快速、安全、简便的手动床旁全血样本病毒核酸提取方法

该方法在对出现病毒感染症状的患者进行床旁诊断时具有重要帮助。此技术的主要优势在于无需实验室设备和电力，因此可在医院病房内实施。接下来将由我实验室的医学博士 Anders Fomsgaard 和科学家 Morten Rasmussen 演示血液采集操作流程。

首先准备采血管。使用连接在3 mL注射器上的25号一英寸针头，将1.6 mL商用裂解缓冲液注入4 mL EDTA真空采血管中。必须保持采血管内的真空状态，以确保血液采集成功。

因此，务必使用针头将裂解缓冲液注入采血管中。接下来，充分重悬体积为960 µL的磁性玻璃颗粒（MGPs），并转移至已标记的1.8 mL离心管中。随后，用移液器将4 mL洗涤缓冲液一加入标记为WB-1的4.5 mL离心管中，将1.5 mL洗涤缓冲液二加入标记为WB-2的3.6 mL离心管中，再将3 mL洗涤缓冲液三加入标记为WB-3的4.5 mL离心管中。

最后，向标记为 EB 的 1.8 mL 离心管中加入 100 µL 洗脱缓冲液，并将离心管置于室温下备用。采集患者静脉全血时，使用带细孔延长管的蝶形针头，以及一支预先准备好的含有裂解缓冲液的真空采血管。让患者的上肢保持下垂位置。

将蝶形针插入患者的静脉，将采血管连接到细径延长管上。采血后，通过将采血管上下颠倒混匀5至10次，使管内成分充分混合。使用70%乙醇对采血管外表面进行消毒。

然后在室温下孵育试管20分钟，以灭活病毒。为了从采集的血液中纯化核酸，再次通过手动倒置真空管5到10次来混匀管内内容物。将MGP的预分装 aliquot 直接倒入血液采集管中。

将一个未使用过的采血管的新管盖盖在含有样本的采血管上。用手指按住管盖，确保采血管紧密闭合，并通过上下倒置5到10次来混匀管内成分。将采血管放入磁力架中，并用手指按住管盖，以确保管子紧密闭合。

然后将带有试管的磁力架翻转数次，使磁性颗粒（MGP）在被磁铁吸附到管壁之前充分分散。打开试管盖，用一次性移液管将试管内的液体弃入50 mL收集管中。将制备好的WB-1分装液直接倒入血液收集管中，并盖紧管盖。

用手轻轻混合5到10次。然后将磁珠用磁铁吸附至管壁一侧，吸除上清液，操作同前。将磁珠重悬于已准备好的WB-2分装液中，随后弃去溶液，并用已准备好的WB-3分装液重复该步骤。

最后，将离心管从磁力架上取下，直接将制备好的EB等分试样倒入血液采集管中。盖上管盖，用手指轻弹5到10次，使磁性玻璃粉（MGP）重新悬浮。最后，使用一支1.5 mL一次性移液器，将一滴重悬的MGP转移至下游核酸扩增反应体系中。

在将MGP转移至PCR反应体系之前，务必充分重悬MGP。为验证概念可行性，使用来自几内亚南部近期疫情的埃博拉病毒标准品的10倍系列稀释液，或三种不同浓度的EB病毒（Epstein-Barr virus），对阴性全血样本进行加标。提取的核酸采用实验室自建的病毒特异性R2 qPCR或qPCR进行分析。

扩增曲线的循环阈值（CT）越低，表明病毒基因组拷贝数越高。本实验中，通过埃博拉病毒特异性的环介导等温扩增（LAMP）法检测了添加不同浓度埃博拉病毒的全血样本。X 轴显示加标全血样本中病毒的最终浓度，Y 轴显示检测结果呈阳性所需的时间（分钟）。

在此实验中，使用世界卫生组织（WHO）标准化的丙型肝炎病毒血清样本对全血进行10倍系列稀释后加标，并通过HCV特异性的RT-qPCR进行检测。最后，此图像显示了对EB病毒阳性全血样本进行EB病毒特异性LAMP反应的结果。在进行该操作时，重要的是必须使用指定的裂解结合缓冲液。

这是一个关键步骤，也是该方法的关键试剂。这种裂解结合缓冲液可使样本中的病毒失活。采用此技术后，可进行不同的分子检测方法，如环介导等温扩增（LAMP）和聚合酶链式反应（PCR），从而实现鉴别诊断。