台式固定化金属亲和层析、重组及多组氨酸标签金属酶的本科生实验测定

该方法可使本科生在教学实验室条件下，快速纯化铁结合金属酶，并利用所得蛋白质回答有关其结构与功能的关键问题。该技术的主要优势在于适用于非血红素铁结合酶。该方法对本科生而言易于掌握，且可方便地在教学实验室中实施。

开始此实验步骤时，取一根尺寸为1.5厘米×20厘米的层析柱，该柱应配备带有鲁尔锁出口、也含有鲁尔锁接头的上端盖，以及用于固定树脂颗粒的下层支撑床。将下端鲁尔锁接头连接一个旋塞阀以控制流速。接着，取一个瓶子，其中装有先前在4°C下保存的、悬浮于20%乙醇中的50%镍结合氮川三乙酸树脂浆液。

轻轻旋转瓶子，使树脂均匀重悬。在室温下操作，使用刻度移液管吸取两毫升浆液，并转移至层析柱中。待过量的保存溶液从树脂中排出后，使用巴斯德移液管小心加入至少30毫升预冷的裂解结合缓冲液，注意不要扰动树脂表面。

让缓冲液沿柱壁流下，以防止溅出。通过重力作用使缓冲液缓慢从柱中流入收集烧杯，以平衡树脂。首先，打开活塞，使残留的裂解结合缓冲液在重力作用下流经镍-NTA树脂，从而为加入无细胞粗提物做好镍-NTA柱的准备。

当缓冲液完全流尽且树脂表面暴露时，关闭活塞。接下来，使用巴斯德移液管小心地将无细胞粗提物加到树脂上，注意不要扰动树脂表面。让粗提物流沿柱壁流下，以避免产生溅射。

将所有粗提物转移至层析柱后，打开活塞，使液体依靠重力自然流出。收集100 µL穿流液，用于后续分析。使用一段短塑料管将10 mL鲁尔锁型注射器连接至层析柱的柱帽。

拉出注射器活塞，然后将柱子顶端的柱帽紧密地安装到柱子顶部。在收集洗脱液至量筒中的同时，轻轻下压活塞，以手动评估流速。每分钟1至2毫升的流速与树脂及实验装置相容。

随着流速减慢，轻轻增加注射器活塞的压缩力度。当所加液体的弯月面降至距离树脂床上方5至10毫升时，取下柱帽及连接的手动泵，以防止空气进入树脂。让剩余液体依靠重力自然排尽。

当粗提物完全流尽且树脂表面再次暴露后，使用巴斯德移液管小心向层析柱中加入约30毫升预冷的洗涤缓冲液，注意不要扰动树脂表面。打开旋塞，使洗涤缓冲液流经层析柱。在层析柱流尽的同时，标记16个微量离心管用于收集洗脱组分。

当缓冲液完全流尽且树脂表面再次暴露时，关闭活塞。使用巴斯德移液管，小心地向柱中加入约 30 毫升预冷的洗脱缓冲液，注意不要扰动树脂表面。然后，缓慢打开活塞，使洗脱缓冲液将带有多聚组氨酸标签的蛋白从柱中洗脱下来。

在每个已标记的微量离心管中收集一毫升洗脱液。检测蛋白质后，将含有蛋白质的组分合并至一个洁净的锥形管中。随后进行金属离子辅因子的再构建，或将蛋白质以三毫升分装于-80摄氏度冷冻保存。

开始金属的重建时，将三毫升溶于洗脱缓冲液中的纯化酶溶液置于冰上。根据试管中蛋白质的体积，计算所需抗坏血酸钠和二硫苏糖醇的量，使每种物质在样品中的终浓度均为12.5毫摩尔。加入固体抗坏血酸钠和二硫苏糖醇，并轻轻但充分混匀，使其完全溶解。

取几粒一毫升的固体七水合硫酸亚铁颗粒，置于称量纸上。将纸折叠包住颗粒，用金属刮刀的平面将其碾碎。取少量所得粉末加入含有蛋白质溶液的试管中。

涡旋混匀，溶液呈现粉红色。盖上管盖，将粉红色溶液置于冰上孵育10至30分钟。粉红色会随时间逐渐褪去。

进行凝胶过滤时，使用装有10毫升球形聚丙烯酰胺凝胶的凝胶过滤柱，柱尺寸为1.5厘米×12厘米，并配备10毫升储液槽。然后按照文本方案中所述步骤平衡色谱柱。当缓冲液流尽且上层床面支撑材料暴露时，关闭旋塞。

用移液器将3 mL铁(II)重建金属酶溶液加到暴露的上层床支撑上。打开活塞，让全部3 mL样品依靠重力进入层析柱。弃去前3 mL的洗脱液。

在处理溶液过程中若产生任何粉红色，该颜色将被截留在柱子的顶部。当柱子停止滴液且上层床体支撑层暴露时，加入四毫升凝胶过滤缓冲液，并收集8.5毫升洗脱组分中的四毫升洗脱液。合并含有蛋白质的组分后，按照文本方案中所述进行样品的检测或储存。

在本研究中，学生纯化并随后重建了一种带有聚组氨酸标签的非血红素铁结合双加氧酶。SDS-PAGE 分析显示，该带标签蛋白得到了有效纯化。此处展示了学生在用二价铁重建纯化的 L-多巴双加氧酶并进行后续凝胶过滤后，所收集的酶活性数据。

数据采集开始前出现五秒延迟，这在学生首次执行该技术时较为常见。稳态实验表明，通过拟合反应进程曲线所确定的动力学参数与已发表的结果一致。在进行该实验操作时，需注意并非铁含量越多越好，过量的铁会导致蛋白质沉淀。

蛋白的三至五倍摩尔过量的铁浓度已足够。通过此方法，学生可开展进一步实验，以测定溶液结构，观察酶或底物依赖性化学反应，从而回答有关反应机理的更多问题。