Name: 哺乳动物系统 CRISPR 指南 RNA 克隆 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-02T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 48 s
Description: 学习CRISPR单链向导RNA表达质粒的一步克隆方法，通过Golden Gate克隆技术高效构建配对向导RNA载体。该方法简化基因编辑实验流程，适用于分子生物学与表观基因组工程研究。

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Sathiji Nageshwaranan 获得了弗里德赖希共济失调研究联盟（07340305-01）和国家共济失调基金会奖学金（7355538-01）的支持。Alejandro Chavez 获得了美国国家癌症研究所资助项目 5T32CA009216-34 和 Burroughs Wellcome 基金会医学科学家职业奖的支持。George M. Church 获得了美国国立卫生研究院（NIH）国家人类基因组研究中心资助项目 RM1 HG008525 以及怀斯生物启发工程研究所的支持。James J. Collins 感谢来自国防威胁降低局资助项目 HDTRA1-14-1-0006 和 Paul G. Allen 前沿研究组的支持。Alejandro Chavez 开发了双导向克隆方法。Sathiji Nageshwaran、Alejandro Chavez 和 Nan Cher Yeo 在所有作者的共同参与下撰写了本文稿。

注意：以下方案概述了如何使用在线工具进行gRNA设计（步骤1.1–1.4），这些步骤适用于本文所述的所有gRNA质粒构建方法。在确定目标gRNA后，将介绍订购所需寡核苷酸的步骤，以及将寡核苷酸插入表达载体的多种不同方法例如，pSB700）。本文介绍了两种克隆单个向导RNA表达载体的方法，分别为将片段连接至预先消化的表达载体（步骤2 - 7.3）和Golden Gate克隆法（步骤8 - 8.4）。此外，还详细阐述了一种通过聚合酶链式反应（PCR）结合Golden Gate克隆技术构建成对向导RNA表达载体的策略（步骤11 - 16）。最后，概述了进行常规实验的常用方法 E. coli 化学转化（步骤 9 - 9.6）以及表达载体序列验证（步骤 10 至 10.2.3）也一并进行了说明。
<ol>
	<li>使用在线工具设计gRNA寡核苷酸，步骤如下。
	<ol>
		<li>使用在线工具（如 sgRNA Scorer 2.0 在线工具，https://crispr.med.harvard.edu/sgRNAScorerV2/）设计 gRNA13 或替代工具，例如 Broad sgRNA 设计工具（http://portals.broadinstitute.org/gpp/public/analysis-tools/sgrna-design）14 以及其他几项15.</li>
		<li>使用基因名称、基因符号或原始DNA靶序列生成潜在的gRNA序列。 
		注意：将生成一个包含针对该基因或所提供序列的所有潜在gRNA的电子表格文件（.csv/.xls）。潜在gRNA的质量将被报告为 评分 如果使用的是sgRNA Scorer 2.0在线工具，或作为 靶向效率百分比 如果使用的是Broad sgRNA设计工具。这两种度量均基于靶上切割活性得出。</li>
		<li>考虑 脱靶活性 在gRNA筛选过程中对gRNA进行排序时。 
		注意：最佳的向导序列是指具有最高靶向效率和最低脱靶活性的序列。对于激活（CRISPRa）应用，gRNA 的设计应靶向转录起始位点（TSS）上游 1 - 200 bp 的区域。4,15对于抑制（CRISPRi），gRNA 的设计靶向范围为转录起始位点（TSS）上游 50 bp 至下游 300 bp 的区域。5为了利用Cas9切割使基因失活，应设计靶向起始密码子下游编码序列前10%–50%区域的gRNA（研究表明，靶向基因3’端的gRNA效率较低）13.</li>
		<li>确保用于Golden Gate克隆的寡核苷酸中不含内部BsmBI位点，否则会导致退火后的寡核苷酸被消化13.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>选择基因组靶序列并去除 3’ NGG PAM（仅保留原间隔序列）用于单个gRNA寡核苷酸序列的修饰（例如起始序列：CGCGTGCTCTCCCTCATCCATGG). 
	注：如果使用电子表格，以下公式可去除 3’ NGG： =LEFT(A2,LEN(A2)-3)，其中 A2 是包含靶序列和 PAM 的细胞。
	<ol>
		<li>附加 CACCG 到寡核苷酸的5’端。 
		注意：该序列连接至 pSB700 骨架后，将构成驱动 gRNA 转录的 U6 启动子的 3’ 端。“CACC”序列可确保寡核苷酸与经 BsmBI 消化后的 pSB700 载体的突出端兼容。“G”是聚合酶 III 启动子所必需的，可确保 gRNA 转录高效起始。使用以下公式在电子表格中执行此操作： =CONCATENATE(“CACCG”,(B2))，其中B2是包含原间隔序列的细胞例如，向原间隔序列添加5’端的CACCG序列：CACCGCGCGTGCTCTCCCTCATCCA（此为最终订购的正向寡核苷酸）。</li>
		<li>创建原间隔序列的反向互补序列（rc）。 
		注：例如，上述原间隔序列的反向互补序列为 TGGATGAGGGAGAGCACGCG。</li>
		<li>在rc原间隔序列的5’端添加AAAC。在rc原间隔序列（反向寡核苷酸）的3’端添加一个额外的C。 
		注意：“AAAC”序列可确保该寡核苷酸能够克隆至经BsmBI酶切的pSB700载体中。3’端额外的“C”用于与正向寡核苷酸上添加的起始“G”配对退火。请在电子表格中使用以下公式执行此操作 =CONCATENATE(“AAAC”,(C2),”C”)，其中 C2 为包含反向互补序列的单元格例如，AAACTGGATGAGGGAGAGCACGCGC（这是最终订购的反向寡核苷酸序列）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>订购寡核苷酸，寡核苷酸上无需额外修饰。
	<ol>
		<li>订购克隆反应所需的最低量的寡核苷酸，因为克隆反应仅需非常少量。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将冻干引物稀释至终浓度 100 &#956;M 在1x TE缓冲液（10 mM Tris-Cl，pH 7.5，含1 mM EDTA）中。</li>
	<li>1:1 分装正向与反向寡核苷酸例如, 10 &#956;L 各加入 PCR 带盖条状管中。 
	注意：使用多通道移液器可实现同时快速克隆多个gRNA。
	<ol>
		<li>涡旋并离心寡核苷酸混合物（100 × g，15 秒）。在进行连接反应前，于室温孵育5分钟。 
		注意：无需加热后再冷却寡核苷酸混合物以促进其退火。值得注意的是，可将3 - 4对gRNA寡核苷酸在单个反应中混合并进行退火。例如，混合 3 &#956;L 正向和 3 &#956;L 最多可从4对gRNA寡核苷酸中一起反转录寡核苷酸，总体积为 24 &#956;L). 退火所用寡核苷酸的体积可根据使用者的需求进行调整。 
		注意：步骤 6 - 7.3 描述了 pSB700 的预消化处理。如需替代方法，请参见步骤 8，该步骤描述了一步法 BsmBI 限制性连接反应。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>消化 1 - 5 &#956;g 所选pSB700引导表达载体与BsmBI的0.5 &#956;L 每 1 &#956;g）在室温下孵育1小时 55 &#176;C15. 在总体积为的条件下，对pSB700 gRNA表达载体进行消化处理 40 &#956;L (表1).
	<ol>
		<li>在1.5%（wt/vol）低熔点琼脂糖凝胶上电泳分析消化产物。</li>
		<li>切下与约 9 kb 大小片段相对应的已消化载体骨架条带，将凝胶切片置于 1.5 mL 微离心管中图1).</li>
		<li>使用商品化凝胶回收试剂盒，按照生产商说明书从琼脂糖凝胶中提取DNA。</li>
		<li>将 DNA 洗脱至 10 - 15 &#956;L 加入TE缓冲液（10 mM Tris，pH 7.5；10 mM Tris，pH 8.0）以获得浓缩的洗脱液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将第4步中退火的gRNA寡核苷酸连接至经BsmBI酶切的pSB700向导表达载体中 20 &#956;L 反应（表2) 用于将gRNA寡核苷酸克隆至预先消化的pSB700表达载体中。
	<ol>
		<li>首先加入水、缓冲液和 DNA，涡旋混匀后加入酶，酶添加后再次涡旋混匀一次，然后离心（100 × g，15 秒）。将反应体系在室温下孵育过夜。</li>
		<li>加入一个无插入片段的阴性对照反应，其中仅包含经 BsmBI 消化后的载体，不含退火的 gRNA 寡核苷酸插入片段。 1 &#956;L 水可代替该物质使用 1 &#956;L 用于无插入片段阴性对照的gRNA寡核苷酸</li>
		<li>进行转化（步骤9）。 
		注意：步骤8是步骤6-7.3中所述pSB700预消化方法的替代方案。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过Golden Gate克隆技术，利用BsmBI限制性连接一步法将gRNA寡核苷酸（步骤1-5.1中所述）插入pSB700载体。
	<ol>
		<li>配制主混合液（1x）——如果同时克隆多个gRNA，则先配制不含插入寡核苷酸的主混合液（表3）。将主混合液分装至PCR管中，使用多通道移液器从4.2步骤中加入gRNA寡核苷酸。设置不含插入片段的对照，使用 1 &#956;L 水。</li>
		<li>通过在同一反应中加入BsmBI酶和T4 DNA连接酶，可实现限制性消化与连接的同步进行（即，Golden Gate 克隆）。采用以下 Simple Gate 方案，在 1 个反应中同时消化载体并连接插入片段：将反应体系保持在 37 &#176;C 2小时，于 50 &#176;C 10 分钟，于 65 &#176;C 15分钟，于 80 &#176;C 15 分钟，最后保持 4 &#176;C.
		<ol>
			<li>值得注意的是，在使用此方法前，需确认寡核苷酸不含 BsmBI 位点。若待克隆的 gRNA 中含有 BsmBI 限制性酶切位点，则在加入 BsmBI 后会被消化，从而导致无法获得任何转化子。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>在初始的 Simple Gate 反应后，加入额外的 0.5 &#956;L 向每个反应中加入 BsmBI 酶，并将反应管放回 55 &#176;C 1 h。消化结束后，将反应置于 4 &#176;C 或者将其冻存，待准备转化时再使用。第二轮限制性酶切孵育可从反应混合物中去除任何未被消化或重新连接的野生型pSB700载体骨架，从而确保只有成功插入寡核苷酸片段的载体保持完整，并能够产生转化子。</li>
		<li>进行转化（步骤9）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>转化 0.5 &#956;L 反应混合物的 8 &#956;L 的有感受态的 E. coli [例如，NEB DH5α (1 - 3 x 109 cfu/&#181;g pUC19 DNA）或 NEB Stable 1 - 3 x 109 cfu/&#181;g pUC19 DNA）。对于慢病毒质粒，使用NEB Stable感受态细胞可获得更稳定的质粒产量。
	<ol>
		<li>移除 E. coli 从 -80°C 储存条件下取出80 &#176;C 并在冰上解冻5 - 10分钟。</li>
		<li>添加 0.5 &#956;L 反应混合物的 8 &#956;L 的有感受态的 E. coli 并将混合物置于冰上保持30分钟。</li>
		<li>将混合物进行热激处理 42 &#176;C 45 秒。</li>
		<li>置于冰上静置 2 分钟。</li>
		<li>在旋转摇床上恢复培养 250 &#956;L SOC 培养基中孵育 1 小时 37 &#176;C 用于NEB DH5α及在 30 &#176;C 用于 NEB Stables。</li>
		<li>培养皿 80 &#956;L 在含有相应抗生素抗性的Lysogeny Broth（LB）平板上划线培养，并于37°C过夜培养 37 &#176;C 用于NEB DH5α和at 30 &#176;C 用于NEB Stables [例如，pSB700 在含有氨苄青霉素的 LB 培养基上涂布100 &#956;g/mL）培养皿]（图3).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>验证gRNA表达质粒的序列：使用引物5’-GAGGGCCTATTTCCCATGATTCC-3’对各菌落进行Sanger测序，该引物结合于gRNA寡核苷酸插入片段上游的U6启动子区域。
	<ol>
		<li>每个反应挑选 2 - 3 个菌落进行测序（表4). 
		注意：目前多家测序服务提供商可提供直接从细菌菌落进行Sanger测序的服务，该方法无需在测序前纯化质粒，从而显著节省时间和成本。 alternatively，可使用质粒提取试剂盒从单个细菌克隆中回收质粒DNA，纯化后的质粒可送交测序。若进行混合连接反应，请使用 表4 作为选择并提交测序的菌落数量的参考依据。</li>
		<li>在序列确认后，分离gRNA表达质粒。
		<ol>
			<li>使用无菌移液器吸头将目标菌落接种至含有5 mL LB培养基的培养液中 100 &#956;g/mL 用于 pSB700 表达载体的氨苄青霉素</li>
			<li>在100 rpm转速的旋转培养箱中培养细胞 37 &#176;C 过夜（30 &#176;C 如果使用的是 NEB Stables。</li>
			<li>使用质粒提取试剂盒，按照生产商提供的方案从培养物中分离质粒DNA。 
			注意：尽管上述方法可使用户构建包含单个gRNA的载体，本方案将使用户能够构建包含两个gRNA的载体，每个gRNA由各自的RNA聚合酶III启动子驱动。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>对于成对的gRNA设计，使用上述sgRNA设计工具（步骤1.1 - 1.4）生成的输出文件，并从中选择2条感兴趣的向导RNA。
	<ol>
		<li>对于激活或抑制，选择相距至少 30 nt 的成对向导序列。</li>
		<li>对于用于切割的gRNA，应选择靶向基因内两个不同外显子的向导序列。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>以下说明中，将阵列中的第一个gRNA指定为gRNA-A，第二个gRNA指定为gRNA-B，以构建配对gRNA寡核苷酸序列修饰。 
	注意：用于构建gRNA-A的寡核苷酸称为fA，用于引入gRNA-B的反向寡核苷酸称为rB。以下克隆方法会在每条gRNA的5’端自动添加一个起始G。
	<ol>
		<li>按照以下步骤制备相应的 fA 寡核苷酸。 
		注意：gRNA-A 靶向序列所包含的 20 个核苷酸将构成后续步骤所基于的初始 fA 序列（例如，原间隔序列 - aggggctacaccactcattg)
		<ol>
			<li>将 TTTTCGTCTCTCACCG 添加至 fA 的 5’ 端例如，序列为 TTTTCGTCTCTCACCGaggggctacaccactcattg）。</li>
			<li>附加 GTTTTAGAGCTATGCTGAAAAGCA 到 fA 的 3' 端例如，序列为 TTTTCGTCTCTCACCGaggggctacaccactcattgGTTTTAGAGCTATGCTGAAAAGCA）。这是将要订购的fA寡核苷酸的最终版本。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>按如下方法制备所需的 rB 寡核苷酸。 
		注意：gRNA-B 的 gRNA 靶向序列所包含的 20 个核苷酸将构成后续步骤所基于的初始 rB 序列例如，起始序列 gtcccctccaccccacagtg 的
		<ol>
			<li>取 rB 的反向互补序列 =(反向互补)rB (例如, cactgtggggtggaggggac)</li>
			<li>将 TTTTCGTCTCTAAAC 添加至 (revcom)rB 的 5’ 端例如., TTTTCGTCTCTAAACcactgtggggtggaggggac)</li>
			<li>附加 CGGTGACCCAGGCGGCGCACAAG 到 (revcom)rB 的 3’端例如，TTTTCGTCTCTAAACcactgtggggtggaggggacCGGTGACCCAGGCGGCGCACAAG）。这将是最终订购的rB寡核苷酸序列。 
			注意：以下公式可用于常见的电子表格软件，以自动编辑引物序列： =CONCATENATE(&#34;TTTTCGTCTCTCACCG&#34;，(A2)，&#34; GTTTTAGAGCTATGCTGAAAAGCA&#34;)，其中 A2 是含有 fA 序列的细胞， =CONCATENATE(&#34;TTTTCGTCTCTAAAC&#34;，(B2)，&#34; CGGTGACCCAGGCGGCGCACAAG&#34;)，其中 B2 是包含 (revcom)rB 序列的细胞。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>从选定的合成供应商处订购寡核苷酸。无需额外修饰。</li>
	<li>使用制备好的质粒DNA，以fA和rB引物进行PCR扩增。该步骤可将正向和反向gRNA连接至由此质粒产生的pSN007 PCR片段，并使其分别由各自的启动子（U6和7SK启动子）驱动表达（该设计中使用不同的启动子以防止病毒发生重组）。
	<ol>
		<li>使用Phusion GC Special PCR方案制备所需的片段：将混合物保持在 98 &#176;C 1 分钟（1 个循环），在 98 &#176;C 15 秒，于 53 &#176;C 15 秒，于 65 &#176;C 2 分钟，以及在 72 &#176;C 4分钟（30个循环），然后保持在 4 &#176;C (表5).</li>
		<li>在1%琼脂糖凝胶上电泳PCR产物，并确认在约490 bp处出现单一条带（图2).</li>
		<li>使用选择的凝胶回收试剂盒切割并提取该PCR产物。将DNA洗脱至 15 &#956;L TE缓冲液（10 mM Tris，pH 7.5；10 mM Tris，pH 8.0）或蒸馏水。</li>
		<li>使用分光光度计测定提取产物及pSB700载体的浓度，用于DNA摩尔浓度计算。将PCR产物和载体均归一化至40飞摩尔/微升的浓度&#956;L. 
		注：可根据 DNA 长度及其在溶液中的浓度，利用多个网站辅助计算特定 DNA 溶液的摩尔浓度（例如，Promega：http://www.promega.com/a/apps/biomath/index.html?calc=ugpmols）。该计算器使用的公式为： 
		<img alt="方程" src="/files/ftp_upload/57998/57998eq1.jpg" /> 
		其中，N 为核苷酸序列的长度。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用第8至8.4步中所述方案，进行限制性酶切与连接同步反应，以克隆pSN007&#160;将PCR片段插入pSB700载体中。
	<ol>
		<li>而不是添加 1 &#956;L 向反应体系中加入引物溶液 1 &#956;L 40 飞摩尔/&#956;L PCR产物的。此外，使用 1 &#956;L pSB700 载体，浓度为 40 fmole/&#956;L. 
		注意：等摩尔比例可产生一致的结果，尽管即使未使用精确比例，也能获得菌落。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>完成Golden Gate反应过程（步骤8-8.4）后，进行转化及序列验证（步骤9-10.2.3）。</li>
</ol>

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 <a target="_blank" href="http://blog.addgene.org/the-crispr-software-matchmaker-a-new-tool-for-choosing-the-best-crispr-software-for-your-needs">http://blog.addgene.org/the-crispr-software-matchmaker-a-new-tool-for-choosing-the-best-crispr-software-for-your-needs</a> (2015).</li>
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<li>Zetsche, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cpf1+Is+a+Single+RNA-Guided+Endonuclease+of+a+Class+2+CRISPR-Cas+System%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cpf1 Is a Single RNA-Guided Endonuclease of a Class 2 CRISPR-Cas System.</a> Cell. 163 (3), 759-771 (2015).</li>
<li>Abudayyeh, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C2c2+is+a+single-component+programmable+RNA-guided+RNA-targeting+CRISPR+effector%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">C2c2 is a single-component programmable RNA-guided RNA-targeting CRISPR effector.</a> Science. 353 (6299), (2016).</li>
</ol>

George M. Church 在 Editas 和 Caribou Biosciences 拥有股权，这两家公司致力于将 CRISPR-Cas9 基因组编辑技术商业化（完整披露列表请见 http://arep.med.harvard.edu/gmc/tech.html）。

对gRNA表达载体的构建进行了多项节省时间和成本的改进。文中概述了一步式限制性酶切与连接反应的方案，以及成对gRNA表达载体的构建方法。通过使用包含正向gRNA靶序列（n20）和另一靶序列反向互补序列（n20）的寡核苷酸进行PCR扩增，实现成对gRNA的表达。该方法可在常规的单gRNA表达质粒中引入第二个RNA聚合酶III启动子（7SK）以及sgRNA尾部序列。
精心设计的寡核苷酸序列可确保成对gRNA构建的PCR以及黏性末端连接反应成功进行。在完成单步限制性酶切与连接反应后，加入更多的BsmBI可确保反应中所有未修饰的表达载体被切割，从而显著降低转化后的背景菌。使用NEB-Stable感受态大肠杆菌（E. coli）并在30 °C条件下培养，可提高成功转化的产量。
与常规方法相比，该技术的优势包括简化了寡核苷酸退火过程，可将gRNA表达载体的限制性酶切与寡核苷酸连接步骤合二为一，并能够利用常规的单gRNA表达载体来表达成对的引导RNA。尽管本文所述方案主要针对一组哺乳动物表达载体，但该总体策略具有可塑性，只要具备合适的gRNA载体，即可适用于任何生物体。总体而言，该方案可节省时间和成本。
然而，需要注意的是，购买单个寡核苷酸的上述方案在构建包含数千个gRNA的文库时扩展性较差。对于此类应用，建议采用其他寡核苷酸合成方法，例如寡核苷酸芯片合成。
在克隆gRNA时，建议设置无插入片段的对照。该对照反应可与目标反应平行进行，用于判断起始载体是否消化不完全，从而导致实验结束时观察到的菌落。此外，如果上述克隆方案因载体骨架消化不完全或连接效率低下而失败，我们建议尝试我们所列出的替代克隆方法。
在使用Golden Gate克隆技术于单个反应中同时对载体进行消化并连接小寡核苷酸时，必须确认拟克隆到载体中的gRNA内部不含BsmBI酶切位点，否则会导致gRNA被切割，从而在转化后无法获得菌落。
我们所概述的gRNA克隆策略能够以每条向导约10美元的低成本快速生成gRNA，主要成本来自寡核苷酸合成和序列验证。尽管本方法的设计旨在使用户能够生成适用于SpCas9的gRNA，但通过略微修改载体骨架和寡核苷酸突出端序列，该方案可轻松适用于Cas9同源物或其他RNA引导的核酸酶（如Cpf1或C2C2）16,17。
上述方案可在3天内获得序列验证的gRNA表达质粒（从设计合适的寡核苷酸开始），显著快于现有方法。该流程包括：1小时的gRNA设计（步骤1 - 2.3）、10分钟的寡核苷酸稀释与分装（步骤3 - 5.1）、2小时的pSB700 gRNA表达载体的酶切与纯化（步骤6 - 6.4）、在室温下过夜进行的将gRNA寡核苷酸克隆至预先酶切的pSB700 gRNA表达载体（步骤7 - 7.3）、3小时40分钟的单步BsmBI限制性连接反应（步骤8 - 8.4）、16小时的转化（步骤9 - 9.6），以及24小时的gRNA表达质粒序列验证（具体时长取决于Sanger测序的可及性及细菌菌落送测后的处理速度；步骤10）。成对gRNA的设计与序列修饰需1小时（步骤11 - 13）。成对gRNA的PCR扩增需3.5小时（步骤14 - 14.4）。将pSN007&#160;PCR片段克隆至pSB700载体需3小时40分钟（步骤15 - 16）。
本方案最可能遇到的问题与Golden Gate连接反应和转化效率有关。在Golden Gate连接反应中应设置无插入片段的对照，以评估连接效率。在转化过程中，puc19阳性对照可用于监测转化效率。对于慢病毒兼容型质粒，应使用NEB-Stable E. coli，通常需要在30 °C培养长达&#62;16小时才能观察到可见菌落。

CRISPR 相关蛋白 9（Cas9）是一种由 RNA 引导的内切核酸酶，当其与设计恰当的小向导 RNA（gRNA）形成复合物时，可靶向特定的基因组位点1,2gRNA包含一个20个核苷酸长度的序列（即原间隔序列），该序列与基因组靶序列互补。在基因组靶序列的3'端紧邻的是原间隔序列邻近基序（PAM），这是Cas9结合所必需的。对于 链球菌属 化脓性链球菌Cas9（SpCas9）的PAM序列为NGG。当Cas9与DNA靶序列结合后，会切割DNA双链，从而激活可被利用的修复机制，以实现对目标位点的修饰。激活易错的非同源末端连接（NHEJ）通路可能导致目标基因的破坏。 alternatively, repairs made 通过 同源重组可在提供供体模板的情况下促进目的DNA序列的靶向整合6. 可生成无核酸酶活性的Cas9（dCas9）变体3 通过突变Cas9中对核酸内切酶活性至关重要的残基获得dCas9。dCas9仍具有DNA结合能力，但不会切割其结合的靶标。将不同的效应结构域与dCas9融合，并将其引导至基因转录起始位点附近，可实现目的基因的选择性激活或部分沉默4,5.
尽管功能强大，但利用Cas9靶向特定基因组序列的能力要求使用者首先构建针对目标位点的独特gRNA。此前已有多种构建gRNA表达载体的方法被报道，其效率和成本各不相同6,7,8。独立的PCR扩增产物可直接用作gRNA进行快速筛选，从寡核苷酸合成到转染仅需数小时；然而，该方法需要合成Ultramer（超过100 bp）寡核苷酸，成本较高9。也可选择购买比Ultramer更具成本效益的gBlock。随着Cas9迅速成为现代分子生物学工具箱中的关键组成部分，一种简单、廉价且高效的gRNA克隆方法将极大推动该领域的发展。本文所述方法已在本研究团队及合作实验室中应用多年，成功构建了超过2,000种独特的gRNA4。
本文所述方法重点介绍包含单个gRNA或最多两个gRNA的慢病毒兼容载体的克隆技术。对于构建包含两个以上gRNA的质粒，或克隆gRNA文库，建议采用其他替代方法9,10,11,12。

<table><tbody><tr><td>BsmBI</td><td>新英格兰生物实验室</td><td>R0580L</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA连接酶</td><td>Enzymatic/新英格兰生物实验室</td><td>L6030-LC-L/M0202S</td><td></td></tr><tr><td>Buffer 3.1</td><td>新英格兰生物实验室</td><td>B7203S</td><td></td></tr><tr><td>腺苷-5'-三磷酸（ATP）</td><td>新英格兰生物实验室</td><td>P0756S</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep spin miniprep 试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td></td></tr><tr><td>化学感受态&lt;em&gt; E. coli&lt;/em&gt;</td><td>新英格兰生物实验室</td><td>C3019l、C2987l 或 C3040H</td><td></td></tr><tr><td>标准微量离心管，1.5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>0030 125.150</td><td></td></tr><tr><td>Axygen 8联排PCR管</td><td>Fischer Scientific</td><td>14-222-250</td><td></td></tr><tr><td>具有可编程温度梯度控制功能的热循环仪</td><td>BioRad</td><td>1851148</td><td></td></tr><tr><td>紫外分光光度计（NanoDrop 2000c）</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pSB700 质粒</td><td>Addgene</td><td>#64046</td><td></td></tr><tr><td>NEB Stable 感受态 &lt;em&gt;E. coli &lt;/em&gt;（高效率）</td><td>新英格兰生物实验室</td><td>c3040</td><td></td></tr><tr><td>LB培养基（Lysogeny broth）</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>氨苄青霉素</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TE缓冲液（1 mM EDTA，10 mM Tris-Cl，pH 7.5）</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pSN007 质粒</td><td>Addgene</td><td>&lt;a href=&quot;https://www.addgene.org/102440/">102440&lt;/a&gt;</td><td></td></tr></tbody></table>

用于哺乳动物系统的crispr向导rna克隆

CRISPR Guide RNA Cloning for Mammalian Systems

本方案概述了高效且经济地生成 Cas9 相关向导 RNA 的简化方法。根据 II 型 S 类限制性内切酶 BsmBI 的使用情况，并结合一组相容性载体，提出了两种不同的向导 RNA（gRNA）克隆策略。除需获得 Sanger 测序服务以验证所构建的载体外，该方法无需特殊设备或试剂，仅需现代分子生物学实验室的常规配备。本方案主要用于一次克隆单个 gRNA 或一对 gRNA 表达载体。该方法不适合用于构建包含数千个 gRNA 的文库；对于此类应用，建议采用寡核苷酸芯片合成等其他寡核苷酸合成途径。最后，尽管本方案聚焦于一组哺乳动物表达载体，但其总体策略具有可塑性，只要具备合适的 gRNA 载体，即可适用于任何生物体。

本实验方案中所述方法用于构建单个或成对的gRNA表达载体。单gRNA表达载体的构建可通过两种方式实现：一是预先消化载体骨架（图1），随后将一系列短寡核苷酸片段连接至其中；二是采用Golden Gate克隆技术，在单个反应中同时对载体骨架进行消化并连接一系列短寡核苷酸片段。此外，还提供了一种构建包含两个gRNA的载体的方法，每个gRNA由其独立的启动子驱动，通过克隆定制的pSN007&#160;PCR片段实现（图2）。
对于上述任一方案，成功的克隆将表现为含有相应插入DNA的转化组出现的菌落数量明显多于无插入片段的对照组平板（图3）。
<img alt="图1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57998/57998fig1.jpg" /> 
图1：pSB700 gRNA 表达载体的酶切反应。 使用1%琼脂糖凝胶。第1道：未酶切的pSB700。第2道：用BsmBI酶切的pSB700。
<img alt="图2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57998/57998fig2.jpg" /> 
图2：成对gRNA PCR。 使用1%琼脂糖凝胶。第1道：大小约为490 bp的成对引导pSN007&#160;PCR片段。
<img alt="图3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57998/57998fig3.jpg" /> 
图3：gRNA 质粒成功克隆与转化。 左侧图显示含有成功转化菌落的 LB 加氨苄青霉素平板；右侧图为无插入片段的对照平板，未见菌落生长。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57998/57998fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
补充文件。&#160; <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57998/Workflow diagram.docx" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>pSB700 指导表达载体</td>
			<td>1-5 μg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEB Buffer 3.1</td>
			<td>4 μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BsmBI</td>
			<td>1 μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>蒸馏水</td>
			<td>加至 40 μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>总体积</td>
			<td>40 μL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：用BsmBI对pSB700 gRNA表达载体进行限制性消化。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>退火后的gRNA寡核苷酸（单个或混合反应）</td>
			<td>1 μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>经BsmBI消化的pSB700引导表达载体</td>
			<td>1 μL (~100-250 ng)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x T4 DNA连接酶反应缓冲液</td>
			<td>2 μL（终浓度为1x）</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA连接酶</td>
			<td>1 μL（120单位）</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>蒸馏水</td>
			<td>15 μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>总体积</td>
			<td>20 μl</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表2：将gRNA寡核苷酸连接至预先消化的pSB700 gRNA表达载体的连接反应。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>试剂</td>
			<td>体积 (1x)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H2O</td>
			<td>6 μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 Ligase</td>
			<td>0.5 μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>1 μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BsmBI</td>
			<td>0.5 μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEB Buffer 3.1</td>
			<td>1 μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>载体（例如，pSB700）（40 fmol）</td>
			<td>1 μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>插入片段 — 正向与反向寡核苷酸或pSN007&#160;PCR片段（用于双gRNA）（40 fmol）</td>
			<td>1 μL（正向0.5 μL，反向0.5 μL）</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表3：单步 BsmBI 限制性酶切与 gRNA 连接反应体系。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>针对1个向导RNA</td>
			<td>测序3个菌落</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>针对2个向导RNA</td>
			<td>测序5-10个菌落</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>针对3个向导RNA</td>
			<td>测序10-15个菌落</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>针对4个向导RNA</td>
			<td>测序15-20个菌落</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表4：建议用于混合gRNA克隆反应测序的菌落数量。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>PCR 组分</td>
			<td>50 µL 反应体系</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 µM 正向引物</td>
			<td>2.5 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 µM 反向引物</td>
			<td>2.5 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5x Phusion HF 或 GC 缓冲液</td>
			<td>10 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mM dNTPs</td>
			<td>1 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>模板 DNA</td>
			<td>100 ng</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion DNA 聚合酶</td>
			<td>0.5 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>无核酸酶水</td>
			<td>加至 50 µL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表5：成对gRNA PCR混合液。

本文概述了一种简单、高效且经济的sgRNA克隆方法。

用于哺乳动物系统的CRISPR向导RNA克隆

所述方案描述了高效且经济地生成与Cas9相关的引导RNA的简化方法。两种替代方案……

该方法可简便地构建用于CRISPR介导实验的向导RNA表达质粒。该技术的主要优势在于克隆过程可在单一步骤中完成，并可利用单向导RNA表达质粒构建成对的向导RNA。开始本实验方案时，将冻干的引物用1× TE缓冲液稀释至终浓度为100微摩尔。将等量的正向引物和反向引物分装至PCR条状管盖中。涡旋混匀。随后，以100 × g离心向导RNA寡核苷酸混合物15秒。在进行连接反应前，将反应体系在室温下孵育5分钟。根据所选PSB700引导表达载体的量，每1微克载体加入0.5微升BSNB1，总量为1至5微克。加入蒸馏水使总体积达到40微升，并在55摄氏度下孵育1小时以进行消化反应。将消化产物在1.5%低熔点琼脂糖凝胶上电泳。切下与约9千碱基大小片段相对应的已消化载体骨架条带。将此凝胶切片转移至1.5毫升微量离心管中。使用商业化的胶回收试剂盒，根据制造商的说明从琼脂糖凝胶中提取 DNA。然后将 DNA 溶于 10–15 微升 TE 缓冲液中，以获得浓缩的洗脱液。准备进行连接反应时，向试剂瓶中加入 15 微升蒸馏水。加入1 µL先前已退火的向导RNA寡核苷酸、1 µL经BSNB1酶切的PSB700向导表达载体以及2 µL 10×T4 DNA连接酶反应缓冲液。随后通过涡旋振荡混合该溶液。再加入1 µL DNA连接酶，并再次涡旋振荡。在100 × g条件下离心溶液15秒。将反应物在室温下孵育过夜，注意设置不含插入片段的阴性对照反应，该对照仅包含经BSNB1消化的载体，不加入退火的引导RNA寡核苷酸插入片段。首先，从-80摄氏度保存条件下取出大肠杆菌（E.coli），置于冰上解冻5至10分钟。将 0.5 µL 的预混反应液加入 8 µL 感受态 E.coli 中。冰上放置 30 分钟。在 42 °C 下热激 45 秒。然后将混合物置于冰上静置两分钟。使用旋转摇床，按照此处列出的条件，用250 µL SOC培养基复苏菌种（适用于NEB DH5α或NEB Stbl3）。随后，取80 µL菌液接种至含有适当抗生素的LB琼脂平板上。在37摄氏度下孵育NEB DH5α过夜，或在30摄氏度下孵育NEB Stbl3过夜。首先，按照文本方案中所述，使用Phusion GC专用PCR程序扩增出所需的DNA片段。将该PCR产物在1%琼脂糖凝胶上电泳，确认在约490个碱基对处出现单一条带。使用凝胶回收试剂盒切割并回收该PCR产物。然后将制备好的1X预混液分装至PCR管中。使用多通道移液器加入1微升浓度为40飞摩尔/微升的PCR产物。在1 µL的PSB700载体中加入终浓度为40 fmol/µL的组分。通过使用1 µL水代替向导RNA寡核苷酸，设置无插入片段的对照。根据文本方案中所述的Golden Gate方案，将载体消化并与插入片段在同一个反应中进行连接。在初始的黄金门反应后，向每个反应体系中额外加入 0.5 微升的 BSNB1 酶。在 55 摄氏度下继续反应 1 小时。黄金门反应完成后，进行先前所述的大肠杆菌转化过程。本研究中，采用两种方法成功构建了单导向RNA表达载体。第一种方法中，载体骨架经预先消化后，与一系列短寡核苷酸片段进行连接。第二种方法则采用黄金门克隆技术，在单个反应中同时完成消化和连接。通过克隆定制的PCR片段，成功构建了每种均由其独立启动子驱动的成对向导RNA表达载体。采用这两种方法中的任意一种，成功克隆后，与无插入片段的对照平板相比，含有适当插入DNA的转化反应将出现明显更多的菌落。在进行该实验操作时，重要的是务必在克隆步骤中设置无插入片段的对照组。通过此操作流程，还可进行表观基因组编辑等其他方法，以回答染色质特征对基因表达具有何种影响之类的问题。

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