Name: 小鼠蛛网膜下腔出血模型脑血管痉挛量化的容积法 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-28T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 12 s
Description: 学习使用微计算机断层扫描和血管内铸型技术对小鼠蛛网膜下腔出血后脑血管痉挛进行三维重建和体积量化。该方法通过经心脏灌注和Miro软件分析，为脑血管形态学评估提供客观指标。

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本研究的部分内容属于T. Pantel提交给美因茨约翰内斯·古滕贝格大学医学院的博士论文。本研究得到了Friedhelm Frees基金会和神经外科学研究基金会（资助编号：A.N.）的资助。

动物实验已获得负责动物护理的委员会（Landesuntersuchungsamt Rheinland-Pfalz）批准，并依照德国动物福利法（TierSchG）进行。所有实验均遵循适用的国际、国家和机构关于动物护理和使用的指南。
本研究使用雄性C57BL6小鼠（年龄10-12周）。简言之，在异氟烷麻醉下，通过血管内细丝穿刺法诱导蛛网膜下腔出血。手术暴露左侧颈外动脉，随后将细丝插入颈外动脉，并经颈内动脉向颅内推进，在颈动脉T形分叉处穿破血管，从而诱发蛛网膜下腔出血。颅内压升高被视为血管内&#160;穿刺成功的一个指标。关于小鼠蛛网膜下腔出血的血管内细丝穿刺模型，已有其他研究者发表了详细的操作方案8,14。
1. 灌注与血管内铸型
<ol>
	<li>本研究中，在诱导蛛网膜下腔出血（SAH）后72小时进行灌注。通过腹腔注射给予每克体重5 µg的咪达唑仑、每克体重30 ng的芬太尼和每克体重0.5 µg的美托咪啶以诱导麻醉。仅在达到充分麻醉水平后继续操作，麻醉充分的标志是对疼痛刺激无反应。</li>
	<li>打开胸腔，用21G套管穿刺左心室，切开右心房，并按其他文献所述方法夹闭降主动脉15。</li>
	<li>使用以下溶液进行经心脏灌注：(i) 含MgCl2和CaCl2、pH为7.4、含1 g/L葡萄糖的杜氏磷酸盐缓冲液（Dulbecco's Phosphate Buffered Saline），以及(ii) 4%多聚甲醛溶液。
	<ol>
		<li>先用溶液(i)灌注2分钟，随后用溶液(ii)灌注4分钟。</li>
		<li>灌注液温度维持在37 °C，使用压力可控泵并调节灌注速率，以保持70 mmHg的恒定压力，该压力已被证实为分析小鼠脑血管痉挛的最佳灌注压力16。在由溶液(i)切换至溶液(ii)时，应避免压力下降。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在使用溶液(i)和(ii)灌注完成后，继续以0.2 ml/min的恒定速率在室温下灌注显影造影剂（见材料表）20分钟。</li>
	<li>将显影造影材料置于4 °C环境中过夜固化。随后按先前描述的方法取出脑组织17，将样本转移至4%多聚甲醛溶液中，并在4 °C保存直至进行显微CT扫描。</li>
</ol>
2. 微型计算机断层扫描
<ol>
	<li>使用钝头解剖镊子将脑组织置于塑料管的中心位置。选择直径略大于样本的管子，以确保在图像采集过程中样本不会移动。用纱布封住管口。</li>
	<li>将塑料管固定在X射线舱内计算机导航控制（CNC）定位系统的微步进电机上，使样本围绕其水平轴旋转。</li>
	<li>在X射线透视下将样本对准视野中心。为获得最大放大倍数，应将样本尽可能靠近X射线源，并尽可能增大样本与探测器之间的距离。</li>
	<li>采用步进式扫描图像采集协议，扫描参数设置如下：每个投影的曝光时间为1秒，以优化信噪比（SNR）；管电压为80 kV（电流为38 µA）；旋转360°，共采集1,000个投影图像。</li>
	<li>对原始数据进行重建时，使用滤波反投影算法，应用Shepp-Logan滤波器，重建矩阵为1024 × 1024 × 1024体素，并使用重建软件（见材料表）。将生成的DICOM数据导入3D可视化软件进行后续分析（见材料表）。</li>
</ol>
3. 颅内血管树的三维重建及血管体积测定
注意： 可通过使用 help 功能查阅可视化软件各项功能的背景信息。
<ol>
	<li>使用导入功能将Dicom数据导入可视化软件中。</li>
	<li>使用Volren功能可视化血管树。选择合适的可视化阈值，使大脑主要动脉呈现清晰的轮廓。对于属于同一系列实验的所有数据集，必须使用相同的可视化阈值。</li>
	<li>使用VolumeEdit功能对基底脑动脉（Willis环）进行虚拟解剖，即用光标圈选目标血管。随后，对拟分析的血管段进行虚拟分离。为此，旋转血管树的三维模型，以精确分离主干动脉上的所有小分支。为确保后续分析的准确性，必须删除除目标血管段以外的所有其他血管。</li>
	<li>应用Autoskeleton功能，将阈值设置为可视化阈值，以生成基于中心线的SpatialGraph。</li>
	<li>接着应用SpatialGraphToLineSet功能创建线集。通过光标手动选择各个子段，并点击&#34;拆分&#34;，将线集划分为独立的子段。此步骤对于计算各子段体积至关重要。</li>
	<li>使用LineSetToSpatialGraph 功能重新生成Spatial Graph。</li>
	<li>使用SpatialGraphStatistics 功能测定各子段的长度、体积和直径。为实现以颜色编码显示血管直径变化趋势的可视化效果，使用SpatialGraphView功能。将分段着色方式设为&#34;厚度&#34;，该选项与血管直径相关联。对于属于同一系列实验的所有数据集，必须使用相同的颜色映射方案。</li>
	<li>将各子段长度相加，以确定哪些子段应纳入后续分析。在本研究中，我们评估的血管段包括颈动脉T形分叉近端1 mm的颈内动脉段以及远端2.5 mm的中脑动脉段。随后将各子段体积相加，以确定所定义血管段的总体积。</li>
</ol>

<ol><li>Macdonald, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delayed+neurological+deterioration+after+subarachnoid+haemorrhage%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neurology%22%5BJournal%5D)">Delayed neurological deterioration after subarachnoid haemorrhage.</a> Nature Reviews Neurology. 10 (1), 44-58 (2014).</li>
<li>Dorsch, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+clinical+review+of+cerebral+vasospasm+and+delayed+ischaemia+following+aneurysm+rupture%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neurochirurgica+Supplement%22%5BJournal%5D)">A clinical review of cerebral vasospasm and delayed ischaemia following aneurysm rupture.</a> Acta Neurochirurgica Supplement. 110 (Pt 1), 5-6 (2011).</li>
<li>Vergouwen, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Definition+of+delayed+cerebral+ischemia+after+aneurysmal+subarachnoid+hemorrhage+as+an+outcome+event+in+clinical+trials+and+observational+studies%3A+Proposal+of+a+multidisciplinary+research+group%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Definition of delayed cerebral ischemia after aneurysmal subarachnoid hemorrhage as an outcome event in clinical trials and observational studies: Proposal of a multidisciplinary research group.</a> Stroke. 41 (10), 2391-2395 (2010).</li>
<li>Friedrich, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CO2+has+no+therapeutic+effect+on+early+microvasospasm+after+experimental+subarachnoid+hemorrhage%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cerebral+Blood+Flow+%26+Metabolism%22%5BJournal%5D)">CO2 has no therapeutic effect on early microvasospasm after experimental subarachnoid hemorrhage.</a> Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 34 (8), e1-e6 (2014).</li>
<li>Friedrich, B., Muller, F., Feiler, S., Scholler, K., Plesnila, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+subarachnoid+hemorrhage+causes+early+and+long-lasting+microarterial+constriction+and+microthrombosis%3A+An+in+vivo+microscopy+study%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cerebral+Blood+Flow+%26+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Experimental subarachnoid hemorrhage causes early and long-lasting microarterial constriction and microthrombosis: An in vivo microscopy study.</a> Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 32 (3), 447-455 (2012).</li>
<li>Terpolilli, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitric+oxide+inhalation+reduces+brain+damage%2C+prevents+mortality%2C+and+improves+neurological+outcome+after+subarachnoid+hemorrhage+by+resolving+early+pial+microvasospasms%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cerebral+Blood+Flow+%26+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Nitric oxide inhalation reduces brain damage, prevents mortality, and improves neurological outcome after subarachnoid hemorrhage by resolving early pial microvasospasms.</a> Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 36 (12), 2096-2107 (2016).</li>
<li>Neulen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+segmentation-based+volumetric+approach+to+localize+and+quantify+cerebral+vasospasm+based+on+tomographic+imaging+data%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A segmentation-based volumetric approach to localize and quantify cerebral vasospasm based on tomographic imaging data.</a> PLoS One. 12 (2), e0172010(2017).</li>
<li>Schuller, K., Buhler, D., Plesnila, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+murine+model+of+subarachnoid+hemorrhage%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A murine model of subarachnoid hemorrhage.</a> Journal of Visualized Experiments. (81), e50845(2013).</li>
<li>Altay, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+method+for+subarachnoid+hemorrhage+to+induce+vasospasm+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">A novel method for subarachnoid hemorrhage to induce vasospasm in mice.</a> Journal of Neuroscience Methods. 183 (2), 136-140 (2009).</li>
<li>Momin, E. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+delivery+of+nitric+oxide+inhibits+leukocyte+migration+and+prevents+vasospasm+in+haptoglobin+2-2+mice+after+subarachnoid+hemorrhage%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosurgery%22%5BJournal%5D)">Controlled delivery of nitric oxide inhibits leukocyte migration and prevents vasospasm in haptoglobin 2-2 mice after subarachnoid hemorrhage.</a> Neurosurgery. 65 (5), 937-945 (2009).</li>
<li>Froehler, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vasospasm+after+subarachnoid+hemorrhage+in+haptoglobin+2-2+mice+can+be+prevented+with+a+glutathione+peroxidase+mimetic%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Neurocience%22%5BJournal%5D)">Vasospasm after subarachnoid hemorrhage in haptoglobin 2-2 mice can be prevented with a glutathione peroxidase mimetic.</a> Journal of Clinical Neurocience. 17 (9), 1169-1172 (2010).</li>
<li>Lin, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+murine+model+of+subarachnoid+hemorrhage-induced+cerebral+vasospasm%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">A murine model of subarachnoid hemorrhage-induced cerebral vasospasm.</a> Journal of Neuroscience Methods. 123 (1), 89-97 (2003).</li>
<li>Marbacher, S., Fandino, J., Kitchen, N. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standard+intracranial+in+vivo+animal+models+of+delayed+cerebral+vasospasm%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Neurosurgery%22%5BJournal%5D)">Standard intracranial in vivo animal models of delayed cerebral vasospasm.</a> British Journal of Neurosurgery. 24 (4), 415-434 (2010).</li>
<li>Feiler, S., Friedrich, B., Scholler, K., Thal, S. C., Plesnila, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardized+induction+of+subarachnoid+hemorrhage+in+mice+by+intracranial+pressure+monitoring%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Standardized induction of subarachnoid hemorrhage in mice by intracranial pressure monitoring.</a> Journal of Neuroscience Methods. 190 (2), 164-170 (2010).</li>
<li>Ghanavati, S., Yu, L. X., Lerch, J. P., Sled, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+perfusion+procedure+for+imaging+of+the+mouse+cerebral+vasculature+by+X-ray+micro-CT%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">A perfusion procedure for imaging of the mouse cerebral vasculature by X-ray micro-CT.</a> Journal of Neuroscience Methods. 221, 70-77 (2014).</li>
<li>Parra, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+model+of+subarachnoid+hemorrhage+associated+cerebral+vasospasm%3A+methodological+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Neurological+research%22%5BJournal%5D)">Mouse model of subarachnoid hemorrhage associated cerebral vasospasm: methodological analysis.</a> Neurological research. 24 (5), 510-516 (2002).</li>
<li>Boulay, A. C., Saubamea, B., Decleves, X., Cohen-Salmon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+Mouse+Brain+Vessels%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Purification of Mouse Brain Vessels.</a> Journal of Visualized Experiments. 105 (e53208), (2015).</li>
<li>Marjamaa, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mice+with+a+deletion+in+the+first+intron+of+the+Col1a1+gene+develop+dissection+and+rupture+of+aorta+in+the+absence+of+aneurysms%3A+High-resolution+magnetic+resonance+imaging%2C+at+4.7+T%2C+of+the+aorta+and+cerebral+arteries%5BTitle%5D)+AND+%22Magnetic+Resonance+in+Medicine%22%5BJournal%5D)">Mice with a deletion in the first intron of the Col1a1 gene develop dissection and rupture of aorta in the absence of aneurysms: High-resolution magnetic resonance imaging, at 4.7 T, of the aorta and cerebral arteries.</a> Magnetic Resonance in Medicine. 55 (3), 592-597 (2006).</li>
<li>Schambach, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrafast+high-resolution+in+vivo+volume-CTA+of+mice+cerebral+vessels%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Ultrafast high-resolution in vivo volume-CTA of mice cerebral vessels.</a> Stroke. 40 (4), 1444-1450 (2009).</li>
<li>Figueiredo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+digital+subtraction+angiography%2C+micro-computed+tomography+angiography+and+magnetic+resonance+angiography+in+the+assessment+of+the+cerebrovascular+system+in+live+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Neuroradiology%22%5BJournal%5D)">Comparison of digital subtraction angiography, micro-computed tomography angiography and magnetic resonance angiography in the assessment of the cerebrovascular system in live mice.</a> Clinical Neuroradiology. 22 (1), 21-28 (2012).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

小鼠蛛网膜下腔出血（SAH）模型是基础SAH研究的重要工具。脑血管痉挛常被用作研究SAH后迟发性脑缺血（DCI）发生机制的实验研究中的终点指标9,11。然而，在小鼠或其他小型动物SAH模型中定量评估脑血管痉挛具有挑战性。通常，血管痉挛通过在血管内灌注和铸型后离体测量特定解剖位置的血管直径7,9,12，或通过组织学切片上特定血管周长的测定来量化10,11。然而，这些方法存在一些缺点：仅在特定解剖位置评估血管痉挛，邻近血管节段的痉挛可能被遗漏；组织学伪影是另一误差来源。此外，评估过程可能具有较大主观性，因为血管直径测量的具体位置由研究者人为确定。
因此，目标是建立一种通过横断面成像数据计算全脑血管节段容积来量化脑血管痉挛的方法7。本文所介绍的容积法最重要的优势在于，能够对整个血管节段进行检查，从而避免了必须定义某个特定点以测量血管直径的问题。对整个血管节段进行评估的另一个优势在于，与在特定点测量血管直径相比，该方法可能提供一种更为客观的血管痉挛量化参数，因为在特定点测量时，近端或远端血管的痉挛可能被遗漏。采用颜色编码对血管直径进行数字化显示，可直观地评估血管痉挛程度。此外，如代表性结果所示，容积评估相比血管直径评估，能够在痉挛血管之间产生更大的差异。本方法实现的虚拟重建能够准确反映血管解剖结构。这一点在代表性系列评估中得到证实：显微镜下测量的血管直径与数字重建所得的血管直径相似，重现了先前研究的观察结果7。然而，尽管该方法具有诸多优势，仍需进一步研究以评估其是否优于传统的血管痉挛分析方法。
该方法的一个局限性在于，与脑组织铸型样本的显微分析或组织学分析相比，所需时间更长（每例脑样本的显微CT扫描时间为90分钟，数据处理时间为45分钟）。此外，显微CT扫描仪的可及性可能限制该方法的应用。本研究中所检测的动物数量足以证明本文所述方案的可行性。然而，若该方案用于治疗性研究，则需根据预期对血管体积和直径的影响来计算所需的动物数量。本研究及其他采用小鼠蛛网膜下腔出血（SAH）模型的研究的另一个局限性在于，血管痉挛的判定 离体这使得无法开展纵向研究，以在SAH诱导前评估基线值，并在不同时间点观察血管痉挛情况。尽管已有研究证明，可以显示小鼠颅内大血管的解剖结构 体内 使用磁共振断层成像18，计算机断层扫描血管造影19或数字减影血管造影20据我们所知，这些方法尚未被用于分析小鼠SAH模型中的脑血管痉挛 体内值得注意的是，本文所展示的通过数字重建脑血管并随后对脑血管痉挛进行容积评估的方法并不仅限于在 离体 micro CT 数据。如果未来能够获得高分辨率的小鼠脑部血管横断面成像，便可用于对血管痉挛进行容积分析 体内.

动脉瘤性蛛网膜下腔出血（SAH）是出血性卒中的一种亚型，为神经重症监护病房中的常见疾病。除早期脑损伤（EBI）外——EBI指由出血事件本身引起的脑损害——另一影响患者预后的关键因素是迟发性脑缺血（DCI），其定义为因脑灌注受损或脑梗死导致的临床恶化，且不与介入或外科手术相关1,2,3。导致DCI的重要机制一方面包括大脑大血管的血管痉挛；另一方面，微循环功能障碍（包括微血管痉挛和微血栓形成）以及与皮质扩布性抑制相关的缺血也起着重要作用（详见Madonald 20141）。因此，在临床实践中诊断大脑大血管的血管痉挛至关重要，并且是许多临床和实验研究中的一个重要终点指标。
尽管小鼠SAH模型中的血管痉挛特征不能直接外推至人类患者，但近年来，与SAH相关的血管痉挛小鼠模型的重要性日益增加。在这些模型中，SAH通过血管内丝线穿刺法诱导产生4,5,6,7,8, 池内血管横断9，或将血液注入脑脊液10,11,12与传统上用于研究脑血管痉挛的大型动物SAH模型相比13，小鼠模型具有显著优势，即存在大量可用的转基因小鼠品系，使其成为研究导致血管痉挛和迟发性脑缺血（DCI）分子机制的理想工具。然而，在小鼠中确定脑血管痉挛具有挑战性。这是因为与大型动物模型不同，在大型动物模型中可利用临床影像技术检测血管痉挛， 体内 目前尚无可用于分析小鼠脑血管痉挛的成像方法。因此，脑血管痉挛通常通过组织学切片来确定10,11 或在脑血管铸型后进行显微观察7,9,12然而，这些技术的缺点在于仅能在特定位置测量血管直径。
根据之前的一项研究7本论文提出了一种在小鼠蛛网膜下腔出血（SAH）模型中对脑血管痉挛进行客观且可重复分析的方法。该方法基于脑血管的灌注与血管铸型技术， 离体 微型CT扫描、血管树的数字重建以及全脑血管体积的后续评估

<table><tbody><tr><td>美托咪定&amp;nbsp;</td><td>辉瑞，德国卡尔斯鲁厄</td><td>未提供</td><td></td></tr><tr><td>咪达唑仑</td><td>Ratiopharm，乌尔姆，德国</td><td>未提供</td><td></td></tr><tr><td>芬太尼&amp;nbsp;</td><td>Curamed，德国卡尔斯鲁厄</td><td>未提供</td><td></td></tr><tr><td>Venofix 21G</td><td>德国美因河畔美尔松根，B. Braun Melsungen AG</td><td>未提供</td><td>21G套管针&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>杜尔贝科&amp;rsquo;含 MgCl₂ 和 CaCl₂ 的磷酸盐缓冲液，pH 7.4&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich，德国汉堡</td><td>D8662&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>4% 甲醛溶液&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich，德国汉堡</td><td>100496</td><td></td></tr><tr><td>Microfil MV-122&amp;nbsp;</td><td>Flowtech公司，美国马萨诸塞州卡弗</td><td>无可用数据</td><td>放射显影的</td></tr><tr><td>微型计算机断层扫描系统 Y.Fox</td><td>Yxlon，德国加布森</td><td>未提供</td><td></td></tr><tr><td>重建工作室软件版本 1.2.8.1</td><td>TeraRecon，德国法兰克福</td><td>无可用数据</td><td>重建软件</td></tr><tr><td>Amira 软件版本 5.4.2&amp;nbsp;</td><td>美国俄勒冈州希尔斯伯勒，FEI 可视化科学集团</td><td>无可用数据</td><td>可视化软件</td></tr><tr><td>PHD ultra 注射泵</td><td>哈佛仪器</td><td>70-3</td><td>压力控制泵</td></tr><tr><td>解剖镊（钝头）</td><td>B Braun Melsungen AG，德国美尔森</td><td>160323_v&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Infinity X-21</td><td>Deltapix，丹麦马奥洛夫</td><td>未提供</td><td>高分辨率相机</td></tr><tr><td>DeltaPix Insight 软件版本 2.0.1</td><td>Deltapix，丹麦马奥洛夫</td><td>未提供</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6小鼠</td><td>查尔斯河实验室，科隆，德国</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

一种用于量化蛛网膜下腔出血小鼠模型中脑血管痉挛的容积法

A Volumetric Method for Quantification of Cerebral Vasospasm in a Murine Model of Subarachnoid Hemorrhage

蛛网膜下腔出血（SAH）是出血性卒中的一种亚型。出血后发生的脑血管痉挛是决定患者预后的重要因素，因此常被用作研究终点。然而，在SAH的小动物研究中，脑血管痉挛的量化仍面临重大挑战。本文介绍了一种离体（ex vivo）方法，可对完整血管节段的体积进行量化，从而作为量化脑血管痉挛的客观指标。首先，使用一种放射性显影的铸型剂对脑血管系统进行血管内铸型；随后，通过显微计算机断层扫描（micro computed tomography）获取横断面成像数据；最后一步包括对虚拟血管树进行三维重建，并采用算法计算所选血管节段的中心线和体积。通过将解剖标本与其虚拟重建模型进行基于直径的比较，验证了该方法可实现高度精确的脑血管树虚拟重建。与仅测量血管直径相比，血管体积能更显著地揭示SAH模型小鼠与假手术小鼠之间痉挛性与非痉挛性血管的差异。

颅内血管树的三维虚拟重建
三维重建的颅内血管树提供了高度精确的血管解剖结构（图1）。为评估其准确性，我们在两个解剖学定义的位点（1：颈动脉T形分叉远端1 mm处的左侧大脑中动脉（MCA）；2：颈动脉T形分叉远端1 mm处的右侧MCA）对显微镜下测得的血管直径与三维虚拟重建所得的直径进行了基于直径的比较。显微镜下血管直径的测定采用高分辨率相机（Infinity X-21，Deltapix），并使用校准至微米刻度的DeltaPix Insight 2.0.1版软件。本次评估共分析了10个脑组织样本（5个SAH样本，5个假手术样本），这些样本来自一系列12只小鼠，其中7只诱导了SAH，5只接受了假手术（SAH组中有2只动物分别于术后第1天和第2天死亡）。显微镜测定与虚拟重建所得直径之间无显著差异，表明颅内血管解剖结构的虚拟重建具有较高的准确性（显微镜测定 vs. 虚拟重建，均值±标准误：左侧MCA 150 ± 9 µm vs. 左侧MCA 150 ± 8 µm；右侧MCA 153 ± 8 µm vs. 154 ± 9 µm，见 图2）。
SAH 小鼠脑血管痉挛的量化
为量化脑血管痉挛，(i) 测定了预定义的代表性血管段（左侧1 mm长的颈内动脉（ICA）和2.5 mm长的MCA，共3.5 mm）的体积，(ii) 并测定了两个解剖学定位点（左侧和右侧MCA）的血管直径，样本来自蛛网膜下腔出血（SAH）组和假手术组动物（n = 5）。SAH组的血管体积显著低于假手术组（36 ± 4 nL vs. 71 ± 9 nL，p &lt; 0.05）。与假手术组相比，SAH组的血管直径更小（左侧MCA：140 ± 11 µm vs. 160 ± 10 µm，p = 0.11；右侧MCA：130 ± 16 µm vs. 158 ± 13 µm，p &lt; 0.05；见图3），但仅右侧MCA的差异达到统计学显著性水平。
<img alt="脑血管示意图；3D 模型显示血管网络和血流分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57997/57997fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 1"> 
图 1. 颅内血管树的虚拟重建。（A）显示一个代表性脑组织样本；（B）显示对应的虚拟重建血管树。（C）左侧大脑中动脉（MCA）管径的彩色编码可视化图像。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57997/57997fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="左、右大脑中动脉血管直径比较；显微镜与微计算机断层扫描数据的柱状图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57997/57997fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 2"> 
图2．脑血管数字重建的准确性。 来自三维重建脑样本的平均直径测量值与显微镜下测定值的比较。数据以均值±均值标准误表示。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57997/57997fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="蛛网膜下腔出血组与假手术组动物血管直径和体积比较；柱状图显示统计分析结果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57997/57997fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 3"> 
图3．蛛网膜下腔出血后血管体积与血管直径。 (A) 通过三维重建血管系统测量的蛛网膜下腔出血组与假手术组小鼠大脑中动脉（MCA）直径的比较。(B) 蛛网膜下腔出血组与假手术组小鼠的血管体积。数据以均值±均值的标准误表示。*p &lt; 0.05。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57997/57997fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>

本文旨在介绍一种方法，该方法可在小鼠微计算机断层扫描后实现脑血管树的三维重建，并测定整个血管节段的体积，可用于量化蛛网膜下腔出血小鼠模型中的脑血管痉挛。

蛛网膜下腔出血（SAH）是出血性卒中的一种亚型。出血后发生的脑血管痉挛是影响病情发展的重要因素……

本实验的总体目标是在诱导小鼠蛛网膜下腔出血后，定量评估其脑血管痉挛程度。该目标通过经心脏灌注和血管内铸型技术实现，使用一种放射性显影的铸型剂完成血管铸型。下一步是通过对脑组织进行显微计算机断层扫描（micro-CT），获取脑血管的横断面图像数据。然后进行图像和数据处理。使用 Miro 软件对颅内血管树进行虚拟重建，并计算特定血管节段的体积，这些体积可作为量化血管痉挛的客观指标。在异氟烷麻醉下，通过血管内细丝穿孔法在小鼠中诱导蛛网膜下腔出血。通过手术暴露左侧颈外动脉，随后将一根细丝插入颈外动脉，并经颈内动脉向颅内推进，在颈动脉分叉处穿破血管，从而诱导蛛网膜下腔出血。颅内压升高被视为血管内穿孔成功的指标。为分析血管痉挛，需先诱导麻醉。只有在达到充分的麻醉水平后方可继续操作，麻醉充分的标志是对疼痛刺激无反应。使用以下溶液进行经心脏灌注。一种生理盐溶液，含有生理浓度的钠、钾、钙和镁，pH 值为 7.4。随后使用 4% PFA 溶液。先用第一种溶液灌注 2 分钟，再用第二种溶液继续灌注 4 分钟。以37摄氏度的温度输注溶液，并使用压力可控且灌注速率可调的泵，以70毫米汞柱的恒定压力进行灌注。从溶液一转换至溶液二时，避免压力损失。完成两种溶液的灌注后，继续在室温下以每分钟0.2毫升的恒定速率灌注放射性显影剂20分钟。将样本置于4°C条件下过夜，使放射性显影铸型材料固化。随后取出脑组织，并将样本保存在4°C的4% PFA溶液中，直至进行显微CT扫描。使用钝头解剖镊将脑组织置于塑料管的中央位置。选择一个直径略大于样品的管子，以确保物体在图像采集过程中不会移动。使用纱布封闭管子。将塑料管连接到X射线舱内计算机导航控制定位系统的微步进电机上，使物体绕其水平轴旋转。在X射线透视下将样品置于视野中对齐。为实现最大放大倍数，应将样品尽可能靠近X射线源，并尽可能增大样品与探测器之间的距离。采用步进扫描成像采集程序，并使用以下扫描参数。将每次投影的曝光时间设置为1秒，并使用80千伏的管电压以优化信噪比。一次旋转的投影数量设置为1,000。对于原始数据的重建，采用滤波反投影算法，使用Shepp-Logan滤波器，重建矩阵为1,024立方体素。使用导入功能将 DICOM 数据导入 Miro 软件。利用 vol-run 功能可视化血管树。选择合适的可视化阈值，使大脑主要动脉呈现清晰的轮廓。对于属于同一系列实验的所有数据集，必须使用相同的可视化阈值。利用 cur-zon 工具围绕血管添加功能体积，对 Willis 环的基底脑动脉进行虚拟解剖，然后对需要分析的血管节段进行虚拟解剖。因此，旋转血管树的三维模型，以精确分离主动脉以外的所有细小分支。为了后续分析，必须删除待分析血管段以外的所有血管。应用“自动骨架化”功能，将阈值设置为可视化阈值，从而生成基于空间图的中心线。然后对线集应用空间图函数，以创建线集。通过使用光标手动选择各个子段并点击拆分，将线集划分为独立的子段。此步骤对于计算各个子段的体积至关重要。将函数线设置为“空间图”以再次创建空间图。使用“空间图统计”函数确定每个子段的长度、体积和直径。对于以颜色编码的可视化，表示血管直径的变化过程，请使用“空间图视图”函数。将片段着色设置为厚度，其与血管直径相关。对于属于同一系列实验的所有数据集，必须选择相同的颜色映射。添加子片段的长度，以确定哪些子片段应纳入后续分析。在本研究中，我们评估了一段血管，包括颈动脉分叉近端一毫米的颈内动脉部分，以及颈动脉分叉远端二点五毫米的大脑动脉部分。随后将各部分体积相加，以确定所定义血管段的总体积。为了评估血管树虚拟重建的准确性，我们在十个脑样本中，于两个解剖学定义明确的位置，对显微镜下测得的血管直径与三维虚拟重建所得的血管直径进行了基于直径的比较。为进行血管直径的显微测量，采用了高分辨率相机、软件校准工具和微米刻度尺；显微测量与虚拟测量所得直径之间无显著差异，表明颅内血管解剖结构的虚拟重建具有较高的准确性。为定量评估脑底血管痉挛，我们测定了左侧一段预设的代表性血管段体积，该血管段长3.5毫米，包括1毫米的IC8段和2.5毫米的大脑中动脉（MCA）段。在来自蛛网膜下腔出血（SAH）和假手术动物的脑组织样本中，SAH组的血管体积显著低于假手术组，表明存在脑血管痉挛。与假手术组相比，SAH组的血管直径也显著减小。通过本方法实现的虚拟重建能够准确反映血管解剖结构。可对完整的血管节段进行检查，这可能比仅在单一点位测量血管直径提供更为客观的血管痉挛量化参数。与仅评估血管直径相比，容积评估可揭示痉挛性与非痉挛性血管之间更显著的差异。

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小鼠蛛网膜下腔出血模型脑血管痉挛量化的容积法

动脉瘤性蛛网膜下腔出血（SAH）是指动脉瘤破裂后血液流入蛛网膜下腔所引起的出血。尽管由于治疗手段的不断改进，该疾病的发病率和死亡率已呈下降趋势，但蛛网膜下腔出血后脑血管痉挛的风险仍与数年前持平。自1979年Barry et al. 首次在实验性脑血管痉挛模型中使用大鼠以来，建立一种全面且可重复的动物模型以识别脑血管痉挛的启动事件，一直是研究的重点。早期在大鼠中的研究表明，向小脑延髓池单次注射自体血可导致急性（数分钟内发生）但不会引起迟发性脑血管痉挛3, 6,...

一种低死亡率的大鼠模型用于评估实验性蛛网膜下腔出血后迟发性脑血管痉挛

本视频演示了建立蛛网膜下腔出血大鼠模型的操作步骤。对麻醉后的大鼠植入探针，用于测量颅内压和脑血流量。确定目标位置后，将针头插入视交叉前位置。随后将自体血注入蛛网膜下腔，导致颅内压升高、脑血流量下降，从而成功建立模型。...

建立自体血注射诱导的蛛网膜下腔出血大鼠模型

一种蛛网膜下腔出血的小鼠模型

本方案描述了重复性缺氧预处理，即短暂暴露于全身性缺氧，可减少小鼠短暂性大脑中动脉闭塞后脑梗死体积及血脑屏障的破坏。同时，本文还详细说明了脑卒中后脑梗死体积与血脑屏障破坏的双重定量方法，以评估神经血管保护作用的疗效。...

重复性缺氧预处理及小鼠短暂性大脑中动脉闭塞后神经血管保护作用的量化

本方案中，我们描述了一种通过向小脑延髓池两次注射自体全血来建立标准化的蛛网膜下腔出血（SAH）小鼠模型的方法。这种双次注射操作具有高度的标准化，属于一种中度至急性SAH模型，且在死亡率方面相对安全。...

经大池双次直接注射血液作为蛛网膜下腔出血模型

本文旨在介绍一种基于超声成像的方法，该方法能够 体内 小鼠脑动脉血流成像。我们展示了该技术在蛛网膜下腔出血（SAH）小鼠模型中用于测定与血管痉挛相关的血流速度变化的应用。...

利用高频经颅双功能超声分析小鼠蛛网膜下腔出血模型中的脑血管痉挛

蛛网膜下腔出血在人类中仍具有较高的死亡率和致残率。为了促进对该疾病及其病理生理机制的进一步研究，本文介绍了一种视交叉前单次注射模型。...

在大鼠模型中通过视交叉前单次注射自体血诱导实验性蛛网膜下腔出血

本文介绍了一种标准化的蛛网膜下腔出血（SAH）小鼠模型，通过血管内细丝穿刺法诱导，并在术后24小时结合磁共振成像（MRI）以确认出血部位准确，并排除其他相关的颅内病理改变。...

蛛网膜下腔出血的血管内穿孔模型结合磁共振成像（MRI）

本方案中描述的小鼠自体血注射脑出血模型采用双次注射技术，以最大限度降低血液沿针道反流的风险，泵系统中不使用抗凝剂，并且消除了系统中的所有死腔和可扩张的管路。...

自体血注射法建立小鼠自发性脑内出血模型

本文描述了从分离的海马体制备急性脑切片的方法，以及在刺激Schaffer侧支的同时，对辐射层中的星形胶质细胞和神经元进行同步电生理记录的技术。同时演示了药理学分离星形胶质细胞钾离子和谷氨酸转运体电流的方法。...

急性海马脑片中突触激活的星形胶质细胞与神经元反应的双通道电生理记录

学习使用微计算机断层扫描和血管内铸型技术对小鼠蛛网膜下腔出血后脑血管痉挛进行三维重建和体积量化。该方法通过经心脏灌注和Miro软件分析，为脑血管形态学评估提供客观指标。

一种用于量化蛛网膜下腔出血小鼠模型中脑血管痉挛的容积法

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