Name: 小鼠胰腺内分泌细胞的单细胞 Transcriptomic 分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 5 s
Description: 了解小鼠胰腺内分泌细胞的单细胞转录组分析方法，用于研究胰岛细胞谱系分化、成熟及再生过程。该技术可生成高质量RNA测序数据，为糖尿病等胰腺内分泌疾病的机制研究与治疗策略提供重要依据。

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感谢北京蛋白质科学国家中心（北京大学）和北大-清华生命科学计算平台。本工作得到中国科学技术部（2015CB942800）、国家自然科学基金委员会（31521004、31471358 和 31522036）以及北大-清华生命科学联合中心对 C.-R.X. 的资助。

本文所述所有方法均已获得北京大学实验动物福利与使用委员会（IACUC）的批准。
1. 胰腺分离
<ol>
	<li>对于E17.5（胚胎第17.5天）胚胎：
	<ol>
		<li>根据阴道栓出现的时间点确定胚胎发育第0.5天。</li>
		<li>通过 CO 处死怀孕小鼠2 给药。用70%酒精喷洒腹部毛发。</li>
		<li>从生殖区域向肋骨处用剪刀做一个V形切口。此操作将完全打开腹腔。</li>
		<li>从腹腔中取出子宫，置于含有冷PBS的10 cm培养皿中。</li>
		<li>在体视显微镜下，使用尖头镊子从子宫中分离胚胎，并去除胎盘和脐带等其他组织。将所有胚胎置于含有冷PBS的10 cm培养皿中。</li>
		<li>撕开胚胎的腹腔，用弯头镊子取出内脏组织。将内脏组织转移至含有冷PBS的6 cm黑色底培养皿中。</li>
		<li>胰腺位于腹腔左上方，与胃、脾脏和十二指肠相连（图中黄色虚线所示） 图2A)12用镊子将胰腺从内脏组织上分离，并将胰腺组织收集至一个含有5 mL 0.5 mg/mL冷胶原酶溶液（0.5 mg/mL Collagenase P 溶于分离缓冲液中，分离缓冲液为含10 mM HEPES、1 mM MgCl₂的HBSS）的20 mL样品瓶中。2，5 mM 葡萄糖，pH 7.4）</li>
	</ol>
	</li>
	<li>对于出生后0-15天（P0-P15）的小鼠：
	<ol>
		<li>处死小鼠后，用胶带将四肢固定在实验台保护垫上。用70%酒精喷洒腹部毛发。</li>
		<li>完全打开腹腔，操作步骤如1.1.3所述。将肠管拉出并移至小鼠左侧，此操作可暴露胰腺的十二指肠叶、胃叶和脾叶。仔细分离胰腺的所有叶组织（图2B)12 将胰腺组织汇集至一个含有5 mL 0.5 mg/mL冷胶原酶溶液的20 mL小瓶中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>对于出生后18-60天（P18-P60）的小鼠：
	<ol>
		<li>制备胶原酶溶液，使用前置于冰上保存。</li>
		<li>处死小鼠，并按照上述步骤（1.1.2 和 1.1.3）打开腹腔。 
		注意：操作时切勿损伤肝脏，任何肝脏损伤都会降低胆管内的灌流压力，从而影响后续步骤的灌流效率。</li>
		<li>切除剑突。将肠管拉出并移至小鼠右侧，将肝脏的左内叶和右内叶分别向两侧推开，以暴露胆囊（图中白色箭头所示）。 图 2C）和胆总管。</li>
		<li>用一对小血管钳在十二指肠上、下位置夹闭，两侧分别位于胆管进入十二指肠的部位图 2D). 
		注意：不要夹紧&#160;胰腺的胃叶或脾叶。如果夹闭，胶原酶溶液在下一步将无法流入胰腺的胃叶和脾叶。</li>
		<li>用注射器吸取5 mL浓度为0.5 mg/mL的冷胶原酶溶液，将30 G针头插入胆囊。通过胆总管小心且平稳地移动针头。</li>
		<li>根据小鼠的大小，通过注射1–5 mL浓度为0.5 mg/mL的冷胶原酶溶液灌注胰腺。注射应缓慢且持续，以防止针头从导管中滑脱，并避免因液体压力过高导致肠道破裂。当胰腺完全膨胀时，表明注射完成。</li>
		<li>解剖胰腺（图中黄色虚线所示） 图2D用镊子在灌注后立即取出腹腔内的组织，放入含有5 mL 0.5 mg/mL冷胶原酶溶液的20 mL样品瓶中。若同时处理多只小鼠，应逐只进行灌注，并将各小鼠的组织收集至同一含有冷胶原酶溶液的20 mL样品瓶中，直至所有小鼠解剖完毕。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 胶原酶消化与胰岛分离
<ol>
	<li>将含有胰腺组织的 20 mL 小瓶放入 37 °C 水浴中，孵育 3 分钟以平衡温度。</li>
	<li>轻轻振荡试管 3 至 5 分钟。若胰腺组织充分膨胀，将逐渐解离成小块组织，最终均匀分散。消化时间因胰腺大小和灌注效率而异。</li>
	<li>将消化产物通过 0.25 mm 尼龙滤网过滤至新的 50 mL 离心管中。使用装有冰浴 PBS 的 20 mL 注射器彻底冲洗滤网。</li>
	<li>对于 E17.5-P15 胰腺，跳至步骤 3.1。</li>
	<li>对于 P18-P60 胰腺，以 200 × g 离心 1 分钟，弃去上清液，用冷 PBS 重悬组织。</li>
	<li>将 5 mL 组织悬液倒入 6 cm 黑底培养皿中。胰岛呈细小、致密、乳白色结构，而腺泡组织则呈松散、半透明白色。用 200 μL 移液器挑取胰岛，并转移至含有少量冷 PBS 的 1.5 mL 离心管中。</li>
</ol>
3. 胰腺组织或胰岛的胰蛋白酶消化
<ol>
	<li>将含有胰腺组织或胰岛的离心管在 4 °C 条件下以 200 × g 离心 1 分钟，弃去上清液，注意不要扰动沉淀。</li>
	<li>用 0.25% 胰蛋白酶-EDTA 重悬沉淀，并在 37 °C 水浴中孵育。孵育 4 分钟后，使用 200 μL 吸头轻轻且间歇性吹打 1 分钟。 
	注意：对于 E17.5-P3 期胰腺，加入 1 mL 胰蛋白酶-EDTA；对于 P4-P15 期胰腺，加入 3 mL 胰蛋白酶-EDTA；对于 100–300 个胰岛，加入 1 mL 胰蛋白酶-EDTA。根据组织量调整胰蛋白酶-EDTA 的体积。</li>
	<li>加入 0.4 倍体积的冷胎牛血清（FBS）以终止消化，并通过轻柔涡旋混匀。</li>
	<li>在 4 °C 条件下以 250 × g 离心 3 分钟，弃去上清液，注意不要扰动沉淀。</li>
	<li>用 200 μL 冷 FACS 缓冲液（含 1% FBS 的 HBSS，pH 7.4）重悬细胞，将细胞转移至 5 mL FACS 管中。</li>
	<li>快速离心 FACS 管，使细胞悬液通过滤膜，以去除未消化的大块组织碎片。此时管中的单细胞悬液已可用于 FACS 分选。</li>
</ol>
4. 单细胞裂解
<ol>
	<li>准备细胞裂解缓冲液。 
	注意：所有实验均需在经紫外灭菌的层流罩内进行。所有离心管、培养板和移液器吸头均应无RNase/DNase。使用前，用RNase清除剂对层流罩和移液器进行去污处理。
	<ol>
		<li>将试剂在冰上解冻：dNTP（10 mM）、oligo-dT引物（10 μM）和ERCC储备液（1:20）。</li>
		<li>用无核酸酶水将ERCC稀释至1:5 × 105。</li>
		<li>计算所需细胞裂解缓冲液的体积。每细胞加入40 U/μL的RNase抑制剂0.1 μL、0.2%（vol/vol）Triton X-100 1.9 μL、dNTP 1 μL、oligo-dT引物1 μL以及稀释后的ERCC 0.05 μL，最终体积为4.05 μL。</li>
		<li>将细胞裂解缓冲液分装至0.2 mL薄壁8联排PCR管或96孔板中。在4 °C下离心30秒。 
		注意：后续步骤中，0.2 mL薄壁8联排PCR管以7500 × g离心，96孔板以800 × g离心。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>单细胞挑选与裂解。
	<ol>
		<li>使用30–40 µm毛细移液管，在FACS缓冲液中手动挑选经FACS分选的Ins1-RFP+单细胞至8联排PCR管中，或直接将Ins1-RFP+单细胞分选至96孔板中。含有单个细胞的体积应小于0.3 μL。 
		注意：采用前向散射高度（FSC-H）对前向散射面积（FSC-A）的门控策略区分双细胞团，FSC-H对侧向散射面积（SSC-A）区分碎片，并结合荧光门控进行Ins1-RFP+细胞分选（图3A-3C）。对于手动挑选法，将目标细胞分选至含有300 μL FACS缓冲液的1.5 mL离心管中，最终细胞浓度宜为5–10个/μL，根据需要调整缓冲液体积。对于板式收集法，按照仪器说明书将单个细胞分选至96孔板的各个孔中。7,13</li>
		<li>涡旋振荡离心管或培养板，以裂解细胞并释放RNA。在4 °C下离心30秒后立即置于冰上。 
		注意：细胞样品可在-80 °C保存一周。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 单细胞cDNA扩增
<ol>
	<li>反转录（RT）。
	<ol>
		<li>将反转录试剂（表1）置于冰上解冻。</li>
		<li>将样品在72 °C孵育3分钟，立即置于冰上至少1分钟。在4 °C下短暂离心试管或板30秒。 
		注意：所有孵育步骤均应使用带有105 °C加热盖的热循环仪。</li>
		<li>根据表1所述配制所有反应所需的反转录反应液。</li>
		<li>向每个样品中加入5.7 μL反转录反应液，使总体积达到10 μL。轻轻涡旋混匀，并在4 °C下离心30秒。</li>
		<li>将样品放入热循环仪中，启动以下反转录程序：42 °C孵育90分钟，进行10个循环（50 °C孵育2分钟，42 °C孵育2分钟），70 °C孵育15分钟，最后维持在4 °C。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>PCR预扩增。
	<ol>
		<li>将PCR试剂（表2）置于冰上解冻。</li>
		<li>根据表2所述配制所有反应所需的PCR反应液。</li>
		<li>向含有第一链反应产物的每个样品中加入15 μL PCR反应液。轻轻涡旋混匀，并在4 °C下离心30秒。</li>
		<li>将样品放入热循环仪中，启动以下PCR程序：98 °C预变性3分钟，进行18个循环（98 °C变性20秒，67 °C退火15秒，72 °C延伸6分钟），72 °C最终延伸5分钟，最后维持在4 °C。 
		注意：PCR产物可在4 °C保存不超过一周，或在-20 °C / -80 °C保存长达6个月。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>PCR产物纯化。
	<ol>
		<li>向上一步所得每个样品中加入25 μL重悬的DNA纯化磁珠（1倍体积），通过涡旋充分混匀。然后在室温下快速离心以收集液体，但避免磁珠沉淀。 
		注意：使用前将DNA纯化磁珠于室温平衡15分钟，并充分涡旋混匀。</li>
		<li>在室温下孵育5分钟。</li>
		<li>将试管或板置于合适的磁力架上，直至溶液澄清，然后小心移除并弃去上清液。</li>
		<li>在磁力架上向磁珠中加入200 μL新鲜配制的80%乙醇进行洗涤，孵育30秒后小心移除并弃去乙醇溶液。 
		注意：80%（体积比）乙醇溶液应每次新鲜配制。</li>
		<li>重复步骤5.3.4，共洗涤两次。</li>
		<li>小心移除并弃去残留的乙醇溶液，在磁力架上将磁珠空气干燥。 
		注意：避免磁珠过度干燥，以确保最大洗脱效率。</li>
		<li>加入11 μL无核酸酶水，通过涡旋充分混匀以从磁珠上洗脱目标DNA。快速离心后，将试管或板置于磁力架上直至溶液澄清。将10 μL上清液转移至新的PCR管中。 
		注意：若根据cDNA片段大小分布检测结果发现单次纯化后仍存在引物二聚体，应再次纯化以彻底去除二聚体。若二聚体残留在样品中，将影响cDNA产量的准确计算。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>cDNA质量检测。
	<ol>
		<li>随机选取样品，使用荧光计检测cDNA总产量。</li>
		<li>通过实时荧光定量PCR（qPCR）评估标志基因的表达水平（图4E）。取1 μL样品稀释40倍，使用384孔板进行qPCR。qPCR反应液配制方法见表3。扩增条件：95 °C预变性10分钟，进行45个循环（95 °C变性10秒，60 °C退火15秒，72 °C延伸15秒）。</li>
		<li>随机选取样品，使用毛细管电泳仪检测片段大小分布。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. cDNA文库构建
<ol>
	<li>Tn5转座酶介导的标签化反应。
	<ol>
		<li>使用荧光计检测第5.4.2步中经qPCR筛选的细胞的cDNA总产量。以2 ng cDNA作为起始材料。</li>
		<li>将标签化反应试剂（表4）置于冰上解冻。</li>
		<li>在0.2 mL薄壁8联排PCR管中按表4所述配制标签化反应体系，轻轻涡旋混匀，然后在室温下快速离心。</li>
		<li>在55 °C孵育10分钟，随后置于4 °C保存。</li>
		<li>立即向每份含有标签化DNA的样品中加入2 μL 5x TS以终止反应。轻轻涡旋混匀，然后在室温下快速离心。</li>
		<li>在室温下孵育5分钟。所得DNA应立即用于后续的扩增PCR。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>接头连接片段的扩增。
	<ol>
		<li>将PCR试剂（表5）置于冰上解冻。</li>
		<li>按表5所述配制富集PCR混合液，轻轻涡旋混匀，然后在室温下快速离心。</li>
		<li>采用以下程序进行PCR扩增：72 °C 10分钟，98 °C 30秒，8个循环（98 °C 15秒，60 °C 30秒，72 °C 3分钟），72 °C 5分钟，最后置于4 °C保存。 
		注：循环数取决于预期的文库DNA量。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>带有片段大小选择的PCR纯化。
	<ol>
		<li>向上一步所得每份样品中加入14 μL重悬的DNA纯化磁珠（0.7 x），涡旋充分混匀。然后在室温下快速离心以收集液体，避免磁珠沉淀。 
		注：使用前将DNA纯化磁珠于室温平衡15分钟，并充分涡旋混匀。</li>
		<li>在室温下孵育5分钟。</li>
		<li>将管子置于合适的磁力架上直至溶液澄清，小心转移上清液至新的8联排管中，弃去原管条。</li>
		<li>向8联排管中的每份样品加入3 μL重悬的DNA纯化磁珠（0.15x），涡旋充分混匀。然后在室温下快速离心。</li>
		<li>在室温下孵育5分钟。</li>
		<li>将管子或板置于合适的磁力架上直至溶液澄清，然后小心移除并弃去上清液。</li>
		<li>在磁力架上向磁珠中加入200 μL新鲜配制的80%乙醇洗涤，孵育30秒，然后小心移除并弃去乙醇溶液。 
		注：80%（体积比）乙醇溶液应每次新鲜配制。</li>
		<li>重复步骤6.3.7，共洗涤两次。</li>
		<li>小心移除并弃去残留乙醇溶液，在磁力架上将磁珠空气干燥。 
		注：避免磁珠过度干燥，以确保最大洗脱效率。</li>
		<li>加入11 μL无核酸酶水以从磁珠上洗脱目标DNA，涡旋充分混匀。然后快速离心管子或板，并置于磁力架上直至溶液澄清。将10 μL样品转移至新的8联排管中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>最终cDNA文库的质量检测。
	<ol>
		<li>使用荧光计测定各文库的浓度，并利用毛细管电泳仪检测片段大小分布。 
		注：每个文库的DNA产量通常在15–25 ng之间，可观察到大小为250 bp至450 bp的片段。若在纯化后仍存在二聚体（通过片段大小分布检测确认），则需再用1 x DNA纯化磁珠纯化一次。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>文库合并
	<ol>
		<li>根据大致的片段大小，将各样品等量DNA合并，确保其中不含相同N6XX和N8XX接头组合的样品。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
7. DNA 测序
<ol>
	<li>使用高通量测序系统对带有条形码的文库进行51 bp的单端测序。按照制造商的说明书进行测序。每个细胞的测序深度平均约为100万条读段8，每个细胞至少达到50万条读段14。</li>
</ol>
8. 生物信息学分析
<ol>
	<li>测序质量评估与序列比对。
	<ol>
		<li>使用 FastQC (v0.11.3)15 评估测序读段的质量，参数设置如下：“fastqc --extract -o output_dir input_fastq”。</li>
		<li>使用命令“cat mm10.fa ERCC.fa &#62;mm10_ERCC.fa”将小鼠基因组与 ERCC 序列合并。</li>
		<li>使用以下参数构建 bowtie2 (v2.2.5)16 索引：“bowtie2-build mm10_ERCC.fa mm10_ERCC”。</li>
		<li>使用 tophat2 (v2.1.0)17 进行序列比对，参数设置如下：“tophat2 -o output_dir -G gene.gtf --transcriptome-index trans_index mm10_ERCC input_fastq”。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>基因表达水平定量。
	<ol>
		<li>使用 HTSeq (v 0.6.0)18 统计每个基因的比对读段数，参数设置如下：‘‘htseq-count -f bam -r pos -s no -a 30 accepted_hits.bam gene.gtf &#62; read_count.txt’’。</li>
		<li>将基因表达水平标准化为每百万转录本数（TPM）19。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>细胞质量控制。
	<ol>
		<li>排除比对读段数少于 0.5 百万或表达基因数少于 4,000 个（TPM &#62; 1）的细胞。 
		注：排除标准取决于细胞类型和测序深度。</li>
		<li>保留表达内分泌标志物（例如，β 细胞的 Ins1，α 细胞的 Gcg）的细胞，排除表达非内分泌标志物（例如，白细胞的 Spi1）的细胞。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>主成分分析（PCA）
	<ol>
		<li>根据 ERCC 外参序列鉴定高变基因，方法如前所述20。</li>
		<li>使用 R 软件包 FactoMineR (v1.31.4)21 中的“PCA”函数，基于高变基因的 log2(TPM + 0.1) 值进行主成分分析。</li>
		<li>使用 ggplot2 (v2.0.0)22 可视化 PCA 结果。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>层次聚类分析。
	<ol>
		<li>使用 FactoMineR (v1.31.4)21 中的“dimdesc”函数鉴定主成分（PC）载荷最高的基因。</li>
		<li>使用 R 软件包 gplots (v3.0.1)23 中的“heatmap.2”函数，基于高 PC 载荷基因的 log2 (TPM + 1) 相对值进行层次聚类分析。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Gu, G., Dubauskaite, J., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+evidence+for+the+pancreatic+lineage%3A+NGN3%2B+cells+are+islet+progenitors+and+are+distinct+from+duct+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Direct evidence for the pancreatic lineage: NGN3+ cells are islet progenitors and are distinct from duct progenitors.</a> Development. 129 (10), 2447-2457 (2002).</li>
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作者无任何利益冲突需要披露。

在本实验方案中，我们展示了一种有效且易于使用的胰岛β细胞单细胞表达谱研究方法。该方法可用于从胚胎期、新生期及出生后胰腺中分离内分泌细胞，并进行单细胞转录组分析。
最关键的步骤是获得状态良好的单个β细胞。充分灌注的胰腺对后续消化的反应更佳。灌注不足（通常发生在胰腺背侧）会导致胰岛得率降低。灌注完成后，需特别注意消化时间和振荡强度。过度消化（由过长的孵育时间和剧烈振荡引起）会使胰岛破碎成小块；而消化不足则无法将胰岛与周围组织完全分离。胰腺消化后，胰岛通过手工挑选进行纯化，而非采用密度梯度离心法。尽管密度梯度离心可富集胰岛，但许多较小的胰岛或与腺泡组织相连的胰岛常被误弃。应尽量避免挑取腺泡组织，因其可能导致胰蛋白酶消化效率降低，从而影响β细胞的纯度。
独立的生物学重复对于区分生物学变异性和批次效应是必要的。如果两个生物学重复在主成分分析（PCA）中具有相似的模式，并且在聚类结果中包含相似的亚群，则这些样本可能反映了可靠的生物学变异性。否则，需要增加更多的生物学重复以确认结果。对于胰腺等代谢器官，与昼夜节律钟相关的细胞状态<sup c...

胰腺是哺乳动物体内一个重要的代谢器官。胰腺由内分泌和外分泌两部分组成。胰腺内分泌细胞包括产生胰岛素的β细胞和产生胰高血糖素的α细胞，这些细胞聚集在朗格汉斯岛（胰岛）中，共同调节全身的葡萄糖稳态。内分泌细胞功能障碍会导致糖尿病 mellitus，该疾病已成为全球主要的公共卫生问题。
胰腺内分泌细胞在胚胎发育过程中起源于Ngn3+前体细胞1。随后，在围产期，这些内分泌细胞增殖形成未成熟的胰岛。这些未成熟细胞持续发育并逐渐成熟为胰岛，在成体中形成丰富的血管化结构，以调节血糖稳态2。
尽管已鉴定出一组调控β细胞分化的转录因子，但β细胞的精确成熟途径仍不明确。此外，β细胞的成熟过程还涉及细胞数量扩增3,4以及细胞异质性的产生5,6。然而，这些过程的调控机制尚未得到充分研究。
单细胞RNA测序是一种强大的方法，能够对细胞亚群进行分析并追踪细胞谱系的发育路径7。利用该技术，可在单细胞水平上解析胰岛发育过程中发生的关键事件8。在现有的单细胞RNA测序方案中，Smart-seq2能够以更高的灵敏度和准确性生成全长cDNA，并使用成本较低的标准试剂9。构建用于测序的cDNA文库，Smart-seq2大约需要两天时间10。
本文提出一种从胎鼠至成年 Ins1-RFP 转基因小鼠胰腺中分离荧光标记β细胞的方法11，利用荧光激活细胞分选（FACS）技术，以及采用Smart-seq2技术在单细胞水平进行转录组分析，图1该方案可进一步扩展，用于分析正常、病理及衰老状态下所有胰腺内分泌细胞类型的转录组。

<table><tbody><tr><td>胶原酶P</td><td>罗氏</td><td>11213873001</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA（0.25 %），酚红</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>25200114</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>Hyclone</td><td>SH30071.03</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #4 镊子</td><td>Roboz</td><td>RS-4904</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 镊子</td><td>罗博兹</td><td>RS-5058</td><td></td></tr><tr><td>30 G BD 针头 1/2&quot; 长度</td><td>BD</td><td>305106</td><td></td></tr><tr><td>体视显微镜</td><td>蔡司</td><td>Stemi DV4</td><td></td></tr><tr><td>立体荧光显微镜</td><td>蔡司</td><td>Stereo Lumar V12</td><td></td></tr><tr><td>离心</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td></td></tr><tr><td>离心</td><td>Eppendorf</td><td>5424R</td><td></td></tr><tr><td>带细胞筛帽的聚苯乙烯圆底管</td><td>BD-Falcon</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>96孔PCR微孔板</td><td>Axygen</td><td>PCR-96-C</td><td></td></tr><tr><td>硅胶密封垫</td><td>Axygen</td><td>AM-96-PCR-RD</td><td></td></tr><tr><td>薄壁PCR管</td><td>Extragene</td><td>P-02X8-CF</td><td></td></tr><tr><td>细胞分选仪</td><td>BD 生物科学</td><td>BD FACSAria</td><td></td></tr><tr><td>毛细移液管</td><td>Sutter</td><td>B100-58-10</td><td></td></tr><tr><td>RNaseZap</td><td>Ambion</td><td>AM9780</td><td></td></tr><tr><td>ERCC RNA 加标混合物</td><td>Life Technologies</td><td>4456740</td><td></td></tr><tr><td>蒸馏水</td><td>Gibco</td><td>10977</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>dNTP 混合物</td><td>New England Biolabs</td><td>N0447</td><td></td></tr><tr><td>重组RNase抑制剂</td><td>Takara</td><td>2313</td><td></td></tr><tr><td>Superscript II 逆转录酶</td><td>Invitrogen</td><td>18064-014</td><td></td></tr><tr><td>第一链缓冲液（5x）</td><td>Invitrogen</td><td>18064-014</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Invitrogen</td><td>18064-014</td><td></td></tr><tr><td>甜菜碱</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>107-43-7</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7786-30-3</td><td></td></tr><tr><td>无核酸酶水</td><td>Invitrogen</td><td>AM9932</td><td></td></tr><tr><td>KAPA HiFi HotStart ReadyMix (2x)</td><td>KAPA Biosystems</td><td>KK2601</td><td></td></tr><tr><td>VAHTS DNA Clean Beads XP 磁珠</td><td>Vazyme</td><td>N411-03</td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td><td>Invitrogen</td><td>Q32854</td><td></td></tr><tr><td>AceQ qPCR SYBR Green Master Mix</td><td>Vazyme</td><td>Q121-02</td><td></td></tr><tr><td>TruePrep DNA文库构建试剂盒V2（适用于Illumina）</td><td>Vazyme</td><td>TD502</td><td>包含 5x TTBL、5x TTE、5x TS、5x TAB、TAE</td></tr><tr><td>TruePrep Index Kit V3 for Illumina</td><td>Vazyme</td><td>TD203</td><td>包含16个N6XX和24个N8XX</td></tr><tr><td>高灵敏度 NGS 片段分析试剂盒</td><td>先进分析技术</td><td>DNF-474</td><td></td></tr><tr><td>1x HBSS（不含 Ca）&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; 和 Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;</td><td></td><td></td><td>138 mM NaCl；5.34 mM KCl&lt;br/&gt; 4.17 mM NaHCO₃&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;；0.34 mM Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&lt;br/&gt; 0.44 mM KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td></tr><tr><td>分离缓冲液</td><td></td><td></td><td>1 &amp;times; 含 10 mM HEPES、1 mM MgCl 的 HBSS&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;5 mM葡萄糖，pH 7.4</td></tr><tr><td>FACS 缓冲液</td><td></td><td></td><td>1 &amp;times; 含15 mM HEPES、5.6 mM葡萄糖、1% FBS、pH 7.4的HBSS</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5886</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO₃&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6297</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5136</td><td></td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5655</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-葡萄糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5767</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2393</td><td></td></tr><tr><td>寡核苷酸-dT&lt;sub&gt;30&lt;/sub&gt;VN引物</td><td></td><td></td><td>5'-AAGCAGTGGTATCAA&lt;胰腺内分泌细胞聚集于胰岛中，调控血糖稳定性和能量代谢。在胚胎发育阶段，包括分泌胰岛素的β细胞在内的不同胰岛细胞类型由共同的内分泌前体细胞分化而来。未成熟的内分泌细胞通过细胞增殖在出生后较长的发育阶段中扩增并逐渐成熟。然而，这些过程的潜在机制尚不明确。单细胞RNA测序是一种有前景的技术，可用于鉴定不同的细胞群体并追踪细胞谱系分化路径。本文介绍了一种针对胚胎期、新生期及出生后胰腺中分离的β细胞进行单细胞RNA测序的方法。&gt;CGCAGAGTACT&lt;sub&gt;30&lt;/sub&gt;VN-3'</td></tr><tr><td>TSO</td><td></td><td></td><td>5'-AAGCAGTGGTATCAAC&lt;br /&gt;GCAGAGTACATrGrG+G-3'</td></tr><tr><td>ISPCR 引物</td><td></td><td></td><td>5'-AAGCAGTGGTAT&lt;胰腺内分泌细胞聚集于胰岛中，调控血糖稳定性和能量代谢。在胚胎发育阶段，包括分泌胰岛素的β细胞在内的不同胰岛细胞类型由共同的内分泌前体细胞分化而来。未成熟的内分泌细胞通过细胞增殖扩增，并在较长的出生后发育阶段中逐渐成熟。然而，这些过程的潜在机制尚不明确。单细胞RNA测序是一种有前景的技术，可用于表征不同的细胞群体并追踪细胞谱系分化路径。本文介绍了一种针对胚胎期、新生期及出生后胰腺中分离的胰腺β细胞进行单细胞RNA测序的方法。&gt;CAACGCAGAGT-3'</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Gapdh&lt;/em&gt; 上游引物</td><td></td><td></td><td>5'-ATGGTGAAGGTC&lt;br /&gt;GGTGTGAAC-3'</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Gapdh &lt;/em&gt;逆转录引物</td><td></td><td></td><td>5'-GCCTTGACT&lt;br /&gt;GTGCCGTTGAAT-3'</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Ins2&lt;/em&gt; 上游引物</td><td></td><td></td><td>5'-TGGCTTCTTC&lt;br /&gt;TACACACCCA-3'</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Ins2&lt;/em&gt; 逆转录引物</td><td></td><td></td><td>5'-TCTAGTTGCA&lt;br /&gt;GTAGTTCTCCA-3'</td></tr></tbody></table>

小鼠胰腺内分泌细胞的单细胞转录组分析

Single-cell Transcriptomic Analyses of Mouse Pancreatic Endocrine Cells

胰腺内分泌细胞聚集于胰岛中，调控血糖稳定性和能量代谢。胰岛中包含多种不同的细胞类型，例如分泌胰岛素的β细胞，这些细胞在胚胎发育阶段由共同的内分泌前体细胞分化而来。未成熟的内分泌细胞通过细胞增殖进行扩增，并在出生后较长的发育时期内逐渐成熟。然而，这些过程背后的分子机制尚不明确。单细胞RNA测序是一种有前景的技术，可用于鉴定不同的细胞群体并追踪细胞谱系的分化路径。本文中，我们描述了一种针对胚胎期、新生期及出生后胰腺中分离得到的胰腺β细胞进行单细胞RNA测序的方法。

从胚胎期、新生期和出生后小鼠中分离胰腺（图2A 和 2B）。对于出生后18天以上的小鼠，消化效果取决于灌注程度；因此，注射是胰岛分离过程中最关键的步骤（图2C-2E 和 Table 6）。在此步骤中应尽可能注入足量的胶原酶以充分填充胰腺。完全膨胀的胰腺如 图2D 所示。如果灌注不成功（图2E），但样本珍贵，可将胰腺撕成小块，以便后续充分消化。
灌流后，将胰腺组织消化成小块以释放胰岛（图2F）。为了缩短FACS分选时间，我们通...

我们描述了一种从胚胎期、新生期及出生后胰腺中分离内分泌细胞并进行单细胞RNA测序的方法。该方法可用于分析胰腺内分泌细胞谱系发育、细胞异质性及转录组动态变化。

胰岛中成簇分布的胰腺内分泌细胞可调节血糖稳定性和能量代谢。胰岛中的不同细胞类型，……

该方法可解答胰岛领域中关于胰岛谱系分化、成熟及再生的关键科学问题。该技术的主要优势在于，能够收集单个胰岛细胞，从而生成高质量的单细胞RNA测序数据。通过在病理条件下对胰腺内分泌单细胞进行转录组学分析，该技术的应用可进一步拓展至糖尿病及其他胰腺内分泌相关疾病的治疗研究。该方法的可视化演示至关重要，因为将针头插入胰腺狭窄的胆管以进行灌注操作较为困难。适用于胚胎第17.5天的胚胎。打开腹腔后，使用弯头镊子将内脏组织转移至含有冷PBS的6厘米黑色底培养皿中。使用镊子将胰腺从内脏组织上分离，并将胰腺组织放入含有5毫升冷胶原酶溶液的20毫升小瓶中。对于出生后第0至15天的小鼠，在将组织放入胶原酶溶液前，需仔细分离胰腺的所有叶。对于出生后第18至60天的小鼠，首先去除剑突并将肠管移至腹腔右侧。将肝脏的左内叶和右内叶分别向两侧推开，以暴露胆囊和胆总管。然后用一对小型血管夹在十二指肠的上下位置夹闭，使胆管进入十二指肠的部位位于两夹之间。接下来，用5毫升注射器吸取冷的胶原酶溶液，该注射器需配备30号针头。使用显微镜引导，将针尖插入胆囊，并通过胆总管小心且平稳地操作针头。根据小鼠的大小，用1至5毫升胶原酶溶液灌注胰腺，并下压注射器推杆。当全部溶液灌注完毕后，立即用镊子将胰腺转移至含有5毫升新鲜冷胶原酶溶液的20毫升小瓶中。当所有胰腺组织收集完毕后，将小瓶置于37°C水浴中3分钟，随后轻轻振荡3至5分钟。然后将消化产物通过一个0.25毫米的尼龙滤网过滤至新的50毫升离心管中。使用含有冰冻PBS的20毫升注射器彻底冲洗滤网。对于出生后第18至60天的胰腺组织，离心过滤后的样品，并将组织重悬于30毫升冷PBS中。然后将组织悬液倾倒至一个6厘米的黑色底培养皿中，使用200微升移液器并在解剖显微镜下挑选胰岛，转移至含有少量冷PBS的1.5毫升微量离心管中。对于胚胎第17.5天及出生后第15天的胰腺组织，将过滤后的胰腺组织离心，并将沉淀重悬于胰蛋白酶-EDTA溶液中，在37摄氏度水浴中孵育4分钟。孵育结束后，用200微升移液器轻轻吹打沉淀1分钟，随后加入相当于溶液体积0.5倍的冷胎牛血清，轻柔涡旋以终止消化反应。然后通过离心收集消化产物，并将细胞重悬于5毫升FACS管中的200微升FACS缓冲液中，用于流式细胞术分选。对于单细胞挑选与裂解，将 freshly prepared 细胞裂解缓冲液分装至八联PCR管中，每管加入一个单细胞。涡旋振荡样品以裂解细胞并释放RNA，随后在4摄氏度下离心30秒，并立即置于冰上保存。进行逆转录时，将裂解液在72摄氏度孵育三分钟，随后置于冰上一分钟。在4摄氏度下短暂离心样品30秒，然后向每个样品中加入5.7 µL逆转录混合液，使每个样品的总体积达到10 µL。轻轻涡旋混匀后离心，将样品加入热循环仪中，并启动逆转录程序。对于聚合酶链式反应预扩增（PCR），向含有第一链反应产物的每个样本中加入15微升PCR混合液，轻轻涡旋混匀并离心。然后将样本加入热循环仪中，启动PCR程序。对于PCR纯化，向每个样本中加入25微升重悬的DNA纯化磁珠，通过涡旋充分混匀。然后在室温下快速离心样品，以收集液体，同时避免磁珠沉降。室温孵育5分钟后，将样品置于合适的磁力架上，待溶液澄清后，小心移除并弃去上清液。每次用200 µL新鲜配制的80%乙醇洗涤磁珠，每次洗涤30秒，共洗涤两次。第二次洗涤后弃去剩余的乙醇。当磁珠完全干燥后，加入11 µL无核酸酶水以洗脱磁珠上的DNA目标片段，随后进行涡旋振荡。然后迅速离心样品，将样品放回磁力架上直至溶液澄清，再将每个样品中的10 µL转移至新的PCR管中。成功扩增的cDNA应具有超过500个碱基对的全长，并在1.5至2千碱基对范围内富集。此外，在胰岛素1 RFP阳性细胞中通常可观察到500至600碱基对的cDNA富集，这可能代表胰岛素转录本。然而，接近100碱基对的cDNA片段为引物二聚体，通常由引物过量引起，必须通过重复DNA纯化步骤予以去除。长度在100至500个碱基对之间的cDNA片段通常代表已降解的cDNA，这可能是由于细胞状态不佳或局部问题（如RNase污染）所致，应予以排除。在对cDNA文库进行测序纯化后，通过在第一轮和第二轮纯化中加入DNA纯化磁珠，可获得大小在250至450个碱基对之间的cDNA。经过DNA磁珠纯化后，在测序质量评估中，测序质量得分应大于30。为了获得高质量的细胞用于下游分析，排除比对到基因组的读段数少于50万或检测到的基因数少于4,000个的细胞，这有助于在主成分分析和层次聚类后对不同细胞群进行表征，并鉴定在不同细胞群中异质性表达的基因。在执行该操作时，需注意在胶原酶消化前迅速灌注胰腺，以避免胰岛过度消化，并在单细胞操作过程中保持无RNase的环境。完成该操作后，可进一步开展胰岛成像和培养等其他方法，以促进胰岛结构的可视化，并用于检测细胞反应及药物刺激效应。该技术建立后，为胰腺研究领域的科研人员探索哺乳动物胰岛谱系发育与再生机制以及糖尿病进展过程铺平了道路。

single-cell-transcriptomic-analyses-mouse-pancreatic-endocrine

Research

科研

JoVE Journal

Developmental Biology

发育生物学

小鼠胰腺内分泌细胞的单细胞 Transcriptomic 分析

以下方案概述了用于虚拟切片成像的胰腺解剖过程，以及对整个胰腺中所有GFP标记的β细胞进行定量分析的后续步骤。...

in situ 小鼠胰岛β细胞数量的原位定量分析

一种小鼠胰岛分离及细胞内cAMP测定方法

本文介绍了一种从小鼠胰腺中快速、便捷地分离和培养原代胰腺腺泡细胞的方法。该方法为研究新鲜原代正常/未转化的外分泌胰腺细胞的生理学特性提供了一种有价值的途径。...

小鼠原代胰腺腺泡细胞的分离与培养

体外集落形成实验用于鉴定从成年小鼠胰腺中分离的三潜能前体细胞

本文介绍一种从胚胎期、新生期和成年小鼠胰腺组织中分离胰腺微环境中细胞的方法，重点在于间充质细胞的分离。该方法可用于分析细胞的基因表达和蛋白质分泌，从而阐明调控胰腺发育、功能及肿瘤发生过程中的外在信号。...

通过流式细胞术分离和分析胰腺间充质细胞

本文介绍了一种从悬浮培养的 e10.5...

由小鼠胰腺前体细胞生成无支架三维胰岛素表达胰腺类器官 体外

本文介绍了一种利用基于液滴的微流控单细胞RNA测序技术，从分离的人胰岛中生成高质量、大规模单细胞转录组数据的实验方案。...

单细胞RNA测序及人胰岛分析

胰腺化生细胞是可发展为胰腺肿瘤的恶性细胞前体。然而，分离完整且具有活性的胰腺细胞具有挑战性。本文介绍一种高效的胰腺组织解离方法，所获得的细胞可用于单细胞RNA测序（scRNA-seq）或二维、三维共培养实验。...

胰腺组织解离以分离有活力的单细胞

本方案描述了如何利用已故器官捐献者的胰腺制备人胰腺切片，以在接近生理条件下研究细胞功能。这一创新方法能够实现对正常及结构受损胰岛的检测，并深入探究内分泌与外分泌区域之间的复杂相互作用。...

生成人胰腺组织切片以研究内分泌和外分泌胰腺生理学

本方案描述了从小鼠完整胰腺中分离内皮细胞的方法。...

小鼠胰腺内皮细胞的分离

我们提供一种微创方案，用于将人干细胞来源的胰腺干细胞胰岛移植到免疫缺陷小鼠的肌肉内 体内...

小鼠肌肉内移植人多能干细胞衍生的胰腺内分泌细胞

了解小鼠胰腺内分泌细胞的单细胞转录组分析方法，用于研究胰岛细胞谱系分化、成熟及再生过程。该技术可生成高质量RNA测序数据，为糖尿病等胰腺内分泌疾病的机制研究与治疗策略提供重要依据。

小鼠胰腺内分泌细胞的单细胞转录组分析

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