小鼠胰腺内分泌细胞的单细胞转录组分析

该方法可解答胰岛领域中关于胰岛谱系分化、成熟及再生的关键科学问题。该技术的主要优势在于，能够收集单个胰岛细胞，从而生成高质量的单细胞RNA测序数据。通过在病理条件下对胰腺内分泌单细胞进行转录组学分析，该技术的应用可进一步拓展至糖尿病及其他胰腺内分泌相关疾病的治疗研究。

该方法的可视化演示至关重要，因为将针头插入胰腺狭窄的胆管以进行灌注操作较为困难。适用于胚胎第17.5天的胚胎。打开腹腔后，使用弯头镊子将内脏组织转移至含有冷PBS的6厘米黑色底培养皿中。

使用镊子将胰腺从内脏组织上分离，并将胰腺组织放入含有5毫升冷胶原酶溶液的20毫升小瓶中。对于出生后第0至15天的小鼠，在将组织放入胶原酶溶液前，需仔细分离胰腺的所有叶。

对于出生后第18至60天的小鼠，首先去除剑突并将肠管移至腹腔右侧。将肝脏的左内叶和右内叶分别向两侧推开，以暴露胆囊和胆总管。然后用一对小型血管夹在十二指肠的上下位置夹闭，使胆管进入十二指肠的部位位于两夹之间。

接下来，用5毫升注射器吸取冷的胶原酶溶液，该注射器需配备30号针头。使用显微镜引导，将针尖插入胆囊，并通过胆总管小心且平稳地操作针头。

根据小鼠的大小，用1至5毫升胶原酶溶液灌注胰腺，并下压注射器推杆。当全部溶液灌注完毕后，立即用镊子将胰腺转移至含有5毫升新鲜冷胶原酶溶液的20毫升小瓶中。当所有胰腺组织收集完毕后，将小瓶置于37°C水浴中3分钟，随后轻轻振荡3至5分钟。

然后将消化产物通过一个0.25毫米的尼龙滤网过滤至新的50毫升离心管中。使用含有冰冻PBS的20毫升注射器彻底冲洗滤网。对于出生后第18至60天的胰腺组织，离心过滤后的样品，并将组织重悬于30毫升冷PBS中。

然后将组织悬液倾倒至一个6厘米的黑色底培养皿中，使用200微升移液器并在解剖显微镜下挑选胰岛，转移至含有少量冷PBS的1.5毫升微量离心管中。对于胚胎第17.5天及出生后第15天的胰腺组织，将过滤后的胰腺组织离心，并将沉淀重悬于胰蛋白酶-EDTA溶液中，在37摄氏度水浴中孵育4分钟。孵育结束后，用200微升移液器轻轻吹打沉淀1分钟，随后加入相当于溶液体积0.5倍的冷胎牛血清，轻柔涡旋以终止消化反应。

然后通过离心收集消化产物，并将细胞重悬于5毫升FACS管中的200微升FACS缓冲液中，用于流式细胞术分选。对于单细胞挑选与裂解，将 freshly prepared 细胞裂解缓冲液分装至八联PCR管中，每管加入一个单细胞。涡旋振荡样品以裂解细胞并释放RNA，随后在4摄氏度下离心30秒，并立即置于冰上保存。

进行逆转录时，将裂解液在72摄氏度孵育三分钟，随后置于冰上一分钟。在4摄氏度下短暂离心样品30秒，然后向每个样品中加入5.7 µL逆转录混合液，使每个样品的总体积达到10 µL。轻轻涡旋混匀后离心，将样品加入热循环仪中，并启动逆转录程序。

对于聚合酶链式反应预扩增（PCR），向含有第一链反应产物的每个样本中加入15微升PCR混合液，轻轻涡旋混匀并离心。然后将样本加入热循环仪中，启动PCR程序。对于PCR纯化，向每个样本中加入25微升重悬的DNA纯化磁珠，通过涡旋充分混匀。

然后在室温下快速离心样品，以收集液体，同时避免磁珠沉降。室温孵育5分钟后，将样品置于合适的磁力架上，待溶液澄清后，小心移除并弃去上清液。每次用200 µL新鲜配制的80%乙醇洗涤磁珠，每次洗涤30秒，共洗涤两次。

第二次洗涤后弃去剩余的乙醇。当磁珠完全干燥后，加入11 µL无核酸酶水以洗脱磁珠上的DNA目标片段，随后进行涡旋振荡。然后迅速离心样品，将样品放回磁力架上直至溶液澄清，再将每个样品中的10 µL转移至新的PCR管中。

成功扩增的cDNA应具有超过500个碱基对的全长，并在1.5至2千碱基对范围内富集。此外，在胰岛素1 RFP阳性细胞中通常可观察到500至600碱基对的cDNA富集，这可能代表胰岛素转录本。然而，接近100碱基对的cDNA片段为引物二聚体，通常由引物过量引起，必须通过重复DNA纯化步骤予以去除。

长度在100至500个碱基对之间的cDNA片段通常代表已降解的cDNA，这可能是由于细胞状态不佳或局部问题（如RNase污染）所致，应予以排除。在对cDNA文库进行测序纯化后，通过在第一轮和第二轮纯化中加入DNA纯化磁珠，可获得大小在250至450个碱基对之间的cDNA。经过DNA磁珠纯化后，在测序质量评估中，测序质量得分应大于30。

为了获得高质量的细胞用于下游分析，排除比对到基因组的读段数少于50万或检测到的基因数少于4,000个的细胞，这有助于在主成分分析和层次聚类后对不同细胞群进行表征，并鉴定在不同细胞群中异质性表达的基因。在执行该操作时，需注意在胶原酶消化前迅速灌注胰腺，以避免胰岛过度消化，并在单细胞操作过程中保持无RNase的环境。完成该操作后，可进一步开展胰岛成像和培养等其他方法，以促进胰岛结构的可视化，并用于检测细胞反应及药物刺激效应。

该技术建立后，为胰腺研究领域的科研人员探索哺乳动物胰岛谱系发育与再生机制以及糖尿病进展过程铺平了道路。