小鼠胰腺内分泌细胞的单细胞 Transcriptomic 分析
September 30th, 2018
我们描述了一种方法, 从胚胎, 新生儿和产后胰腺的内分泌细胞分离, 其次是单细胞 RNA 测序。这种方法可以分析胰腺内分泌谱系的发展, 细胞异质性和 transcriptomic 动力学。
该方法可以回答胰岛内关于胰岛血统分化、成熟和再生的关键问题。该技术的主要优点是，它允许收集单个胰腺胰岛细胞，以生成高质量的单细胞RNA测序数据。该技术的应用通过胰腺内分泌单细胞对病理条件的转录分析，应用于糖尿病和其他胰腺内分泌相关疾病的治疗。
这种方法的视觉演示至关重要，因为将针头插入胰腺的狭窄胆管进行灌注可能比较棘手。对于胚胎日17.5胚胎。打开腹腔后，用肘钳将内脏组织转移到含有冷 PBS 的六厘米黑底盘。
使用钳子将胰腺从内脏组织中分离出来。将胰腺组织放在含有5毫升冷胶原酶溶液的20毫升小瓶中。对于产后零至15只小鼠，在将组织放入胶原酶之前，请仔细解剖胰腺的所有叶。
对于产后第18至60天小鼠，首先取出西腓，将肠道提取到腹腔右侧。将肝脏的左右中叶推到两侧，露出胆囊和普通胆管。在上部和下部位置用一对小容器夹住十二指肠，使胆管进入十二指肠的场地侧翼。
接下来，加载一个5毫升注射器，配备30量针与冷胶原酶溶液。并使用显微镜将针尖插入胆囊。小心和平稳地通过普通胆管操纵针头。
并按下柱塞，根据小鼠的大小，用一到五毫升的胶原酶溶液来使胰腺具有。当所有溶液都已注入时，使用钳子立即将胰腺转移到含有 5 毫升新鲜冷胶原蛋白溶液的 20 毫升小瓶中。收集完所有胰腺组织后，将小瓶放在37摄氏度的水浴中3分钟，然后轻轻摇晃3至5分钟。
然后通过0.25毫米尼龙过滤器将消化的产品过滤到新的50毫升离心管中。并使用含有冰冷 PBS 的 20 毫升注射器彻底清洗过滤器。对于产后第 18 至 60 天胰腺，将过滤的样品离心机，并在 30 毫升冷 PBS 中重新暂停组织。
然后将组织悬浮液放入六厘米的黑色底盘中，并使用 200 微升移液器和解剖显微镜将小岛拾取，以转移到含有少量冷 PBS 的 1.5 毫升微离心管中。对于胚胎期17.5产后第15胰腺，离心过滤的胰腺组织，并在胰腺素-EDTA溶液中重新暂停颗粒，在37摄氏度的水浴中孵育4分钟。在孵育结束时，用200微升移液器轻轻对颗粒进行一分钟的评价，然后加入0.5倍的冷胎牛血清体积，轻轻的涡流停止消化。
然后通过离心收集消化液，并在5毫升的FACS管中将200微升的FACS缓冲液中重新填充，然后通过流式细胞分法进行分拣。对于单细胞采摘和解解，等分新鲜准备的细胞解液缓冲液分成8条PCR管，并将单个细胞转移到每个管中。涡流样品，使细胞释放RNA，随后在4摄氏度下离心30秒，并立即储存在冰上。
对于逆转录，在72摄氏度下孵育3分钟，随后在冰上孵育1分钟。在4摄氏度下将样品短暂离心30秒，并将5.7微升的逆转录混合物添加到每个样品中，使每个样品的总体积达到10微升。温和涡流和离心后，将样品装入热循环器，然后开始逆转录程序。
对于聚合酶链式反应预增，或 PCR，在包含第一股反应的每个样品中加入 15 微升 PCR 混合物，然后进行温和涡流和离心。然后将样品加载到热循环器中，然后启动 PCR 程序。对于 PCR 纯化，在每个样品中加入 25 微升的重新暂停的 DNA 纯化珠，通过涡流混合良好。
然后在室温下快速旋转样品以收集液体，同时避免珠子沉降。在室温下五分钟后，将样品放在适当的磁性支架上，在溶液清除时小心地取出和丢弃上清液。用两个30秒洗涤珠子，在200微升新鲜准备的80%乙醇每次洗涤。
第二次洗涤后丢弃剩余的乙醇。当珠子风干时，加入11微升无核酸水，从珠子中检测出DNA靶点，然后进行涡流。然后快速离心样品，将样品返回磁站，直到溶液清除，将每个样品的10微升转移到新的PCR管中。
成功放大的cDNA应具有500个基对以上的全长，并丰富从1.5至2个千斤基对。此外，在胰岛素中观察到的cDNA基对浓缩有500至600基对，一个RFP加细胞，这可能代表胰岛素记录。然而，100个碱基对附近的cDNA片段是底像二丁二线，通常由过多的底能引起，必须通过重复DNA纯化步骤去除。
100 到 500 个基对之间的 cDNA 片段通常表示降解的 cDNA，这是由不良细胞状态或区域问题（如 RNase 污染）引起的，应排除。在cDNA库进行测序纯化后，可以通过在第一轮和第二轮纯化中加入DNA纯化珠获得250至450个碱基对的cDNA。DNA珠纯化后，测序质量评价中测序质量得分应大于30。
为了获得用于下游分析的高质量细胞，排除了读取量小于0.5万或检测到少于4000个基因的细胞，从而有助于不同细胞群的表征，以及在主要成分分析和聚类分层后，识别不同组异构表达的基因。在尝试此程序时，重要的是要记住在胶原酶消化之前快速吸收胰腺，以避免胰岛过度消化，并在单细胞程序期间保持无 RNase 环境。按照这个程序，其他方法，如小岛成像和文化可以执行，以促进小岛结构的可视化，并检查细胞反应和药物刺激。
开发后，该技术为胰腺研究领域的研究人员探索胰岛血统发育和再生机制以及哺乳动物糖尿病进展铺平了道路。
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概述
本文描述了一种从胰腺发育的各个阶段分离内分泌细胞的方法，随后进行单细胞RNA测序。该技术能够详细分析胰腺内分泌谱系的发育和细胞异质性。
主要研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 细胞生物学
- 内分泌学
背景
- 了解胰岛细胞谱系分化对于糖尿病研究至关重要。
- 单细胞RNA测序提供高质量的转录组数据。
- 该方法允许研究细胞成熟和再生。
- 视觉指导对于程序的技术方面很重要。
研究目的
- 分析胰腺内分泌细胞的发育和异质性。
- 研究胰岛中的再生过程。
- 通过转录组分析增强对糖尿病和相关疾病的理解。
使用的方法
- 从胚胎、新生和出生后的胰腺中分离内分泌细胞。
- 进行单细胞RNA测序以进行转录组分析。
- 为了清晰起见，对方法进行视觉演示。
- 在过程中使用弯头镊子和冷PBS。
主要结果
- 该方法成功分离出单个胰岛细胞。
- 生成了高质量的RNA测序数据。
- 提供了关于胰岛细胞谱系分化和成熟的见解。
- 讨论了在糖尿病治疗中的潜在应用。
结论
- 该技术是研究胰腺内分泌细胞的宝贵工具。
- 它提供了一个途径，以更好地理解和治疗胰腺内分泌相关疾病。
- 进一步的研究可以在发现的基础上探索治疗选择。
常见问题
Executive Industry Relevance
Single-cell transcriptomic profiling of pancreatic endocrine cells enables mechanistic de-risking in diabetes target validation by resolving cellular heterogeneity and lineage trajectories. This approach supports predictive confidence in early discovery by linking molecular phenotypes to functional states of insulin-producing β cells across developmental stages. The method provides a disease-relevant system for assessing target engagement and transcriptional responses in preclinical models of metabolic disease.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by mapping endocrine progenitor differentiation and β cell maturation pathways.
- Operational Value: Provides quantitative single-cell resolution for de-risking targets involved in islet lineage specification and regeneration.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates high-quality transcriptomic datasets for biomarker discovery and assay standardization in endocrine cell populations.
- Operational Value: Supports scalable isolation workflows for preparing validated cellular inputs in downstream screening applications.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Facilitates disease-relevant system modeling by comparing transcriptional states across embryonic, neonatal, and postnatal pancreatic contexts.
- Operational Value: Enables longitudinal tracking of cell state transitions to inform risk-adjusted advancement in preclinical diabetes models.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum by providing transcriptional readouts that inform target validation and lead identification in metabolic disease programs.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification in endocrine lineage development and β cell functional maturation.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative single-cell outputs for assay readiness and compound effect profiling in islet-derived systems.
- Analytics: Enables principal component analysis and hierarchical clustering to identify heterogeneously expressed genes and define cell states.
- Translational Research: Connects developmental transcriptional signatures to postnatal maturation and regeneration processes relevant to disease modeling.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized platform for endocrine cell profiling applicable across multiple disease stages and genetic models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence through mechanistic de-risking of β cell identity and function targets.
- Operational Value: Standardized isolation and sequencing workflow ensuring reproducibility across developmental timepoints.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by reducing ambiguity in target biology and cellular response predictions.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on transcriptional evidence in disease-relevant endocrine cell contexts.
Implementation Considerations
- Requires expertise in tissue dissection, enzymatic perfusion, and single-cell handling under RNase-free conditions.
- Dependent on access to perfusion instrumentation, flow cytometry, and thermocycling platforms for library preparation.
- Necessitates cross-team standardization of digestion timing, staining protocols, and QC thresholds for cell viability and RNA integrity.
- Adaptation across model systems requires optimization of collagenase concentration and perfusion volume based on pancreatic size and developmental stage.
- Practical limitations include tissue yield variability and the need for rapid perfusion to prevent over-digestion, as noted in the procedural guidance.
