取出大脑并将样品在 4 摄氏度下储存在 4% PFA 溶液中直至微量凝固。用钝的解剖钳将大脑放在塑料管的中间。
选择直径略大于样品的试管，以确保物体在图像采集过程中不会移动。用纱布封闭管子。通过 X 射线舱中计算机导航控制定位系统的微型步进电机连接塑料管，其中物体围绕其水平轴旋转。
在X 射线照相下的视野中对齐样品。为了获得最大放大倍率，请将物体放置在尽可能靠近 X 射线源的位置，并尽可能增加与探测器的距离。使用具有以下扫描参数的 Step and Shoot 图像采集协议。
将每个投影的曝光时间设置为 1 秒，并使用 80 KB 的管电压来优化信噪比。将一次旋转的投影数设置为 1， 000。对于原始数据的重建，请使用过滤后的反向投影算法，这意味着 Shepp-Logan 滤波器的矩阵为 1， 024 立方体素。
使用函数 import 将 dicom 数据导入 Miro 软件。使用函数 vol-run 可视化容器树。选择可视化阈值，以清晰的轮廓描绘大脑动脉。
对于属于实验系列的所有数据集，使用相同的可视化阈值非常重要。虚拟解剖 Circle of Willis 的基底脑动脉，通过用 cur-zon包围血管来增加功能体积。然后虚拟剖析要分析的血管段。
因此，旋转维管树的三维模型，以便将所有小分支与主动脉精确分离。对于进一步的分析，必须删除除要分析的船舶段之外的所有船舶。将函数 auto skeleton with threshold set to visualization threshold（将阈值设置为可视化阈值）函数，生成基于中心线的空间图。
然后将函数 spatial graph to line set 应用于线集，以创建线集。通过用光标手动选择单个子段并单击拆分，将线集划分为多个子段。此步骤对于计算单个子段的体积至关重要。
使用函数 line set to spatial graph 再次创建空间图。使用函数 spatial graph statistics 确定每个子分段的长度、体积和直径。对于颜色编码的可视化，表示血管直径的走向，请使用函数 spatial graph view。
将线段着色设置为与血管直径相关的厚度。为属于实验系列的所有数据集选择相同的色图非常重要。添加子区段的长度以确定哪些子区段将包含在进一步分析中。
在本研究中，我们评估了一个血管段，该血管段由 1 毫米的颈内动脉、颈动脉 t 近端和颈动脉远端的 2 点 5 毫米组成。然后添加体积以确定已定义容器段的容器体积。为了评估血管树虚拟重建的准确性，我们在 10 个大脑样本中两个解剖定义点的血管直径和从 3-D 虚拟重建之间进行了基于直径的比较。
为了显微测定血管直径，使用高分辨率相机、软件校准工具、千分尺刻度，显微镜和虚拟测定的直径之间没有显着差异。表明颅内血管解剖结构的准确虚拟重建。为了量化脑基底痉挛，我们确定了预定义的代表性三点 5 毫米血管段的体积，该血管段由 1 毫米 IC8 和左侧的两个点 5 毫米 MCA 组成。
在来自 SAH 和假手术动物的脑样本中。与假手术相比，SAH 的血管体积显着降低，表明脑输精管痉挛。与假手术相比，SAH 的血管直径也显着降低。
使用此处介绍的方法实现的虚拟重建准确地反映了血管解剖结构。可以检查整个血管段，可能比测定单个点的血管直径更客观地量化血管痉挛。与仅评估血管直径相比，体积评估导致血管痉挛性和非血管痉挛性血管之间的差异更大。
概述
本研究介绍了一种利用微计算机断层扫描对小鼠脑血管树进行三维重建的方法，用于量化蛛网膜下腔出血后脑血管痉挛。该技术结合了经心脏灌注、血管内铸造和先进的图像处理方法，以测量血管体积。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 脑血管研究
- 成像技术
背景
- 脑血管痉挛是蛛网膜下腔出血后的一种严重并发症。
- 了解血管反应对于开发治疗策略至关重要。
- 三维重建可提供血管变化的深入信息，并量化血管痉挛的严重程度。
- 现有方法在测量损伤后血管变化时可能存在精度不足的问题。
研究目的
- 建立一种在小鼠中定量脑血管痉挛的可靠技术。
- 加深对蛛网膜下腔出血后脑血管变化的理解。
- 促进对血管形态和功能的客观评估。
使用的方法
- 该研究采用显微计算机断层扫描技术对脑血管系统进行成像。
- 小鼠在诱导产生蛛网膜下腔出血后接受血管内灌注造影。
- 关键步骤包括经心脏灌注生理溶液和放射性造影剂。
- 使用 Miro 软件处理成像和数据，以可视化并分析血管结构。
- 显微镜下测量与虚拟重建之间的血管直径进行了准确比较。
主要结果
- 该方法实现了颅内血管树的精确三维重建。
- 显微测量与虚拟方法在血管直径测量上无显著差异，表明具有高准确性。
- 血管节段分析为评估血管痉挛严重程度提供了客观的量化指标。
- 该研究强调了采用标准化成像阈值以确保不同数据集间一致性的关键作用。
结论
- 本研究展示了一种评估小鼠模型中脑血管痉挛的新方法，具有较高的准确性。
- 该方法提高了对出血性损伤后血管变化进行定量分析的能力。
- 研究结果对于理解脑血管动力学及开发新的治疗策略具有重要意义。
常见问题
行业高管相关性
在临床前模型中量化脑血管痉挛仍是中风药物开发中的一个关键挑战，需要客观的血管指标来降低机制假设的风险，并支持决策的制定。该体积测量方法提供了一种可重复的、基于影像的读数，通过从单一时间点的血管直径测量转向整合的血管段分析，提高了靶点验证的预测可信度。该方法在小鼠蛛网膜下腔出血（SAH）模型中的应用，能够实现对血管病理变化的标准化评估，支持从发现到临床前评价的转化连续性。
生物制药研发中的策略性应用
早期发现与靶点验证
- 科学价值：通过提供脑血管痉挛作为病理生理学终点的客观容积测量指标，能够验证治疗假设。
- 操作价值：通过精确的脑血管树三维重建，支持生物学风险降低，减少对间接或单点测量的依赖。
- 预测价值：通过量化整个血管节段的血管变化，增强靶点可信度，提高在疾病相关系统中与功能结局的相关性。
筛选与检测方法开发
- 科学价值：生成标准化的定量血管容积数据，可在血管痉挛模型的不同实验条件下实现可靠比较。
- 操作价值：建立了一套可重复的工作流程，结合经心灌注、血管内铸造和显微CT成像，实现一致的血管表型分析。
- 可扩展性：通过保持固定的可视化阈值和分割方案，便于在纵向或比较分析研究中跨项目重复使用该平台。
转化与临床前研究
- 转化连续性：通过提供一种与临床血管痉挛病理相似的疾病相关体系，将发现阶段的血管定量与临床前验证相连接。
- 机制性风险降低：能够对血管痉挛严重程度进行客观评估，支持在临床前研究流程中基于风险调整的推进决策。
- 预测可靠性：体积定量评估相较于仅测量直径的指标，对血管痉挛性变化具有更高的敏感性，从而提升临床前研究结果的预测价值。
流程与工作流整合
该方法适用于从发现到临床前研究的连续过程，支持在早期发现阶段进行假设验证、在筛选阶段实现检测准备就绪，以及在转化研究中验证血管表型。
- 发现生物学：通过量化蛛网膜下腔出血后的血管痉挛这一可测量的生物学反应，支持假设验证和通路阐明。
- 筛选：提供即用于检测的、具有高度可重复性的定量血管输出结果，实现对化合物或基因型的可靠比较。
- 分析：基于空间图统计学提供体积、长度和直径测量数据，为不同条件间的比较提供多维度的读数。
- 转化研究：通过提供与疾病相关的血管指标，契合临床前研究的连续性，可用于指导与生物标志物相一致的疗效评估。
- 企业级复用：建立了一个标准化的血管定量分析平台，可应用于除蛛网膜下腔出血外的多种脑血管损伤模型。
运营与企业影响
- 科学价值：通过客观的脑血管痉挛体积定量分析，提高靶点验证的预测可信度。
- 操作价值：通过固定的成像阈值、灌注方案和半自动化的三维重建工作流程，确保标准化与可重复性。
- 战略价值：减少血管痉挛建模中的机制不确定性，降低后期生物学风险，从而优化“推进/终止”决策。
- 项目组合影响：基于可靠的临床前血管表型数据，实现对候选对象的风险校正优先排序。
实施注意事项
- 成功的血管铸型与成像需要具备显微外科、灌注技术以及微计算机断层扫描（micro-CT）操作方面的专业知识。
- 依赖于获取微计算机断层扫描系统和三维可视化软件（例如 Miro）的权限，以进行图像采集与分析。
- 需要跨团队对可视化阈值和分割协议进行标准化，以确保不同实验组之间结果的一致性。
- 在将该方法应用于不同血管节段或模型系统时，需考虑适应性问题，并通过基于直径的准确性验证加以确认。
- 由于该检测为离体（ex vivo）性质，仅能捕捉终点血管形态，无法反映实时动态的血管痉挛进展过程，因而存在局限性。
