用于哺乳动物系统的CRISPR向导RNA克隆

该方法可简便地构建用于CRISPR介导实验的向导RNA表达质粒。该技术的主要优势在于克隆过程可在单一步骤中完成，并可利用单向导RNA表达质粒构建成对的向导RNA。开始本实验方案时，将冻干的引物用1× TE缓冲液稀释至终浓度为100微摩尔。

将等量的正向引物和反向引物分装至PCR条状管盖中。涡旋混匀。随后，以100 × g离心向导RNA寡核苷酸混合物15秒。

在进行连接反应前，将反应体系在室温下孵育5分钟。根据所选PSB700引导表达载体的量，每1微克载体加入0.5微升BSNB1，总量为1至5微克。加入蒸馏水使总体积达到40微升，并在55摄氏度下孵育1小时以进行消化反应。

将消化产物在1.5%低熔点琼脂糖凝胶上电泳。切下与约9千碱基大小片段相对应的已消化载体骨架条带。将此凝胶切片转移至1.5毫升微量离心管中。

使用商业化的胶回收试剂盒，根据制造商的说明从琼脂糖凝胶中提取 DNA。然后将 DNA 溶于 10–15 微升 TE 缓冲液中，以获得浓缩的洗脱液。准备进行连接反应时，向试剂瓶中加入 15 微升蒸馏水。

加入1 µL先前已退火的向导RNA寡核苷酸、1 µL经BSNB1酶切的PSB700向导表达载体以及2 µL 10×T4 DNA连接酶反应缓冲液。随后通过涡旋振荡混合该溶液。再加入1 µL DNA连接酶，并再次涡旋振荡。

在100 × g条件下离心溶液15秒。将反应物在室温下孵育过夜，注意设置不含插入片段的阴性对照反应，该对照仅包含经BSNB1消化的载体，不加入退火的引导RNA寡核苷酸插入片段。首先，从-80摄氏度保存条件下取出大肠杆菌（E.coli），置于冰上解冻5至10分钟。

将 0.5 µL 的预混反应液加入 8 µL 感受态 E.coli 中。冰上放置 30 分钟。在 42 °C 下热激 45 秒。

然后将混合物置于冰上静置两分钟。使用旋转摇床，按照此处列出的条件，用250 µL SOC培养基复苏菌种（适用于NEB DH5α或NEB Stbl3）。随后，取80 µL菌液接种至含有适当抗生素的LB琼脂平板上。

在37摄氏度下孵育NEB DH5α过夜，或在30摄氏度下孵育NEB Stbl3过夜。首先，按照文本方案中所述，使用Phusion GC专用PCR程序扩增出所需的DNA片段。将该PCR产物在1%琼脂糖凝胶上电泳，确认在约490个碱基对处出现单一条带。

使用凝胶回收试剂盒切割并回收该PCR产物。然后将制备好的1X预混液分装至PCR管中。使用多通道移液器加入1微升浓度为40飞摩尔/微升的PCR产物。

在1 µL的PSB700载体中加入终浓度为40 fmol/µL的组分。通过使用1 µL水代替向导RNA寡核苷酸，设置无插入片段的对照。根据文本方案中所述的Golden Gate方案，将载体消化并与插入片段在同一个反应中进行连接。

在初始的黄金门反应后，向每个反应体系中额外加入 0.5 微升的 BSNB1 酶。在 55 摄氏度下继续反应 1 小时。黄金门反应完成后，进行先前所述的大肠杆菌转化过程。

本研究中，采用两种方法成功构建了单导向RNA表达载体。第一种方法中，载体骨架经预先消化后，与一系列短寡核苷酸片段进行连接。第二种方法则采用黄金门克隆技术，在单个反应中同时完成消化和连接。

通过克隆定制的PCR片段，成功构建了每种均由其独立启动子驱动的成对向导RNA表达载体。采用这两种方法中的任意一种，成功克隆后，与无插入片段的对照平板相比，含有适当插入DNA的转化反应将出现明显更多的菌落。在进行该实验操作时，重要的是务必在克隆步骤中设置无插入片段的对照组。

通过此操作流程，还可进行表观基因组编辑等其他方法，以回答染色质特征对基因表达具有何种影响之类的问题。