Name: 注射器-注射用网状电子技术稳定的慢性啮齿动物电生理学 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-21T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 58 s
Description: 学习网状电子注射技术用于小鼠大脑长期稳定单神经元电生理记录。该方法通过光刻工艺制备柔性探针，实现与神经组织的无缝整合，为研究脑发育、衰老及疾病机制提供可靠工具。

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C.M.L. 感谢美国空军科学研究办公室（FA9550-14-1-0136）、哈佛大学物理科学与工程加速器奖以及美国国立卫生研究院院长先锋奖（1DP1EB025835-01）对本工作的资助。T.G.S. 感谢美国国防部（DoD）通过国家国防科学 &amp;#38; 工程研究生奖学金（NDSEG）项目。G.H. 感谢美国心脏协会（16POST27250219）以及美国国立卫生研究院国家衰老研究所的独立研究之路奖（Parent K99/R00）提供的资助。本研究部分工作在哈佛大学纳米系统中心（CNS）完成，该中心是国家纳米技术协调基础设施网络（NNCI）的成员，由美国国家科学基金会通过NSF ECCS奖号1541959资助支持。

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作者无任何利益冲突需要披露。

在网状电子器件的制备和使用过程中，所有步骤都很重要，但其中一些尤为关键。在将网状电子器件从晶圆上释放之前，必须对其表面进行氧化处理，以使网状结构能够易于悬浮于水溶液中（步骤1.6.1）。如果跳过此步骤，网状结构通常会漂浮在水面上，难以装入针头；即使能够装入，也常常会粘附在玻璃针内壁，导致需要使用较大体积的液体&#62;100 µL）进行注射。因此，若在释放前未能对表面进行氧化处理，通常意味着网格无法使用，必须从头重新制备。另一个关键步骤是弯曲网格电子器件 &#34;茎&#34; 在I/O接口连接过程中（步骤4.3），应将角度调整至约90°。如果角度小于90°，则全部32个I/O焊盘将无法完全插入ZIF连接器；部分焊盘需从末端切除以实现插入，从而减少连接的电极数量。操作过程中还须轻柔进行，以防茎部断裂。
通过修改光刻掩模并采用图2中所述的相同制备流程，可以针对不同应用定制化设计网状电子器件。例如，用于记录图9中数据的网状电子探针被设计为在小鼠海马体和初级体感皮层区域分布32个记录电极，但超柔性网状结构中的电极位置可被灵活选择以靶向几乎任意脑区，也可集成用于刺激的较大电极27。基本的网状结构和制备流程保持不变，仅调整电极的位置与设计以满足特定研究需求。然而，研究人员应谨慎操作，并始终验证经修改的设计能否顺利通过预定的注射针头。网状电子器件弯曲力学性能的微小变化可能对其可注射性产生显著影响。一个典型例子是：当横向与纵向SU-8条带之间的夹角为45°时，网状电子探针可轻松注射；而当夹角为90°时，则会导致探针皱缩并堵塞针头21。
测量记录电极的阻抗有助于排查问题。当测量频率为1 kHz时，直径为20 µm的圆形铂电极的阻抗幅值应接近1 MΩ。 体内 或在1×PBS中29阻抗显著大于此值表明电极未暴露，可能由于电极被光刻胶残留物污染，或未形成有效电连接所致。后者可能发生在例如光刻过程中光掩模表面存在灰尘，导致金互连结构断开，或在输入/输出接口连接时，ZIF连接器引脚未能与网格的某个I/O焊盘接触。若测得的阻抗值约为预期值的一半，则提示该通道可能与相邻通道发生短路，形成两个电极阻抗并联的电路。测量所得的阻抗值可作为故障排查的参考依据；结合对网状电子探针的光学显微镜观察，通常可在下一次制备流程或输入/输出连接尝试中识别并纠正问题根源。
使用可注射式网状电子器件进行急性研究存在局限性，因为通常在注射后1周内无法观察到单个神经元的放电活动27，尽管近期工作（未发表）表明该问题容易克服。观察到放电活动所需时间的关键决定因素包括网状结构的设计、随网状电子器件注入脑内的液体体积，以及注射所用针头的直径，因为这些因素会影响注射过程中的组织损伤程度和愈合速度。如果网状电子器件在镍蚀刻液中释放前未经过氧等离子体处理，则可能需要较大的注射体积；也就是说，如果网状结构不具备亲水性，可能会黏附于玻璃针头。偶尔，网状结构存在缺陷，导致其弯曲力学性能不佳，难以注射。在装载网状电子器件时，重要的是要检查网状结构是否能在针头内顺畅、平稳地移动（如图所示） 补充视频 1）。如果不符合，则应使用其他网状电子探针。实现无缝神经接口的最佳效果时，每4毫米注入的网状长度对应的理想注射体积为10–50 µL。近期使用更细网状电子探针和/或更小直径毛细注射针（内径小至150 µm，外径250 µm）的结果表明，单个神经元的放电活动可在注射后不久（急性期测量）直至较长时间内被观测到。这些更细网状结构的掩模设计文件可根据请求获取，或从资源网站meshelectronics.org下载。我们估计整体的产量为 体内 使用内径400 µm（外径650 µm）的针头进行网格注射时，成功率约为70%，而在我们近期使用内径150 µm（外径250 µm）针头的工作中，成功率接近80–90%。注射失败最常见的原因包括：（1）网格无法顺利注入，导致向脑内注入意外大体积的液体，从而引起脑水肿；（2）在输入/输出接口操作过程中，手动操作导致网格断裂；（3）注射过程中损伤血管引起出血。注射时损伤血管的情况较为罕见（占失败原因的不到10%），若采用影像引导手术可进一步降低该风险。我们还注意到，血管损伤是所有涉及穿透脑组织操作的常见局限性，包括病毒颗粒注射用于转染、刚性脑探针植入以及网格电子器件的注射。
如图9和图10所示，网状电子探针能够在数月到数年的时间尺度上稳定地记录并追踪相同的单个神经元，且几乎不引发慢性免疫反应。与传统的深部电极相比，这一特性具有显著优势；传统深部电极在长期记录实验过程中通常会出现尖峰信号幅度下降、信号不稳定以及慢性炎症等问题14,15。此外，网状电子探针还具有可在组织学切片、染色和成像过程中保留在组织内的优势，而传统探针因过于刚性，必须在组织学分析前移除。因此，网状电子探针具备独特的能力，可结合免疫组织化学分析，精确研究每个记录位点周围的细胞微环境。
本文所述方案为神经科学领域开辟了令人振奋的新机遇。这种微创递送方法以及网状电子器件与脑组织的无缝整合，可最大限度地减少对神经回路的干扰，并避免慢性免疫反应，因而有望广泛适用于多种类型的长期神经记录实验。网状电子器件能够长期记录并追踪同一单个神经元的活动，这一特性尤其有助于研究人员探索毫秒级的放电活动与衰老、脑部疾病发病机制或脑发育等持续数月乃至数年的生物学过程之间的相关性16,18。此外，该方案还具有显著的拓展与定制空间，例如可在印刷电路板前端加入有源电子元件，以实现数字多路复用8,35、无线通信35,36,37和信号处理35等功能；在注射网状电子器件的同时共注射干细胞或聚合物，以促进组织再生18,38,39；或将纳米线场效应晶体管（NW-FETs）整合入网状电子器件中，开发高度局部化、多功能的脑探针24,29,40,41,42。

开发能够以单神经元分辨率绘制大脑图谱的工具，对神经科学和神经病学具有核心重要性。用于神经研究的非侵入性技术，如脑电图（EEG）、脑磁图（MEG）和功能性磁共振成像（fMRI），已被证明在关联人类大脑活动与行为方面具有重要价值1,2，但它们在空间和时间分辨率上尚不足以在微米级和毫秒级的基本尺度上研究神经网络的结构与动态3,4。某些皮层脑电图（ECoG）探针以及使用电压敏感性染料的光学成像方法已成功实现了在体单细胞放电活动的记录in vivo5,6，但通常仅在脑表面附近有效，限制了&#160;其在浅层脑区研究中的&#160;应用。相比之下，可植入式电极探针能够在自由活动的动物中从几乎任何脑区记录单个神经元的电生理信号，且无需荧光标记，这使其成为系统神经科学不可或缺的工具，尤其随着半导体工业的微加工技术将通道数提升至数百乃至数千3,7,8,9。凭借这些能力，可植入式电极探针已在神经科学与神经病学领域作出诸多重要贡献，包括视觉系统中信息处理的基础研究10、帕金森病等神经系统疾病的治疗11，以及用于先进假肢的脑机接口（BMIs）的实现12,13。
然而，长期不稳定性表现为数周至数月时间尺度上的峰电位幅度下降和信号不稳定14,15，这限制了可植入探针在相对较短时间现象研究中的应用，导致诸如大脑衰老与发育等问题在很大程度上仍未得到解答。这种长期不稳定性源于传统探针与脑组织在尺寸、力学性能和拓扑结构上的不匹配14,15,16,17,18。在尺寸方面，神经元突触和胞体的直径分别约为几十纳米至几十微米19，而传统探针通常显著更大，例如硅基微电极阵列的尺寸通常超过单个神经元胞体的&#62;4倍7,8。探针相对较大的尺寸可能破坏致密神经组织的天然结构与连接性，从而引发慢性免疫反应，并干扰所研究的神经环路。在力学性能方面，传统探针的刚度远高于其植入的极为柔软的神经组织；即便是由10–20 µm厚聚酰亚胺薄膜制成的&#34;柔性&#34;探针，其刚度也至少比脑组织高100,000倍20,21。这种弯曲刚度的不匹配会导致探针与脑组织之间产生相对剪切运动，从而在长时间记录中造成单个神经元信号追踪不可靠，并在植入部位诱发慢性胶质增生。最后，传统脑探针的拓扑结构必然排除了一定体积的组织。这种拓扑结构的不匹配会破坏神经环路的连接性，阻碍神经元、胶质细胞和血管在脑组织中自然的三维（3D）互穿分布22，并妨碍信号分子的三维扩散23。综上所述，传统探针的这些缺陷使其难以满足临床应用以及单神经元水平长期神经科学研究所需的长期生物相容性。
为了克服这些不足，我们致力于通过开发一种新范式，模糊神经系统与电子系统之间的界限 &#34;类组织的&#34; 称为网状电子神经探针16,21,24网格电子器件通过以下方式解决了上述在尺寸、力学性能和拓扑结构方面的匹配问题：（1）具有与神经组织相同纳米至微米尺度的结构特征，（2）力学性能与脑组织相似，（3）具备三维大孔拓扑结构 &#62;90% 的开放空间，从而允许神经元的侵入以及分子在细胞外环境中的扩散。通过注射器和针头，网状电子探针可被精确递送至特定脑区，在植入过程中即使针对深部脑区也能造成最小的急性损伤。21,25神经元胞体和轴突在注射后数周内已显示出可相互渗透进入开放的三维网状电子探针结构，从而在记录电子器件与周围脑组织之间形成无缝且无胶质增生的界面21,26,27这些独特特性使得网格电子探针能够在至少一年的时间尺度上稳定地追踪同一单个神经元的放电活动27此外，基于光刻技术（PL）的网状电子器件制备方法可实现所集成电极数量的高度可扩展性，采用简单的接触式掩模光刻技术即可实现每探针多达128个电极的通道数28 即插即用的输入/输出（I/O）设计，可实现与外设电子设备的快速电气连接，且无需使用专用设备29.
多种研究均可从将网状电子器件整合到测量方案中获益。大多数皮层内记录实验均可受益于网状电子器件通过注射器注射实现的微创植入过程、植入后显著降低的免疫反应，以及在后续组织学和免疫染色过程中可将网状电子器件保留在组织内的能力，从而对每个记录位点周围的生物微环境进行精确分析。尤其是长期记录实验，将得益于网状电子器件能够连续数月乃至数年追踪大量单个神经元的独特能力。这一能力为以往难以实现的单神经元分辨率研究创造了条件，例如神经回路的纵向衰老研究、发育中大脑的研究，以及脑病发病机制的探究16。
在本方案中，我们描述了使用可注射式网状电子器件进行典型小鼠神经记录实验的全部关键步骤（见图1）。所描述的步骤包括在许多大学均可实现的标准PL基工艺中制备网状电子器件、将网状电子器件装载至标准毛细玻璃针头、立体定位法将网状电子器件进行体内注射、将网状电子器件的输入/输出端连接至标准仪器接口、在固定状态或自由活动状态下进行神经信号记录，以及对包含网状电子器件的脑组织进行组织学切片。部分仅将网状电子器件用于组织学研究的研究人员可能无需进行电学连接与记录，此类情况下可跳过相关步骤。研究人员在熟悉本方案后，将具备在其自身实验中应用网状电子器件所需的全部知识。

<table><tbody><tr><td>电动立体定位仪</td><td>World Precision Instruments</td><td>MTM-3</td><td>小鼠立体定位手术</td></tr><tr><td>512通道记录控制器</td><td>Intan Technologies</td><td>C3004</td><td>神经记录系统的一个组成部分</td></tr><tr><td>RHD2132 放大器板</td><td>Intan Technologies</td><td>C3314</td><td>神经记录系统的一个组成部分</td></tr><tr><td>RHD2000 3 英尺超薄 SPI 接口电缆</td><td>Intan Technologies</td><td>C3213</td><td>神经记录系统的一个组成部分</td></tr><tr><td>小鼠固定器</td><td>Braintree Scientific</td><td>TV-150&amp;nbsp;标准差</td><td>标准1.25英寸内径；用于在固定式记录期间限制小鼠活动。</td></tr><tr><td>硅片</td><td>Nova 电子材料</td><td></td><td>3&quot; P &amp;<100&gt; 0.001–0.005 欧姆·厘米 356–406 &amp;mu;微米厚&lt;br/&gt; Prime级 SSP Si 晶圆，带2个半标准平边 &amp;&&amp;lt;br/&gt; 6,000 A&amp;deg;&amp;plusmn;双面5%湿法热氧化层</td></tr><tr><td>光刻掩模（镀铬钠钙玻璃）</td><td>推进可重复性</td><td></td><td>Advance Reproductions 和其他供应商可根据提供的设计文件制作光掩模。我们的光掩模设计文件可通过申请或访问资源网站 meshelectronics.org 获取。此外，部分大学的洁净室配备有光掩模写入设备，可用于现场制作光掩模。</td></tr><tr><td>AutoCAD 软件</td><td>Autodesk Inc.</td><td></td><td>用于绘制光掩模的设计软件。一个免费的替代选择是 LayoutEditor。我们的光掩模设计文件可根据请求获取，或从资源网站 meshelectronics.org 获得。</td></tr><tr><td>热蒸发仪</td><td>Sharon 真空泵</td><td></td><td>用于在制造过程中将镍（Ni）、铬（Cr）和金（Au）蒸发沉积到网状电子器件上。许多大学的洁净室均配备此类或类似的设备。</td></tr><tr><td>SU-8 2000.5 负性光刻胶</td><td>MicroChem 公司</td><td></td><td>用于定义网格电子器件底部和顶部钝化层的负性光刻胶。</td></tr><tr><td>MA6 掩模对准器</td><td>Karl Suss Microtec AG</td><td></td><td>用于将每块光掩模与晶圆上的图案对齐，并用紫外光曝光晶圆。大多数大学的洁净室均配备此类或类似的设备。</td></tr><tr><td>SU-8显影液</td><td>MicroChem Corp.</td><td></td><td>用于在紫外光曝光后使SU-8负性光刻胶显影。</td></tr><tr><td>LOR3A 剥离型光刻胶</td><td>MicroChem 公司</td><td></td><td>与Shipley 1805光刻胶配合使用，以在金属剥离过程中促进侧向刻蚀</td></tr><tr><td>Shipley 1805 正性光刻胶</td><td>Microposit，陶氏化学公司</td><td></td><td>用于在网状电子器件中定义金属互连和铂电极的正性光刻胶</td></tr><tr><td>MF-CD-26 正性光刻胶显影液</td><td>Microposit，The Dow Chemical Company</td><td></td><td>在掩模对准仪中曝光后，使用S1805正性光刻胶进行显影。许多大学的洁净室均备有该化学品。</td></tr><tr><td>旋涂仪</td><td>雷诺兹科技</td><td></td><td>用于在晶圆上涂覆正性及负性光刻胶。大多数大学的洁净室均配备有匀胶机。</td></tr><tr><td>PJ等离子体表面处理系统</td><td>AST Products, Inc.</td><td></td><td>用于在将网状电子器件释放到水溶液之前氧化其表面。大多数大学的洁净室都配备有此类或类似的设备。</td></tr><tr><td>电子束蒸发仪</td><td>Denton Vacuum</td><td></td><td>用于在制造网状电子器件过程中蒸发铬和铂。许多大学的洁净室均配备此类或类似的设备。</td></tr><tr><td>PG去除剂</td><td>MicroChem Corp.</td><td></td><td>用于在金属剥离过程中溶解 LOR3A 和 Shipley S1805 光刻胶</td></tr><tr><td>氯化铁溶液</td><td>MG Chemicals</td><td>415-1L</td><td>Ni刻蚀溶液的一种组分</td></tr><tr><td>36% 盐酸溶液</td><td>Kanto Corp.</td><td></td><td>Ni刻蚀溶液的一种组分</td></tr><tr><td>玻璃毛细管针</td><td>Drummond Scientific Co.</td><td></td><td>内径 0.40 mm，外径 0.65 mm。其他直径也可提供。</td></tr><tr><td>U型微移液管夹持器</td><td>Molecular Devices, LLC</td><td>1-HL-U</td><td>用于在立体定位注射过程中固定玻璃毛细管针</td></tr><tr><td>1 mL注射器</td><td>NORM-JECT&amp;reg;, Henke Sass Wolf</td><td></td><td>用于将网状电子器件手动装载至毛细玻璃针中</td></tr><tr><td>聚乙烯颅内导管管路</td><td>贝克顿·迪金森公司</td><td></td><td>内径 1.19 mm，外径 1.70 mm</td></tr><tr><td>5 mL 注射器</td><td>Becton Dickinson and Company</td><td></td><td>用于注射泵中，以在活体内注射网状电子器件</td></tr><tr><td>目镜相机</td><td>Thorlabs Inc.</td><td>DCC1240C</td><td>用于在注射过程中观察毛细玻璃针内的网状电子器件</td></tr><tr><td>用于USB相机的ThorCam uc480图像采集软件</td><td>Thorlabs Inc.</td><td></td><td>用于在注射过程中观察毛细玻璃针内的网状电子器件</td></tr><tr><td>注射泵</td><td>哈佛仪器</td><td>PHD 2000</td><td>用于在注射网状电子器件时，通过毛细针精确输送溶液的体积</td></tr><tr><td>EXL-M40 牙科钻机</td><td>Osada</td><td>3144-830</td><td>用于钻取颅骨开窗</td></tr><tr><td>0.9 mm 钻头</td><td>精细科学工具</td><td>19007-09</td><td>用于钻取颅骨开窗</td></tr><tr><td>热珠灭菌器 14 cm</td><td>Fine Science Tools</td><td>18000-50</td><td>用于对手术器械进行灭菌</td></tr><tr><td>CM1950 冷冻切片仪</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td>用于将冷冻组织切成切片。许多大学在共享实验平台中配备此类或类似的设备。</td></tr><tr><td>0.3% Triton X-100</td><td>Life Technologies</td><td></td><td>用于组织学</td></tr><tr><td>5% 山羊血清</td><td>Life Technologies</td><td></td><td>用于组织学</td></tr><tr><td>3% 山羊血清</td><td>Life Technologies</td><td></td><td>用于组织学</td></tr><tr><td>兔抗 NeuN</td><td>Abcam</td><td>ab177487</td><td>用于组织学</td></tr><tr><td>小鼠抗神经丝蛋白</td><td>Abcam</td><td>ab8135</td><td>用于组织学</td></tr><tr><td>大鼠抗GFAP</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td><td>PA516291</td><td>用于组织学</td></tr><tr><td>ProLong Gold 抗荧光淬灭封片剂</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td><td>P36930</td><td>用于组织学</td></tr><tr><td>聚-D-赖氨酸</td><td>Sigma-Aldrich 公司</td><td>P6407-5MG</td><td>分子量 = 70-150 kDa</td></tr><tr><td>直角端部夹具</td><td>Thorlabs Inc.</td><td>RA180/M</td><td>用于将移液管固定器连接至立体定位仪框架</td></tr><tr><td>印刷电路板（PCB）</td><td>高级电路</td><td></td><td>用于连接网状电子器件与外周测量电子设备（如Intan记录系统）。Advanced Circuits及其他厂商可根据提供的设计文件制造和组装印刷电路板（PCB）。我们的PCB设计文件可通过申请或访问资源网站meshelectronics.org获取。</td></tr><tr><td>32通道标准放大器连接器</td><td>Omnetics Connector Corp.</td><td>A79024-001</td><td>组件组装到PCB上</td></tr><tr><td>32通道扁平柔性电缆（FFC）</td><td>Molex, LLC</td><td>152660339</td><td>用作夹紧基底，以连接PCB上的ZIF连接器与网格电子器件的输入/输出焊盘</td></tr><tr><td>32通道零插拔力（ZIF）连接器</td><td>Hirose Electric Co., LTD</td><td>FH12A-32S-0.5SH(55)</td><td>组件组装到印刷电路板上</td></tr></tbody></table>

可注射网状电子器件用于稳定的大鼠慢性电生理记录

Syringe-injectable Mesh Electronics for Stable Chronic Rodent Electrophysiology

可植入式脑电生理探针因其能够以高时空分辨率记录浅层和深层脑区的神经活动，成为神经科学中的重要工具。然而，由于探针与脑组织之间存在力学和结构上的不匹配，常导致微动和胶质增生，进而在长期记录实验中引起信号不稳定，限制了其应用。相比之下，通过注射器注射超柔性网状电子器件后，该网状探针可与周围脑组织形成无缝且无胶质增生的界面，实现对单个神经元至少一年时间尺度上的稳定追踪。本实验方案详细描述了使用注射式网状电子器件进行典型小鼠神经记录实验的关键步骤，包括在多数高校均可实现的标准光刻工艺中制备网状电子器件、将网状电子器件装载至标准毛细玻璃针头，以及立体定位注射 体内，将网状电子器件的输入/输出端连接至标准仪器接口，进行固定或自由活动状态下的记录，以及对包含网状电子器件的脑组织进行组织学切片。文中展示了典型的神经记录与组织学数据。熟悉本方案的研究人员将具备将网状电子器件整合至自身实验所需的知识，从而利用长期稳定的神经接口所带来的独特机遇，开展关于衰老过程、脑发育及脑疾病发病机制的研究。

结果会因研究中的动物种类、靶向脑区、注射后经过的时间、注射过程中造成的急性损伤程度以及输入/输出接口手术的成功与否等多种因素而有所不同。单个神经元的放电活动可能在注射后1天（使用内径为150 µm的针头时）至1周内才开始出现，且放电幅度可能在长达4–6周内持续变化。图9展示了将32通道网状电子探针注射到成年雄性C57BL/6J小鼠海马体和初级体感皮层后获得的代表性电生理数据。在全部32个通道上均记录到约300 µV幅度的局部场电位（LFP），并在26个通道上记录到单个神经元的放电活动。在2至4个月期间，LFP和分离出的放电信号保持稳定，表明记录电子器件与神经元之间在此长期时间内形成了高度稳定的接口。图10展示了注射1年后含有网状电子器件的脑组织切片及免疫染色的代表性结果。对神经元胞体标志物NeuN和神经轴突标志物神经丝蛋白（neurofilament）的染色显示，注射部位几乎没有组织密度的损失，提示网状电子器件与脑组织之间实现了无缝整合。对星形胶质细胞标志物GFAP的染色进一步显示，网状电子器件周围星形胶质细胞水平接近本底，表明其存在几乎未引发慢性免疫反应。
<img alt="网状电子器件工艺流程图；制备、注射、连接、记录、组织学。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58003/58003fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 1"> 
图 1：可注射式网状电子器件实验的步骤。 本方案描述了使用网状电子器件进行典型啮齿类动物神经记录实验中的所有关键步骤。实验通常按以下顺序进行：（1）网状电子器件的制备，（2）将网状电子器件装载至毛细玻璃针头中，（3）通过立体定位将网状电子器件注射入脑内，（4）实现与网状电子器件的电学输入/输出连接，（5）固定状态或自由活动状态下的电生理记录，以及（6）对网状电子器件与组织进行切片和染色以进行组织学分析。在某些研究中，可能仅需获取组织学数据，此时可省略步骤（4）和（5）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58003/58003fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="微机电系统（MEMS）制造，SU-8，Au，Pt 层，结构示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58003/58003fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 2"> 
图 2：示意图展示即插即用型网状电子器件在超柔性器件区域（第一行）、茎状互连区域（第二行）和输入/输出（I/O）区域（第三行）的制造流程。（A）使用 PL 掩模-1 对 SU-8 负性光刻胶（红色）进行图形化，以定义每个即插即用型网状电子探针的底部钝化层。（B）使用 PL 掩模-2 进行图形化，通过热蒸发和金属剥离工艺形成 Au 互连线路和 I/O 焊盘（金色）。（C）使用 PL 掩模-3 进行图形化，通过电子束蒸发和金属剥离工艺定义 Pt 电极（蓝色）。（D）使用 PL 掩模-4 对 SU-8 负性光刻胶（红色）进行图形化，以定义顶部钝化层。在每个 Pt 电极和 I/O 焊盘位置处，SU-8 上保留开口。（E）一个完整的网状电子探针，其中虚线框表示上方、中段和下方各行放大区域的位置。光刻掩模设计文件可向作者或资源网站 meshelectronics.org 申请获取。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58003/58003fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="光子集成电路、显微图像、波导结构、光信号路由示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58003/58003fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图3"> 
图3：即插即用型网状电子器件的照片与光学显微镜图像。（A）带有即插即用输入/输出（I/O）接口的可注射式网状电子探针的拼接光学显微图像。该探针在完成图2所示的全部 fabrication 步骤后、但尚未从镍涂层基底上释放时成像。虚线框从左至右分别对应超柔性器件区域、茎部和I/O区域，其放大图像见C、D和E。比例尺 = 1 mm。（B）包含20个已完成的网状电子探针的3英寸硅晶圆照片。比例尺 = 20 mm。（C）超柔性器件区域内直径为20 µm的铂记录电极的光学显微镜图像。比例尺 = 100 µm。（D）茎部区域高密度金互连结构的光学显微镜图像。每条金互连独立电隔离，并将单个铂电极连接至单个I/O焊盘。比例尺 = 100 µm。（E）I/O焊盘的光学显微镜图像。每个焊盘由位于茎部上的可塌陷网格区域和连续薄膜区域组成。非导电的SU-8条带将各焊盘的网格部分连接在一起，以帮助维持对准。比例尺 = 200 µm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58003/58003fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="用于液体流动控制的注射泵装置；实验设备的组装示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58003/58003fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 4"> 
图4：注射过程中用于固定毛细玻璃针的装置组装示意图。（A）装置各组件的照片。组件包括：（1）毛细玻璃针，（2）移液器 holder，（3）移液器 holder 的圆形螺钉紧固件，以及（4）移液器 holder 的锥形垫圈。其中（2）至（4）项随移液器 holder 的购买一并提供。箭头标示了移液器 holder 的出口，需用环氧树脂胶将其封闭。（B）组装完成后插入毛细玻璃针的移液器 holder 照片。移液器 holder 顶部出口处可见添加的环氧树脂（箭头所示），毛细管将移液器 holder 与注射器连接（注射器未显示）。（C）使用直角端夹将移液器 holder 与毛细玻璃针固定于立体定位仪上的照片。比例尺为 1 cm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58003/58003fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="光纤拉制过程、示意图及显示光纤形成动态的图像序列。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58003/58003fig5.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 5"> 
图 5：将网状电子器件装入玻璃针头。（A）即插即用型网状电子器件装入过程的示意图。将玻璃针头置于悬浮于溶液中的网状电子探针的输入/输出端附近，然后手动回抽注射器活塞，以吸入网状电子探针。理想的位置是使超柔性器件区域刚好位于针头末端内部。（B）与（A）相对应的网状电子探针装入玻璃针头的实际照片。比例尺 = 2 mm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58003/58003fig5large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="用于活体脑成像的显微镜装置，包含注射泵、计算机接口和数据分析系统" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58003/58003fig6.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图6"> 
图6：立体定位手术系统的示意图。 使用配备有移液管固定器的电动立体定位仪（A）将针头定位至目标脑区。通过物镜和连接的相机（B）监测针头及装载的网状电子器件的位置，并在计算机上（C）显示。注射泵（D）通过针头输送精确体积的生理盐水，从而实现将网状电子器件准确、可控地注射到目标脑区。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58003/58003fig6large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="用于测量啮齿类动物脑信号的神经科学实验装置，带有电极。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58003/58003fig7.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 7"> 
图 7：即插即用型输入/输出接口连接流程。（A）将扁平柔性电缆（FFC）夹持基板用牙科水泥固定在颅骨开窗部位附近。（B）采用视场（FoV）方法，通过立体定位将即插即用型网状电子器件注入目标脑区。（C）将针头重新定位至FFC夹持基板上方，此时网状电子探针的输入/输出（I/O）焊盘仍位于针管内部。（D）恢复液体流动，通过针头将I/O焊盘推出并沉积到FFC夹持基板上。（E）将I/O焊盘相对于主干弯曲90°，展开并使导电面朝上，随后原位干燥固定。（F）使用剪刀将FFC基板修剪至距离I/O焊盘边缘约0.5 mm处的直线，切除多余基板，以便插入32通道零插入力（ZIF）连接器。（G）将I/O焊盘插入安装在定制印刷电路板（PCB）上的32通道ZIF连接器中，并闭合ZIF连接器的锁扣以实现与I/O焊盘的电接触。（H）用牙科水泥封闭锁扣，将PCB翻转贴合至颅骨表面，并用牙科水泥固定。（I）PCB形成一个紧凑的前置放大头戴装置，配备标准放大器接口，便于记录过程中快速连接。比例尺 = 1 cm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58003/58003fig7large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="小鼠神经记录装置；小鼠头部的传感器用于检测脑部活动；神经科学研究。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58003/58003fig8.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 8"> 
图8：固定状态与自由活动状态下的记录。（A）一只雄性C57BL/6J小鼠在记录过程中被固定于束缚装置中的照片。一个32通道前置放大器PCB已插入标准放大器连接器中。（B）同一只小鼠在进行自由活动记录实验时，携带32通道前置放大器PCB的照片。比例尺 = 1 cm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58003/58003fig8large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="2个月和4个月时神经活动比较的LFP信号分析、热图和波形图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58003/58003fig9.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图9"> 
图9：代表性神经记录结果。（A）将32通道网状电子探针注射至小鼠海马体和体感皮层后获得的代表性局部场电位（LFP）热图。数据记录时小鼠在注射后2个月（上图）和4个月（下图）自由探索其笼子。LFP振幅根据右侧色标进行颜色编码。高通滤波后的迹线（黑色）显示了每个32通道频谱图上叠加的放电活动。（B）对（A）中绘制的数据进行分类后分离出的尖峰信号。在注射后2个月（上图）和4个月（下图），32个通道中的26个均检测到单细胞放电活动。每个尖峰簇上方的数字对应于（A）中的通道编号。该图改编自Fu, et al.28。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58003/58003fig9large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="脑切片成像，神经元网络；荧光显微镜；示意图，神经通路，细胞标记。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58003/58003fig10.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图10"> 
图10：代表性组织学结果。（A）示意图，展示网状电子器件在水平（中图）和矢状（下图）脑切片中的取向。（B）注射16通道网状电子器件探针一年后，10 µm厚皮层脑切片的荧光显微镜图像。该切片经NeuN免疫染色（绿色）。（C）同一脑切片经神经丝蛋白免疫染色（红色）。（D）同一脑切片经GFAP免疫染色（青色）。（E）（B）至（D）的合并图像，显示网状电子器件与组织界面，其中NeuN（绿色）、神经丝蛋白（红色）、GFAP（青色）和网状电子器件（蓝色）被标记。比例尺 = 100 µm。本图改编自Fu et al.27。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58003/58003fig10large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
补充视频 1：网格电子器件在溶液中的重复装载与注射。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58003/video1.mp4">请点击此处下载该文件。</a>

网格电子探针可无缝整合并实现大脑内稳定、长期的单神经元水平记录。本方案采用网格电子技术用于 体内 实验，包括网状电子器件的制备、装载至注射针头、立体定位注射、输入/输出接口连接、记录实验以及含有网状探针的组织病理学分析。

可植入式脑电生理探针因其能够以高时空分辨率记录神经活动，在神经科学领域具有重要价值……

该方法有助于回答神经科学领域的一些关键问题，例如衰老过程在大脑中如何表现、大脑如何发育，以及脑部疾病如何发生和发展。该技术的主要优势在于，一旦植入大脑，网状电子器件不会在胶质增生过程中引发慢性免疫反应，并且能够与周围神经组织实现无缝整合。本次实验操作将由Lieber研究组的博士研究生周涛和博士后研究员Jung Min Lee进行演示。开始实验时，将一片洁净的硅片装入热蒸发仪中，并蒸镀100纳米厚的镍层。接着，在硅片上旋涂SU-8 2000.5型负性光刻胶，转速为每分钟400转，使SU-8的厚度约为400至500纳米。随后将硅片装入掩模对准仪中，使用对应于底部网格SU-8层的光刻掩模一进行曝光。在 I 线波长下以 100 毫焦耳/平方厘米的剂量进行曝光。然后，将晶圆浸入盛有 SU-8 显影液的托盘中。轻轻搅动溶液两分钟，直至 SU-8 中的网格图案完全显影。然后，将晶圆放入盛有异丙醇的托盘中冲洗一分钟，并用气流吹干。将晶圆在热板上于180摄氏度下坚膜烘烤一小时。随后，在晶圆表面以每分钟4,000转的速度旋涂LOR 3A，获得约300纳米厚度的涂层。以4,000转/分钟的速度旋涂S1805正性光刻胶，获得约500纳米的厚度。随后将晶圆装入掩模对准仪，使用对应金属互连层及输入/输出焊盘的光刻掩模二对S1805进行曝光。在H线波长下以40毫焦耳/平方厘米的剂量曝光后，将晶圆浸入盛有CD-26光刻胶显影液的显影槽中。轻轻搅动溶液一分钟，直至金属互连图案完全形成。将晶圆放入去离子水托盘中冲洗一分钟，然后吹干。接着，先热蒸发沉积3纳米铬，再沉积80纳米金。将晶圆浸入盛有PG剥离液的平底烧杯中约三小时，直至金属层完全被 undercut，仅在网格电子器件所需的互连及输入、输出焊盘区域保留金属。重复旋涂、光刻、蒸发和剥离工艺，在电极区域留下3纳米厚的铬层和50纳米厚的铂层。随后，重复SU-8的旋涂和光刻工艺，以定义顶部的SU-8网格层。将晶圆置于50瓦的氧气等离子体中处理1分钟。随后，将晶圆浸入镍蚀刻液中约3小时，直至网状电子器件完全从硅晶圆上释放。使用巴斯德移液管将释放后的网状电子探针从镍蚀刻液转移至盛有100毫升去离子水的烧杯中。然后，将网状电子器件至少转移至新鲜的去离子水烧杯中三次，以确保充分清洗。为了将网状电子器件装入针头，将玻璃毛细管针头插入盛有网状电子器件的100毫升PBS烧杯中。将针头末端置于网状电子器件探针的输入端和输出端焊盘附近，并手动回拉注射器，将网状电子器件探针吸入针头内。在针头仍浸入生理盐水中的情况下，推动和拉动注射器活塞，以调整网状电子器件在针头内的位置。要将网状电子器件注入小鼠脑内，需使用牙科钻和立体定位仪，在颅骨的预定坐标处打开一个颅骨窗。在远离注射部位的位置打开第二个颅骨窗，用于插入不锈钢记录螺钉或导线。然后，使用牙科水泥将夹紧基板固定在颅骨上。在基板上制作一条约一毫米宽的切口，可提高后续操作中折叠步骤的可靠性。随后，使用直角末端夹具将装有含网格电子器件针头的移液器 holder 安装到立体定位仪框架上。将移液器支架的侧管出口连接至固定在注射泵上的5毫升注射器，使用长度为0.5至1米的毛细管。然后，利用立体定位仪将针尖定位在脑内目标起始位置。调整相机位置，使其显示玻璃针内网状电子探针的顶端。通过将注射泵设置为低速并按下启动键来启动流体。如果网状电子探针在针头内未移动，则缓慢增加流速。当网状电子探针开始在针头内移动时，使用立体定位仪以相同的速度回撤针头，回撤速度应以网状电子探针标记的原始位置为参考，确保与注射速度一致。继续灌注生理盐水并缓慢撤出针头，直至针头完全退出颅骨。随后停止注射泵的液体流动。在此操作步骤中，使用立体定位仪小心引导针头到达跨越间隙的平坦柔性电缆夹持基底，并通过注射泵输送溶液，以在网状电子器件互连部分产生适当的松弛。当针头到达夹持基底上方并跨过间隙后，恢复快速流速，将网状电子器件的输入和输出焊盘注入到夹持基底上。使用镊子和去离子水移液管，将输入和输出焊盘尽可能靠近第一个输入/输出焊盘处弯折至90度角。当输入和输出焊盘对齐并折叠成与网状主干呈90度角后，用轻柔流动的压缩空气原位吹干。从输入端和输出端焊盘边缘起，沿平直边缘裁剪夹紧基板，距离约为0.5至1毫米。同时，剪除夹紧基板上会妨碍插入PCB上32通道ZIF连接器的多余部分。然后，将输入端和输出端焊盘插入PCB上的ZIF连接器，并合上锁扣。使用测量电子设备测量各通道与接地螺钉之间的阻抗，以确认连接成功。若阻抗值过高，需松开ZIF连接器，调整插入位置后重新测试，直至确认连接成功。随后，用牙科水泥覆盖ZIF连接器及暴露的网状电子互连部分，以提供保护。在基底的间隙处翻转PCB，并使用水泥将PCB固定在小鼠颅骨上。对于自由活动记录，在插入前置放大器PCB并接地参考螺钉后，将小鼠从固定装置中释放。在小鼠自由活动的同时，使用数据采集系统记录所需时长的信号。图中显示的是注入小鼠海马体和体感皮层的 32 通道网状电子探针记录的代表性局部场电位热图。数据分别在注射后两个月和四个月时，小鼠自由探索笼子期间记录。局部场电位振幅根据右侧的颜色条进行颜色编码。高通滤波轨迹（黑色）显示了每个32个通道的频谱图上的尖峰活动。此处为数据分选后绘制出的分离尖峰。在注射后两个月和注射后四个月，32个通道中有26个通道均检测到单个神经元的放电活动。在进行该操作时，重要的是要记得测试输入/输出（I/O）接口，以确认与网状电子探针的电连接成功。测量阻抗有助于排查问题来源，对于识别接口或制备过程中的问题至关重要。完成该操作后，可进行组织学分析，以研究每个记录电极周围的细胞环境。与传统的刚性脑部探针不同，网状电子器件可在组织学过程中保留在组织内，从而能够精确定位电生理数据与免疫组织化学分析结果之间的对应关系。

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Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

注射器-注射用网状电子技术稳定的慢性啮齿动物电生理学

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大鼠脑内药物微量注射结合电生理记录

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用于小鼠大脑稳定单神经元记录的可注射网状电子器件

来源：Lai, J., et al. 在啮齿类动物大脑中同时进行电生理记录与抑制剂微注射。J. Vis. Exp.

抑制大鼠神经元活动及其通过电生理学检测的方法

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在啮齿类动物大脑中同步进行电生理记录与抑制剂微注射

本文展示了在人类疾病新生啮齿类动物模型中，使用无线技术实现脑电图（EEG）监测的方法。通过遥测技术，无需繁琐的连接线，从而允许动物表现出自然行为。...

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本文介绍了一种轻量化、低成本的探针植入系统，适用于啮齿类动物的慢性电生理实验，该系统在设计上优化了易用性、探针回收性、实验灵活性以及与行为学实验的兼容性。...

DREAM 植入体：一种用于固定头部及自由活动小鼠慢性电生理记录的轻量化、模块化且经济高效的植入系统

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一种经济高效且微创的自由活动小鼠多部位慢性脑电图记录方案

学习网状电子注射技术用于小鼠大脑长期稳定单神经元电生理记录。该方法通过光刻工艺制备柔性探针，实现与神经组织的无缝整合，为研究脑发育、衰老及疾病机制提供可靠工具。

可注射网状电子器件用于稳定的大鼠慢性电生理记录

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