Name: 台式固定化金属亲和层析、Polyhistidine 标记金属酶的重组与检测 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 2 s
Description: 学习利用固定化金属亲和层析技术纯化非血红素铁结合双加氧酶，并在教学实验室中完成金属酶重组与活性检测，该方法适用于本科生生物化学实验教学。

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本出版物基于美国国家科学基金会资助项目 CHE 1708237 支持下开展的工作。&#160;&#160;

1. 纯化前准备
<ol>
	<li>无细胞粗提物的制备
	<ol>
		<li>获取约 9–10 g 过表达聚组氨酸标签金属蛋白25的大肠杆菌（E. coli，BL21）细胞沉淀，置于 50 mL 圆锥形离心管中。</li>
		<li>每克细胞沉淀加入 5 mL 室温裂解/结合缓冲液（50 mM 磷酸盐，300 mM NaCl，10 mM 咪唑，pH 8），总液体体积约为 45–50 mL。定期涡旋振荡以促进溶解。若细胞沉淀为冷冻状态，需在温水浴中解冻。</li>
		<li>将细胞悬液置于冰水浴中，冷却至约 3 °C，为细胞裂解做准备。 
		注意：此时可采用超声破碎、珠磨法或其他方法进行细胞裂解。本文演示使用珠磨法，因其快速、相对经济，且无需佩戴听力保护装置。</li>
		<li>根据制造商说明组装 50 mL 珠磨室。</li>
		<li>将预先在 -20 °C 保存的 0.1 mm 玻璃珠加入珠磨室，填充至其一半体积。</li>
		<li>将冷却的细胞悬液加入珠磨室至接近满，再用 4 °C 的裂解/结合&#160;缓冲液完全充满珠磨室。</li>
		<li>使用小刮勺旋转珠磨机的轴，使细胞悬液与玻璃珠充分混合。</li>
		<li>用移液器去除大体积气泡，然后拧紧盖子。</li>
		<li>擦干珠磨室外壁可能的泄漏液体。</li>
		<li>在透明塑料夹套中加入约一杯冰块，将装满的 50 mL 珠磨室倒置放入冰块填充的夹套中，然后拧紧封闭。</li>
		<li>将带冰夹套的珠磨室牢固固定在电机上。</li>
		<li>启动珠磨机电机，以 15,800 rpm 运行 15 秒，随后静置 45 秒。重复此过程 8 次。</li>
		<li>完成 8 个循环后，将全部细胞裂解液转移至一个可承受高速离心（25,000 × g 或更高）的 50 mL 或更大离心管中。将一对平衡的离心管放入离心机，在 4 °C 下以 25,000 × g 离心 40–45 分钟，以沉淀细胞碎片和玻璃珠。 
		注意：若无适用于高速离心的 50 mL 或更大离心管，可先在 50 mL 圆锥形离心管中以 1,000–2,000 × g 离心 2–3 分钟去除玻璃珠，获得体积较小的细胞悬液（约 25 mL），再将上清液转移至适用于高速离心的小体积离心管中。</li>
		<li>离心完成后，将澄清、呈黄色的无细胞粗提物小心倾入洁净的 50 mL 圆锥形离心管中，注意避免转移任何细胞碎片。</li>
		<li>取少量无细胞粗提物样品，用于后续通过 SDS-PAGE26 分析纯化效果。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>IMAC 柱的制备
	<ol>
		<li>准备一根尺寸为 1.5 × 20 cm 的层析柱，配备下端床体支撑以防止树脂颗粒流失，带有鲁尔锁出口和同样含鲁尔锁接口的上端盖。在鲁尔锁出口处安装一个旋塞阀以控制流速。</li>
		<li>在实验台面上，将层析柱牢固地固定在铁架台上。</li>
		<li>取 4 °C 保存的镍结合的亚氨基二乙酸（Ni-NTA）树脂 50% 悬浮液（溶剂为 20% 乙醇）。</li>
		<li>轻轻摇动瓶身，使树脂均匀重悬。</li>
		<li>在室温下的实验台面上，使用刻度移液管吸取 2 mL 该悬浮液（相当于 1 mL 沉降树脂，可结合 50–60 mg 聚组氨酸标签蛋白），并将悬浮液转移至层析柱中。</li>
		<li>打开旋塞阀，依靠重力使过量的保存液从树脂中自然流出。</li>
		<li>牢固关闭旋塞阀。</li>
		<li>使用巴斯德移液管，小心地向树脂柱中加入冷却的裂解/结合缓冲液（50 mM 磷酸盐，300 mM NaCl，10 mM 咪唑，pH 8），至少 30 mL。注意不要扰动树脂表面，应沿柱壁缓慢加入缓冲液以避免溅出。</li>
		<li>通过让裂解/结合缓冲液依靠重力缓慢流经树脂并进入收集烧杯，对树脂进行平衡。</li>
		<li>当裂解/结合缓冲液基本流尽时，在树脂上方仍保留约 5 mL 缓冲液时关闭旋塞阀，停止流动。将层析柱保持直立固定状态，待后续使用或可存放长达 1 周。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 通过IMAC纯化带有多聚组氨酸标签的目标蛋白
<ol>
	<li>配制洗涤缓冲液（50 mM 磷酸盐，300 mM NaCl，20 mM 咪唑，pH 8）和洗脱缓冲液（50 mM 磷酸盐，300 mM NaCl，250 mM 咪唑，10% 甘油，pH 8）。将缓冲液置于 4°C 冷却。</li>
	<li>打开活塞，使裂解/结合缓冲液依靠重力通过 Ni-NTA 树脂自然流出，从而为向 Ni-NTA 柱中加入无细胞粗提物做好准备。当所有缓冲液完全流出且树脂表面暴露后，关闭活塞。</li>
	<li>使用巴斯德移液管，小心地将无细胞粗提物加至树脂上，注意不要扰动树脂表面。沿柱壁缓慢加入粗提物以避免飞溅。所加粗提物体积取决于多聚组氨酸标签蛋白的表达水平；确保每毫升 Ni-NTA 树脂所加载的粗提物中含有的目标蛋白总量不超过 50–60 mg（见步骤 1.2.4）。</li>
	<li>当所有粗提物均已加至柱上后，打开活塞，使液体依靠重力流出。此流出液包含未结合到树脂上的蛋白质——收集 100 μL 用于后续通过 SDS-PAGE 分析纯化效果26。</li>
	<li>无细胞粗提物的高黏度会显著减缓柱子的重力流速。为提高流速，可使用简单的“手动泵”：
	<ol>
		<li>取一支 10 mL&#160;Luer-lock 注射器，通过一段塑料管和 Luer-lock 接头将其连接至柱顶帽。拉出注射器活塞，然后将柱顶帽紧密安装在柱子顶部。</li>
		<li>在手动收集流出液至量筒中以评估流速的同时，轻柔地按压注射器活塞；每分钟 1–2 mL 的流速适用于该树脂和装置。当流速减慢时，可逐渐增加对活塞的压力。</li>
		<li>为防止空气进入树脂，当液面降至树脂床上方 5–10 mm 时，取下柱顶帽及连接的手动泵，让剩余液体依靠重力自然流出。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>当无细胞粗提物完全流出且树脂表面再次暴露后，使用巴斯德移液管小心加入约 30 mL 冷却的洗涤缓冲液至柱中——注意不要扰动树脂表面。沿柱壁缓慢加入缓冲液以避免飞溅。</li>
	<li>打开活塞，使洗涤缓冲液流经柱子。此步骤可去除弱结合的蛋白质。弃去流出液。</li>
	<li>在洗涤缓冲液流出过程中，准备十六个已标记的微量离心管，用于收集 1 mL 的洗脱组分。</li>
	<li>当洗涤缓冲液完全流出且树脂表面再次暴露后，关闭活塞。使用巴斯德移液管小心加入约 30 mL 冷却的洗脱缓冲液至柱中——注意不要扰动树脂表面。沿柱壁缓慢加入缓冲液以避免飞溅。</li>
	<li>缓慢打开活塞，使洗脱缓冲液将多聚组氨酸标签蛋白从柱上洗脱下来。将每 1 mL 洗脱液依次收集至编号为 1 至 16 的微量离心管中。</li>
	<li>使用比色法蛋白测定（如 Bradford 法）或紫外-可见光谱法检测各组分中的蛋白含量，具体操作依据试剂或仪器制造商提供的方法27,28。如图所示，使用考马斯亮蓝的比色法已缩小至 100 μL 体系，以便仅消耗每份样品少量体积。</li>
	<li>将每份组分各取 3 μL 与 100 µL 比色法蛋白检测试剂混合，肉眼观察是否显色以判断该组分中是否存在蛋白质；无需使用分光光度计进行检测。</li>
	<li>若在第 16 号组分中仍检测到蛋白质，则继续以 1 mL 为单位收集洗脱组分，并定期检测蛋白含量，直至洗脱液中不再含有显著量的蛋白质为止。</li>
	<li>将含蛋白的组分合并至一个洁净的锥形管中，并取出 100 μL 样品用于后续 SDS-PAGE 分析26。</li>
	<li>随后可进行金属离子辅因子的重建，或将蛋白分装为每份 3 mL，在 -80°C 冷冻保存。确保洗脱缓冲液中含有 10% 甘油作为冷冻保护剂，以稳定纯化后的蛋白在冷冻过程中的结构。</li>
	<li>当 Ni-NTA 柱洗脱完成后，即所有蛋白均已从柱上洗脱并收集至各组分中时，再向柱中通过 25 mL 洗脱缓冲液，然后将柱子保存于约 5 mL 洗脱缓冲液中置于 4°C 短期保存，或保存于含 20% 乙醇的裂解/结合缓冲液中以实现长期保存。</li>
</ol>
3. 目标蛋白与亚铁离子（Fe2+）的重组
<ol>
	<li>添加 Fe2+ 
	注意：一种非血红素铁（II）结合酶，例如本示例中的 L-DOPA 双加氧酶，其活性需要一个 Fe2+ 离子；然而，铁（II）容易氧化为无活性的铁（III），&#160;且部分蛋白在纯化时完全不含铁。
	<ol>
		<li>开始金属的重建时，取 3 mL 以洗脱缓冲液悬浮的纯化酶。若为冷冻样品，使用温水浴快速解冻，解冻后立即将蛋白置于冰上。</li>
		<li>根据管中蛋白的体积，计算所需抗坏血酸钠（198.1 g/mol）的量，使样品中终浓度为 12.5 mM。同时，计算所需二硫苏糖醇（DTT，154.25 g/mol）的量，使样品中终浓度也为 12.5 mM。</li>
		<li>加入固体抗坏血酸钠和 DTT，并轻柔但充分地混匀使其完全溶解。注意避免剧烈混合导致蛋白沉淀。向蛋白样品中加入少量七水合硫酸亚铁（分子量 278.01 g/mol）。</li>
		<li>为获得足够小量的铁盐，将几粒 1 mm 大小的 FeSO4•7H2O 固体轻敲至称量纸上，将纸对折包住颗粒，用金属刮刀的平面将其压碎。</li>
		<li>取少量所得粉末加入蛋白管中。</li>
		<li>涡旋混匀，管中将出现玫瑰粉色。</li>
		<li>将粉红色的蛋白溶液加盖，在冰上孵育 10–30 分钟。粉红色会随时间逐渐褪去。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>凝胶过滤
	<ol>
		<li>使用装有约 10 mL 球形聚丙烯酰胺凝胶的凝胶过滤柱，该凝胶的分子量排阻极限约为 6,000，水合颗粒粒径范围为 90–180 µm，柱规格为 1.5 × 12 cm，并配有 10 mL 储液槽。确保柱内装有上下层支撑结构，形式为 30 µm 多孔聚乙烯圆盘，以防止树脂流失并避免柱床干涸。将凝胶过滤柱固定在铁架台上。</li>
		<li>若使用预装柱，取下帽盖并倒掉上层支撑上方的多余缓冲液。</li>
		<li>为平衡柱子，首先用适合后续测定和保存的缓冲液填充储液槽，例如 pH 8.0 的 50 mM NaH2PO4、200 mM NaCl、10% 甘油缓冲液。</li>
		<li>若使用预装柱，折断柱底部尖端以启动缓冲液流动，并暴露鲁尔滑动接头。将一个旋塞接在柱的鲁尔滑动端，保持开启状态，使缓冲液依靠重力缓慢滴下。</li>
		<li>当缓冲液从柱中排尽且上层支撑暴露时，关闭旋塞，用移液器将约 3 mL 重新构建 Fe(II) 的金属酶溶液加至上层暴露的支撑表面。</li>
		<li>打开旋塞，使全部 3.0 mL 样品依靠重力进入柱中。弃去最初流出的 3 mL 洗脱液。在操作过程中形成的任何粉红色均会被截留在柱顶部。</li>
		<li>当柱停止滴液且上层支撑再次暴露时，向&#160;柱中加入 4 mL 凝胶过滤缓冲液（例如，50 mM NaH2PO4、200 mM NaCl、10% 甘油，pH 8.0）。打开旋塞，将洗脱液按八个 0.5 mL 的组分收集至微量离心管中。</li>
		<li>使用比色法蛋白测定或如前所述的 UV-Vis27,28 方法检测各组分中的蛋白。</li>
		<li>合并含蛋白的组分。</li>
		<li>取样进行 SDS-PAGE 分析26。</li>
		<li>继续进行样品的活性测定或保存。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

作者无披露信息。

尽管在重组蛋白上添加多组氨酸标签并利用固定化金属亲和层析（IMAC）进行纯化的方法已在生物化学文献中几乎无处不在3,4,5，但在生物化学教学实验中，IMAC用于酶纯化的应用仍较为有限，且已发表的方法并不总是考虑教学实验室的资源限制20。此外，当IMAC与评估酶活性和纯度的实验相结合时，在教学实验中使用IMAC的效果最佳，因此对酶进行IMAC纯化是一项理想的教学实践活动。为了将IMAC的应用拓展至教学实验室中各类酶（包括金属酶）的纯化，亟需可靠且低成本的方法。在本实验方案中，我们采用易于获取且价格低廉的实验器材，展示了可在实验台操作的IMAC方法；同时通过在纯化后重建依赖亚铁离子的金属酶——L-DOPA双加氧酶，解决了IMAC在金属蛋白应用中的局限性22。根据所述试剂与材料，我们估算每学期八个学生小组完成本方案（包括图1和图2中所述分析步骤）所需的耗材成本约为500至600美元。
由于Fe2+容易从氨基酸配体中解离，且Fe2+易被O2氧化为Fe3+24，因此将非血红素、氨基酸螯合的二价铁重新组装到重组金属酶中通常是酶纯化过程中的常规步骤。当使用经典层析方法时，在某些情况下可能避免铁的完全流失32，但更常见的是需在还原剂存在下重新添加二价铁33,34,35,36，通常还需在厌氧环境中进行37,38,39，并且在某些情况下过量的铁未被去除33,34,36，这会增加后续检测的复杂性。经典层析步骤与厌氧环境的操作对于本科生实验室而言并不现实，因此促使了本实验方案的开发。
尽管与预装柱和自动化色谱仪器相比，手动制备Ni-NTA柱并主要依靠重力流处理样品需要更多的时间和操作 effort，但这些手动步骤使学生能够亲身体验并加深对实验原理的科学理解。在本方案所述条件下加入亚铁盐（II）时，体系对过量的二硫苏糖醇（dithiothreitol）特别敏感。如果学生误加了过量的二硫苏糖醇，很可能导致沉淀产生。我们发现，要求学生在进入实验室前预先完成试剂用量的计算非常有帮助，这样可以最大限度地提高实验操作时间的利用效率。整个台式IMAC纯化过程——从细胞裂解到蛋白洗脱——可在一次4小时的实验课内完成，随后的蛋白复性和活性检测可在下一次实验课中进行。

1988年，文献中首次报道了利用固定化金属螯合多聚组氨酸标签，从宿主生物提取物中纯化带有多聚组氨酸标签蛋白的方法1,2。自那时起，在重组蛋白上添加多聚组氨酸标签，并通过固定化金属亲和层析（IMAC）进行纯化，已成为生物化学文献中几乎无处不在的技术3,4,5。IMAC纯化方法可在实验台面上实施，既可使用自动层析系统，也可采用离心柱形式。尽管亲和层析方法，尤其是IMAC，在科研实验室中被广泛使用，但在本科教学实验室中却相对少见。目前主流的生物化学实验教材通常不系统讲授这些方法，而是倾向于采用更传统的离子交换层析或染料结合层析6,7,8,9。例如，Anderson10报道的乳酸脱氢酶纯化实验采用的是染料结合亲和法；Boyer7,11报道的牛乳α-乳白蛋白纯化实验虽使用了镍-亚氨二乙酸基质，但并未引入重组多聚组氨酸标签，而是依赖蛋白自身对树脂的内在亲和力。一些现代的本科实验教材和出版物确实已将固定化金属亲和层析应用于带有多聚组氨酸标签的目标蛋白，如绿色或红色荧光蛋白12,13,14,15、抗体16以及特定酶类17,18,19,20，甚至包括一些功能未知的蛋白21。可以认为，在教学实验室中纯化酶类更具优势，因为可在后续实验中检测目标蛋白的活性，从而增强学生对&#34;真实科学&#34;的体验；事实上，已有相关类型的实验教学案例发表，并报告了对学生学习的积极影响17,18,20,21。然而，IMAC在生物化学教学实验室中用于酶纯化的应用仍然有限，已发表的方法甚至可能默认使用通常在课堂教学实验室中无法获得的层析设备20。此外，IMAC在金属蛋白上的应用也存在局限性，特别是那些结合对氧化还原敏感的二价金属且该金属对其活性至关重要的蛋白22。在纯化过程中，这类金属离子常常丢失或被氧化，导致获得的酶无活性，因而不适合本科教学实验。
近三分之一的酶会结合金属离子23，尽管几乎所有生命形式都普遍需要铁23，但在酶学中，铁离子可以说是最具问题的金属离子之一。非血红素 Fe2+ 结合酶在IMAC过程中特别容易发生金属离子的丢失和/或氧化；这可能是由于缺乏像血红素那样的专一性有机配体，以及Fe2+易于从氨基酸配体上解离所致24。此外，在水溶液中，Fe2+被氧气氧化为Fe3+的过程是自发进行的，这是由于该反应具有负的自由能变化，且Fe3+相对更稳定。通常，这些困难可通过使用厌氧环境和/或非IMAC色谱方法来克服22。本文将展示如何利用台式IMAC，使用简单且低成本的色谱材料纯化依赖Fe2+的金属酶L-DOPA双加氧酶，随后进行活性位点Fe2+的重建以及酶活性测定。这些方法已在我们本校由6至12个学生小组组成的本科生物化学实验课程中成为标准流程，可用于拓展本科阶段酶学研究的实验内容。

<table><tbody><tr><td>耗材</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BeadBeater 0.1mm 玻璃珠</td><td>BioSpec Products</td><td>11079101</td><td>每份一磅</td></tr><tr><td>50 mL 带螺帽锥形管，无菌</td><td>VWR</td><td>21008-178</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP358-1</td><td></td></tr><tr><td>磷酸二氢钾</td><td>Acros (Fisher)</td><td>AC42420-5000</td><td></td></tr><tr><td>抗坏血酸钠</td><td>Acros (Fisher)</td><td>AC35268-1000&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>DTT（二硫苏糖醇）</td><td>Lab Scientific</td><td>D-115</td><td></td></tr><tr><td>七水合硫酸亚铁</td><td>Sigmaaldrich</td><td>310077</td><td></td></tr><tr><td>HisPur NiNTA 树脂&amp;nbsp;</td><td>Fisher (pierce)</td><td>PI88221</td><td></td></tr><tr><td>Econo-Column 层析柱 - 1.5 × 20 cm</td><td>Bio-Rad</td><td>737-1522&amp;nbsp;</td><td>1.5 × 20 cm，35 mL，2 个装&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>旋塞阀，单向，雌接头至雄接头鲁尔锁</td><td>Kimble</td><td>420163-0000</td><td>50 个装</td></tr><tr><td>BD 10 mL 鲁尔锁注射器（非无菌，无针头）</td><td>VWR</td><td>301029</td><td></td></tr><tr><td>管路接头：1.6 mm 卡套式接头转雌性鲁尔接头</td><td>Biorad</td><td>7318222</td><td></td></tr><tr><td>管路接头：1.6 mm 卡套式接头转雄性鲁尔接头&amp;nbsp;</td><td>Biorad</td><td>7318225</td><td></td></tr><tr><td>硅胶管（内径 1.6 mm / 壁厚 0.8 mm，适用于蠕动泵流速 0.2–5 mL/min）</td><td>Bio-Rad</td><td>7318211</td><td>每包 1 根，内径 1.6 mm / 壁厚 0.8 mm，10 m，低压液体处理管路</td></tr><tr><td>甘油</td><td>Fisher (Pierce)</td><td>17904</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie Plus（Bradford）蛋白检测试剂</td><td>Thermo Scientitic</td><td>23236</td><td></td></tr><tr><td>微量离心管， snap-cap，1.5 mL</td><td>VWR</td><td>89000-028</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand 聚苯乙烯一次性移液管</td><td>Fisher</td><td>13-676-10F</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand 通用移液泵</td><td>Fisher&amp;nbsp;</td><td>14-955-110</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand 转移移液管</td><td>Fisher&amp;nbsp;</td><td>13-711-9AM</td><td></td></tr><tr><td>Econo-Pac 10DG 脱盐柱</td><td>Bio-Rad</td><td>732-2010</td><td>30 根装</td></tr><tr><td>ExpressPlus PAGE 5× 上样缓冲液</td><td>Genscript</td><td>MB01015</td><td>5 mL（与样品按 1:5 稀释）</td></tr><tr><td>ExpressPlus PAGE 凝胶，4–20%，12 孔</td><td>Genscript</td><td>M42012</td><td>20 块凝胶</td></tr><tr><td>Fisherbrand 一次性比色皿，甲基丙烯酸甲酯</td><td>Fisher</td><td>14-955-128&amp;nbsp;</td><td>500 个装</td></tr><tr><td>方形一次性比色皿盖</td><td>Fisher</td><td>14-385-999</td><td></td></tr><tr><td>L-DOPA（3,4-二羟基苯丙氨酸）</td><td>Acros</td><td>D9628-5G</td><td></td></tr><tr><td>永久性设备：&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BeadBeater 50 mL 研磨腔&amp;nbsp;</td><td>BioSpec Products</td><td>110803-50SS</td><td>1 个腔体</td></tr><tr><td>BeadBeater 均质器</td><td>BioSpec Products</td><td>1107900-101</td><td>350 mL 聚碳酸酯腔体、转子组件、电机底座、冰水冷却套及一磅玻璃珠</td></tr><tr><td>高速 PPCO 离心管，50 mL</td><td>Fisher</td><td>3119-0050PK</td><td></td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN Tetra 垂直电泳槽（用于小型预制胶），4 块胶</td><td>Bio-Rad</td><td>1658004</td><td>&amp;nbsp;4 块胶垂直电泳系统，包含电极组件、配套运行模块、电泳槽、带电源线的盖子、小型电泳槽缓冲液挡板</td></tr><tr><td>PowerPac HC 电源</td><td>Bio-Rad</td><td>1645052</td><td>100&amp;ndash;120/220&amp;ndash;240 V，适用于高电流应用的电源，含电源线</td></tr><tr><td>UV-1800 紫外分光光度计，配备 UV-Probe 软件</td><td>Shimadzu</td><td>UV-1800</td><td></td></tr><tr><td>Kintek Global Kinetic Explorer</td><td>Kintek Corp</td><td>version 6</td><td>https://www.kintekexplorer.com/downloads/</td></tr></tbody></table>

台式固定化金属亲和层析、重组及多组氨酸标签金属酶的本科生实验测定

Benchtop Immobilized Metal Affinity Chromatography, Reconstitution and Assay of a Polyhistidine Tagged Metalloenzyme for the Undergraduate Laboratory

固定化金属亲和层析（IMAC）是一种在台式条件下纯化聚组氨酸标签蛋白的常用技术，本科生易于掌握，已成为现代文献中最广泛使用的蛋白质纯化方法。然而，亲和层析在金属结合蛋白中的应用，尤其是对铁等氧化还原敏感性金属的蛋白，通常仅限于具备手套箱的实验室——而这类设备在本科教学实验室中并不常见。本文介绍了我们在台式条件下分离、纯化聚组氨酸标签的氧化还原活性非血红素铁结合外双加氧酶，并进行金属离子再结合的方法，以及在不同底物浓度和饱和氧条件下对该双加氧酶活性的检测方法。这些方法由本科生操作，已在主要面向本科生的教学与研究实验室中实施，所用仪器设备在本科院校中易于获取且成本可控。

这些代表性结果由本科生在穆伦贝格学院 BCM 341：实验生物化学课程的两次实验课期间，按照本实验方案操作而获得。图1 展示了两名本科生在4小时的课堂实验中纯化一种20 kDa的多聚组氨酸标签金属酶——L-DOPA双加氧酶的结果，随后由同一批学生通过SDS-PAGE进行分析。多聚组氨酸标签蛋白得到了有效纯化（图1，第2道）。使用抗多聚组氨酸标签抗体对凝胶进行免疫印迹检测表明，少量目标蛋白在穿流液中丢失（数据未显示），可能是因为裂解液中目标蛋白含量超过100 mg，超出了树脂的结合能力。
图2展示了学生根据本方案所述方法，对带有聚组氨酸标签的金属酶靶标L-DOPA双加氧酶在用亚铁（II）重建并进行后续凝胶过滤后，所收集到的酶促反应活性数据。数据采集开始前的5秒死时间是学生首次执行该技术时的典型情况。采用已发表的检测方法检测到该金属酶具有较强的酶活性，并获得了与已发表结果一致的稳态动力学参数29。稳态动力学参数通过拟合图2中所示的反应进程曲线30确定；然而，也可通过对一系列底物浓度下测得的初始速率进行非线性最小二乘法拟合来确定参数31。
<img alt="蛋白质电泳结果、分子量标记物、条带分离、实验、凝胶图谱。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58012/58012fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图1"> 
图1. 多聚组氨酸标签蛋白在纯化前、纯化过程中及纯化后的SDS-PAGE26分析。泳道1：分子量标记物；泳道2：Ni-NTA纯化后的纯化蛋白（20 kDa）；泳道3：Ni-NTA流穿组分；泳道4：纯化前的无细胞粗提物；泳道5：裂解后的细胞碎片沉淀。样品使用5×上样缓冲液制备，并在预制的4–20%聚丙烯酰胺凝胶上通过凝胶电泳系统进行分离。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58012/58012fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="在414 nm处的瞬态吸收光谱图，显示80秒内的吸收变化。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58012/58012fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图2"> 
图2. 亚铁（II）重建金属酶的稳态测定即， L-DOPA 双加氧酶， 10µM）与底物（L-DOPA - 5 µM （红色）， 25 µM （绿色）， 50 µM （蓝色）溶于缓冲液（50 mM 磷酸盐，200 mM NaCl，pH 8）中。 曲线显示在414 nm处产物的生成情况。使用1 mL甲基丙烯酸酯比色皿，在分光束扫描紫外-可见分光光度计中连续采集吸光度数据。29原始数据拟合至米氏-门顿稳态近似模型（KM 30.8 µM ± 14.4, k猫表观的 2.3 s-1 ± 0.05)30. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58012/58012fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>

本文介绍了一种适用于本科教学实验室的台式固定化金属亲和层析纯化方法，以及随后对带有聚组氨酸标签的非血红素铁结合双加氧酶进行复性的实验方案。

台式固定化金属亲和层析（IMAC）技术用于纯化带有多聚组氨酸标签的蛋白质，本科生易于掌握，现已成为……

该方法可使本科生在教学实验室条件下，快速纯化铁结合金属酶，并利用所得蛋白质回答有关其结构与功能的关键问题。该技术的主要优势在于适用于非血红素铁结合酶。该方法对本科生而言易于掌握，且可方便地在教学实验室中实施。开始此实验步骤时，取一根尺寸为1.5厘米×20厘米的层析柱，该柱应配备带有鲁尔锁出口、也含有鲁尔锁接头的上端盖，以及用于固定树脂颗粒的下层支撑床。将下端鲁尔锁接头连接一个旋塞阀以控制流速。接着，取一个瓶子，其中装有先前在4°C下保存的、悬浮于20%乙醇中的50%镍结合氮川三乙酸树脂浆液。轻轻旋转瓶子，使树脂均匀重悬。在室温下操作，使用刻度移液管吸取两毫升浆液，并转移至层析柱中。待过量的保存溶液从树脂中排出后，使用巴斯德移液管小心加入至少30毫升预冷的裂解结合缓冲液，注意不要扰动树脂表面。让缓冲液沿柱壁流下，以防止溅出。通过重力作用使缓冲液缓慢从柱中流入收集烧杯，以平衡树脂。首先，打开活塞，使残留的裂解结合缓冲液在重力作用下流经镍-NTA树脂，从而为加入无细胞粗提物做好镍-NTA柱的准备。当缓冲液完全流尽且树脂表面暴露时，关闭活塞。接下来，使用巴斯德移液管小心地将无细胞粗提物加到树脂上，注意不要扰动树脂表面。让粗提物流沿柱壁流下，以避免产生溅射。将所有粗提物转移至层析柱后，打开活塞，使液体依靠重力自然流出。收集100 µL穿流液，用于后续分析。使用一段短塑料管将10 mL鲁尔锁型注射器连接至层析柱的柱帽。拉出注射器活塞，然后将柱子顶端的柱帽紧密地安装到柱子顶部。在收集洗脱液至量筒中的同时，轻轻下压活塞，以手动评估流速。每分钟1至2毫升的流速与树脂及实验装置相容。随着流速减慢，轻轻增加注射器活塞的压缩力度。当所加液体的弯月面降至距离树脂床上方5至10毫升时，取下柱帽及连接的手动泵，以防止空气进入树脂。让剩余液体依靠重力自然排尽。当粗提物完全流尽且树脂表面再次暴露后，使用巴斯德移液管小心向层析柱中加入约30毫升预冷的洗涤缓冲液，注意不要扰动树脂表面。打开旋塞，使洗涤缓冲液流经层析柱。在层析柱流尽的同时，标记16个微量离心管用于收集洗脱组分。当缓冲液完全流尽且树脂表面再次暴露时，关闭活塞。使用巴斯德移液管，小心地向柱中加入约 30 毫升预冷的洗脱缓冲液，注意不要扰动树脂表面。然后，缓慢打开活塞，使洗脱缓冲液将带有多聚组氨酸标签的蛋白从柱中洗脱下来。在每个已标记的微量离心管中收集一毫升洗脱液。检测蛋白质后，将含有蛋白质的组分合并至一个洁净的锥形管中。随后进行金属离子辅因子的再构建，或将蛋白质以三毫升分装于-80摄氏度冷冻保存。开始金属的重建时，将三毫升溶于洗脱缓冲液中的纯化酶溶液置于冰上。根据试管中蛋白质的体积，计算所需抗坏血酸钠和二硫苏糖醇的量，使每种物质在样品中的终浓度均为12.5毫摩尔。加入固体抗坏血酸钠和二硫苏糖醇，并轻轻但充分混匀，使其完全溶解。取几粒一毫升的固体七水合硫酸亚铁颗粒，置于称量纸上。将纸折叠包住颗粒，用金属刮刀的平面将其碾碎。取少量所得粉末加入含有蛋白质溶液的试管中。涡旋混匀，溶液呈现粉红色。盖上管盖，将粉红色溶液置于冰上孵育10至30分钟。粉红色会随时间逐渐褪去。进行凝胶过滤时，使用装有10毫升球形聚丙烯酰胺凝胶的凝胶过滤柱，柱尺寸为1.5厘米×12厘米，并配备10毫升储液槽。然后按照文本方案中所述步骤平衡色谱柱。当缓冲液流尽且上层床面支撑材料暴露时，关闭旋塞。用移液器将3 mL铁(II)重建金属酶溶液加到暴露的上层床支撑上。打开活塞，让全部3 mL样品依靠重力进入层析柱。弃去前3 mL的洗脱液。在处理溶液过程中若产生任何粉红色，该颜色将被截留在柱子的顶部。当柱子停止滴液且上层床体支撑层暴露时，加入四毫升凝胶过滤缓冲液，并收集8.5毫升洗脱组分中的四毫升洗脱液。合并含有蛋白质的组分后，按照文本方案中所述进行样品的检测或储存。在本研究中，学生纯化并随后重建了一种带有聚组氨酸标签的非血红素铁结合双加氧酶。SDS-PAGE 分析显示，该带标签蛋白得到了有效纯化。此处展示了学生在用二价铁重建纯化的 L-多巴双加氧酶并进行后续凝胶过滤后，所收集的酶活性数据。数据采集开始前出现五秒延迟，这在学生首次执行该技术时较为常见。稳态实验表明，通过拟合反应进程曲线所确定的动力学参数与已发表的结果一致。在进行该实验操作时，需注意并非铁含量越多越好，过量的铁会导致蛋白质沉淀。蛋白的三至五倍摩尔过量的铁浓度已足够。通过此方法，学生可开展进一步实验，以测定溶液结构，观察酶或底物依赖性化学反应，从而回答有关反应机理的更多问题。

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