小鼠蛛网膜下腔出血模型脑血管痉挛量化的容积法
July 28th, 2018
本文的目的是提出一种方法, 允许3维脑血管树重建后, 小鼠的微计算机断层扫描和确定的整个血管段, 可用于量化脑血管痉挛的数量小鼠蛛网膜下腔出血模型。
该程序的总体目标是量化诱导蛛网膜下腔出血后小鼠的脑输精管痉挛。这是通过使用不透射线的铸型剂对动物进行经心灌注和血管内石膏固定来实现的。下一步是通过对大脑进行微计算机断层扫描来获取横截面图像数据。
然后处理图像和数据。Miro 软件用于虚拟重建颅内血管树并计算确定的血管段的体积，这代表了量化血管痉挛的客观测量方法。在异氟醚麻醉下，通过血管内细丝穿孔诱导小鼠蛛网膜下腔出血。
左颈外动脉通过手术准备。然后将细丝插入颈外动脉并通过颈内动脉向颅内推进，颈内动脉在颈动脉 t 处穿孔，诱发蛛网膜下腔出血。颅内压升高被视为血管内穿孔成功的指标。
要分析输精管痉挛，请诱导麻醉。只有在达到足够的麻醉水平后才继续，这可以通过对疼痛刺激没有反应来证实。使用以下解决方案进行经心灌注。
一种生理盐溶液，含有生理浓度的钠、钾、钙和镁，pH 值为 7 点 4。然后，使用 4% PFA 溶液。从 1 号溶液开始 2 分钟，然后继续使用 2 号溶液 4 分钟。
在 37 摄氏度的温度下注入溶液，并使用具有可变灌注速率的压力控制泵以 70 毫米汞柱的恒定压力灌注。避免在从溶液 1 切换到溶液 2 时压力损失。用两种溶液灌注后，在室温下以每分钟 2 毫升的恒定速率，用不透射线的灌注剂继续灌注 20 分钟。
将样品保持在 4 摄氏度下以固化不透射线的铸造材料过夜。并取出大脑并将样品在 4 摄氏度下储存在 4% PFA 溶液中直至微量凝固。用钝的解剖钳将大脑放在塑料管的中间。
选择直径略大于样品的试管，以确保物体在图像采集过程中不会移动。用纱布封闭管子。通过 X 射线舱中计算机导航控制定位系统的微型步进电机连接塑料管，其中物体围绕其水平轴旋转。
在X 射线照相下的视野中对齐样品。为了获得最大放大倍率，请将物体放置在尽可能靠近 X 射线源的位置，并尽可能增加与探测器的距离。使用具有以下扫描参数的 Step and Shoot 图像采集协议。
将每个投影的曝光时间设置为 1 秒，并使用 80 KB 的管电压来优化信噪比。将一次旋转的投影数设置为 1， 000。对于原始数据的重建，请使用过滤后的反向投影算法，这意味着 Shepp-Logan 滤波器的矩阵为 1， 024 立方体素。
使用函数 import 将 dicom 数据导入 Miro 软件。使用函数 vol-run 可视化容器树。选择可视化阈值，以清晰的轮廓描绘大脑动脉。
对于属于实验系列的所有数据集，使用相同的可视化阈值非常重要。虚拟解剖 Circle of Willis 的基底脑动脉，通过用 cur-zon包围血管来增加功能体积。然后虚拟剖析要分析的血管段。
因此，旋转维管树的三维模型，以便将所有小分支与主动脉精确分离。对于进一步的分析，必须删除除要分析的船舶段之外的所有船舶。将函数 auto skeleton with threshold set to visualization threshold（将阈值设置为可视化阈值）函数，生成基于中心线的空间图。
然后将函数 spatial graph to line set 应用于线集，以创建线集。通过用光标手动选择单个子段并单击拆分，将线集划分为多个子段。此步骤对于计算单个子段的体积至关重要。
使用函数 line set to spatial graph 再次创建空间图。使用函数 spatial graph statistics 确定每个子分段的长度、体积和直径。对于颜色编码的可视化，表示血管直径的走向，请使用函数 spatial graph view。
将线段着色设置为与血管直径相关的厚度。为属于实验系列的所有数据集选择相同的色图非常重要。添加子区段的长度以确定哪些子区段将包含在进一步分析中。
在本研究中，我们评估了一个血管段，该血管段由 1 毫米的颈内动脉、颈动脉 t 近端和颈动脉远端的 2 点 5 毫米组成。然后添加体积以确定已定义容器段的容器体积。为了评估血管树虚拟重建的准确性，我们在 10 个大脑样本中两个解剖定义点的血管直径和从 3-D 虚拟重建之间进行了基于直径的比较。
为了显微测定血管直径，使用高分辨率相机、软件校准工具、千分尺刻度，显微镜和虚拟测定的直径之间没有显着差异。表明颅内血管解剖结构的准确虚拟重建。为了量化脑基底痉挛，我们确定了预定义的代表性三点 5 毫米血管段的体积，该血管段由 1 毫米 IC8 和左侧的两个点 5 毫米 MCA 组成。
在来自 SAH 和假手术动物的脑样本中。与假手术相比，SAH 的血管体积显着降低，表明脑输精管痉挛。与假手术相比，SAH 的血管直径也显着降低。
使用此处介绍的方法实现的虚拟重建准确地反映了血管解剖结构。可以检查整个血管段，可能比测定单个点的血管直径更客观地量化血管痉挛。与仅评估血管直径相比，体积评估导致血管痉挛性和非血管痉挛性血管之间的差异更大。
概述
本研究提出了一种使用微型计算机断层扫描技术对小鼠脑血管树进行三维重建的方法，用于定量分析蛛网膜下腔出血后脑血管痉挛。该技术结合了心脏灌注、血管内铸型和先进的图像处理，以测量血管体积。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 脑血管研究
- 成像技术
背景
- 脑血管痉挛是蛛网膜下腔出血后的一个关键并发症。
- 了解血管反应对于制定治疗策略至关重要。
- 三维重建可以提供对血管变化的洞察，并定量评估血管痉挛的严重程度。
- 现有的方法在测量损伤后血管变化时可能缺乏精确性。
研究目的
- 建立一种可靠的技术，用于定量评估小鼠脑血管痉挛。
- 提高对蛛网膜下腔出血后脑血管变化的理解。
- 促进对血管形态和功能的客观评估。
使用的方法
- 研究利用微型计算机断层扫描技术对脑血管系统进行成像。
- 小鼠在诱导蛛网膜下腔出血后进行血管内铸型。
- 关键步骤包括用生理溶液和不透射线铸型剂进行心脏灌注。
- 使用Miro软件处理成像和数据，以可视化和分析血管结构。
- 比较显微镜和虚拟重建之间的血管直径精确测量。
主要结果
- 该方法允许精确的颅内血管树三维重建。
- 显微镜和虚拟方法之间的血管直径测量没有显著差异，表明高精确度。
- 血管段分析为评估血管痉挛严重程度提供了客观指标。
- 研究强调了标准化成像阈值对于数据集一致性的重要性。
结论
- 本研究展示了一种新的、准确的方法，用于评估小鼠模型中的脑血管痉挛。
- 它增强了对出血性损伤后血管变化的定量分析能力。
- 研究结果对于理解脑血管动力学和开发新的治疗方法具有重要意义。
常见问题
Executive Industry Relevance
Quantifying cerebral vasospasm in preclinical models remains a critical challenge in stroke drug development, where objective vascular metrics are needed to de-risk mechanistic hypotheses and support go/no-go decisions. This volumetric method provides a reproducible, imaging-based readout that enhances predictive confidence in target validation by moving beyond single-point diameter measurements to integrated vessel segment analysis. Its application in murine SAH models enables standardized assessment of vascular pathology, supporting translational continuity from discovery through preclinical evaluation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by providing objective volumetric metrics of cerebral vasospasm as a pathophysiological endpoint.
- Operational Value: Supports biological de-risking through accurate 3D reconstruction of the cerebrovascular tree, reducing reliance on indirect or single-point measurements.
- Predictive Value: Enhances target confidence by quantifying vascular changes across entire vessel segments, improving correlation with functional outcomes in disease-relevant systems.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates standardized, quantitative vessel volume outputs that enable reliable comparison between experimental conditions in vasospasm models.
- Operational Value: Establishes a reproducible workflow combining transcardiac perfusion, endovascular casting, and micro-CT imaging for consistent vascular phenotyping.
- Scalability: Facilitates platform reuse across studies by maintaining fixed visualization thresholds and segmentation protocols for longitudinal or comparative analyses.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects discovery-phase vascular quantification to preclinical validation by providing a disease-relevant system that mirrors clinical vasospasm pathology.
- Mechanistic De-risking: Enables objective assessment of vasospasm severity, supporting risk-adjusted advancement decisions in preclinical pipelines.
- Predictive Confidence: Volumetric evaluation demonstrates greater sensitivity to vasospastic changes than diameter-only metrics, improving the predictive value of preclinical findings.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery-to-preclinical continuum, supporting hypothesis testing in early discovery, assay readiness in screening, and vascular phenotype validation in translational research.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by quantifying vasospasm as a measurable biological response to subarachnoid hemorrhage.
- Screening: Delivers assay-ready, quantitative vascular outputs with high reproducibility, enabling reliable compound or genotype comparisons.
- Analytics: Provides volumetric, length, and diameter measurements from spatial graph statistics, offering multidimensional readouts for condition comparison.
- Translational Research: Aligns with preclinical continuity by delivering disease-relevant vascular metrics that can inform biomarker-aligned efficacy assessments.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized vascular quantification platform applicable across multiple cerebrovascular injury models beyond SAH.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation through objective, volumetric quantification of cerebral vasospasm.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility via fixed imaging thresholds, perfusion protocols, and semi-automated 3D reconstruction workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by reducing mechanistic ambiguity in vasospasm modeling, lowering late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of candidates based on robust preclinical vascular phenotype data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microsurgery, perfusion techniques, and micro-CT operation for successful vascular casting and imaging.
- Depends on access to microcomputed tomography systems and 3D visualization software (e.g., Miro) for image acquisition and analysis.
- Necessitates cross-team standardization of visualization thresholds and segmentation protocols to ensure consistency across experimental groups.
- Involves adaptation considerations when applying the method to different vessel segments or model systems, validated through diameter-based accuracy checks.
- Limited by the ex vivo nature of the assay, which captures endpoint vascular morphology but not real-time dynamic vasospasm progression.
