Name: 用于下一代测序的近全长 HIV-1 Proviruses 的扩增 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 18 s
Description: 学习使用FLIPS方法从单个HIV-1感染细胞中扩增近全长前病毒并进行下一代测序。该技术可识别具有复制能力的完整前病毒，助力研究潜伏病毒库特征及开发治疗策略。

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本研究得到了寻找艾滋病治愈方法的戴兰尼艾滋病研究企业（Delaney AIDS Research Enterprise, DARE）（项目编号：1U19AI096109 和 1UM1AI126611-01）；美国艾滋病研究基金会（amfAR）艾滋病根除研究联盟（ARCHE）协作研究资助（amfAR 108074-50-RGRL）；澳大利亚艾滋病和肝炎病毒学研究中心（ACH2）；加州大学旧金山分校-全球传染病与疫苗研究所（UCSF-GIVI）艾滋病研究中心（P30 AI027763）；以及澳大利亚国家卫生与医学研究理事会（AAP1061681）的支持。我们衷心感谢西米德医学研究所基因组学设施经理Joey Lai博士在文库构建方面的培训及其设施的使用支持，并感谢新南威尔士大学拉马乔蒂基因组学中心（澳大利亚悉尼）完成测序工作。我们怀着感激之情感谢为本研究捐赠样本的各位参与者。

<ol><li>Bruner, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defective+proviruses+rapidly+accumulate+during+acute+HIV-1+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Defective proviruses rapidly accumulate during acute HIV-1 infection.</a> Nature Medicine. 22 (9), 1043-1049 (2016).</li>
<li>Hiener, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Genetically+Intact+HIV-1+Proviruses+in+Specific+CD4%28%2B%29+T+Cells+from+Effectively+Treated+Participants%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Identification of Genetically Intact HIV-1 Proviruses in Specific CD4(+) T Cells from Effectively Treated Participants.</a> Cell Reports. 21 (3), 813-822 (2017).</li>
<li>Abram, M. E., Ferris, A. L., Shao, W., Alvord, W. G., Hughes, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nature%2C+position%2C+and+frequency+of+mutations+made+in+a+single+cycle+of+HIV-1+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Nature, position, and frequency of mutations made in a single cycle of HIV-1 replication.</a> Journal of Virology. 84 (19), 9864-9878 (2010).</li>
<li>Ho, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication-competent+noninduced+proviruses+in+the+latent+reservoir+increase+barrier+to+HIV-1+cure%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Replication-competent noninduced proviruses in the latent reservoir increase barrier to HIV-1 cure.</a> Cell. 155 (3), 540-551 (2013).</li>
<li>Harris, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+deamination+mediates+innate+immunity+to+retroviral+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">DNA deamination mediates innate immunity to retroviral infection.</a> Cell. 113 (6), 803-809 (2003).</li>
<li>Lecossier, D., Bouchonnet, F., Clavel, F., Hance, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypermutation+of+HIV-1+DNA+in+the+absence+of+the+Vif+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Hypermutation of HIV-1 DNA in the absence of the Vif protein.</a> Science. 300 (5622), 1112(2003).</li>
<li>Chun, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rebound+of+plasma+viremia+following+cessation+of+antiretroviral+therapy+despite+profoundly+low+levels+of+HIV+reservoir%3A+implications+for+eradication%5BTitle%5D)+AND+%22AIDS%22%5BJournal%5D)">Rebound of plasma viremia following cessation of antiretroviral therapy despite profoundly low levels of HIV reservoir: implications for eradication.</a> AIDS. 24 (18), 2803-2808 (2010).</li>
<li>Chomont, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV+reservoir+size+and+persistence+are+driven+by+T+cell+survival+and+homeostatic+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">HIV reservoir size and persistence are driven by T cell survival and homeostatic proliferation.</a> Nature Medicine. 15 (8), 893-900 (2009).</li>
<li>Soriano-Sarabia, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitation+of+replication-competent+HIV-1+in+populations+of+resting+CD4%2B+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Quantitation of replication-competent HIV-1 in populations of resting CD4+ T cells.</a> Journal of Virology. 88 (24), 14070-14077 (2014).</li>
<li>Josefsson, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+HIV-1+reservoir+in+eight+patients+on+long-term+suppressive+antiretroviral+therapy+is+stable+with+few+genetic+changes+over+time%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+USA%22%5BJournal%5D)">The HIV-1 reservoir in eight patients on long-term suppressive antiretroviral therapy is stable with few genetic changes over time.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 110 (51), E4987-E4996 (2013).</li>
<li>Evering, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Absence+of+HIV-1+evolution+in+the+gut-associated+lymphoid+tissue+from+patients+on+combination+antiviral+therapy+initiated+during+primary+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Public+Library+of+Science+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Absence of HIV-1 evolution in the gut-associated lymphoid tissue from patients on combination antiviral therapy initiated during primary infection.</a> Public Library of Science Pathogens. 8 (2), e1002506(2012).</li>
<li>von Stockenstrom, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Longitudinal+Genetic+Characterization+Reveals+That+Cell+Proliferation+Maintains+a+Persistent+HIV+Type+1+DNA+Pool+During+Effective+HIV+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Longitudinal Genetic Characterization Reveals That Cell Proliferation Maintains a Persistent HIV Type 1 DNA Pool During Effective HIV Therapy.</a> Journal of Infectious Diseases. 212 (4), 596-607 (2015).</li>
<li>Palmer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple%2C+linked+human+immunodeficiency+virus+type+1+drug+resistance+mutations+in+treatment-experienced+patients+are+missed+by+standard+genotype+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Multiple, linked human immunodeficiency virus type 1 drug resistance mutations in treatment-experienced patients are missed by standard genotype analysis.</a> Journal of Clinical Microbiology. 43 (1), 406-413 (2005).</li>
<li>Qiagen. CLC Genomics Version 10. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.qiagenbioinformatics.com/products/clc-genomics-workbench ">https://www.qiagenbioinformatics.com/products/clc-genomics-workbench </a> (2018).</li>
<li>Andrews, S. FastQC: a quality control tool for high throughput sequence data. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/">https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/</a> (2010).</li>
<li>Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trimmomatic%3A+a+flexible+trimmer+for+Illumina+sequence+data%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data.</a> Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).</li>
<li>Martin, M. <a target="_blank" href="http://journal.embnet.org/index.php/embnetjournal/article/view/200">Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads.</a> EMBnet.journal. 17 (1), (2011).</li>
<li>Magoc, T., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FLASH%3A+fast+length+adjustment+of+short+reads+to+improve+genome+assemblies%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">FLASH: fast length adjustment of short reads to improve genome assemblies.</a> Bioinformatics. 27 (21), 2957-2963 (2011).</li>
<li>Langmead, B., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+gapped-read+alignment+with+Bowtie+2%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fast gapped-read alignment with Bowtie 2.</a> Nature Methods. 9 (4), 357-359 (2012).</li>
<li>Bankevich, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SPAdes%3A+a+new+genome+assembly+algorithm+and+its+applications+to+single-cell+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Computational+Biology%22%5BJournal%5D)">SPAdes: a new genome assembly algorithm and its applications to single-cell sequencing.</a> Journal of Computational Biology. 19 (5), 455-477 (2012).</li>
<li>Kumar, S., Stecher, G., Tamura, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MEGA7%3A+Molecular+Evolutionary+Genetics+Analysis+Version+7.0+for+Bigger+Datasets%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+and+Evolution%22%5BJournal%5D)">MEGA7: Molecular Evolutionary Genetics Analysis Version 7.0 for Bigger Datasets.</a> Molecular Biology and Evolution. 33 (7), 1870-1874 (2016).</li>
<li>Katoh, K., Standley, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MAFFT+multiple+sequence+alignment+software+version+7%3A+improvements+in+performance+and+usability%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+and+Evolution%22%5BJournal%5D)">MAFFT multiple sequence alignment software version 7: improvements in performance and usability.</a> Molecular Biology and Evolution. 30 (4), 772-780 (2013).</li>
<li>Laboratory, L. A. N. HIV Sequence Database - Gene Cutter tool. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.hiv.lanl.gov/content/sequence/GENE_CUTTER/cutter.html ">https://www.hiv.lanl.gov/content/sequence/GENE_CUTTER/cutter.html </a> (2018).</li>
<li>Foster, J. L., Garcia, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+Nef+in+HIV-1+replication+and+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Role of Nef in HIV-1 replication and pathogenesis.</a> Advances in Pharmacology. 55, 389-409 (2007).</li>
<li>Laboratory, L. A. N. HIV Sequence Database - Consensus Maker tool. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.hiv.lanl.gov/content/sequence/CONSENSUS/consensus.html">https://www.hiv.lanl.gov/content/sequence/CONSENSUS/consensus.html</a> (2018).</li>
<li>Laboratory, L. A. N. HIV Sequence Database - Hypermut tool. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.hiv.lanl.gov/content/sequence/HYPERMUT/hypermut.html">https://www.hiv.lanl.gov/content/sequence/HYPERMUT/hypermut.html</a> (2018).</li>
<li>Yu, G., Smith, D. K., Zhu, H., Guan, Y., Lam, T. T. Y. <a target="_blank" href="https://besjournals.onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1111/2041-210X.12628">ggtree: an r package for visualization and annotation of phylogenetic trees with their covariates and other associated data.</a> Methods in Ecology and Evolution. , (2016).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

FLIPS 检测是一种高效且高通量的方法，用于扩增和测序单个接近全长的 HIV-1 前病毒。已确定该实验方案中多个影响所获得序列数量和质量的因素及关键步骤。首先，细胞数量以及细胞群体中 HIV-1 的感染频率会影响扩增出的前病毒数量。例如，在之前的一项研究中，从相同数量的初始型 CD4+ T 细胞中获得的序列数量大约仅为效应记忆型 CD4+ T 细胞的一半。这是因为初始型细胞的感染频率通常低于效应记忆型细胞2。其次，与基于柱子的提取方法相比，细胞裂解法更适用于基因组 DNA 的提取，因为该方法在提取过程中不存在 DNA 丢失的风险。最后，与所有基于 PCR 的检测一样，防止污染至关重要。应划分独立的洁净区域，分别用于配制预混液、处理基因组 DNA、添加阳性对照、DNA 纯化与定量以及文库制备。这对于本研究中所述的单拷贝检测尤为重要。
实施FLIPS检测时，应首先使用阳性对照（如pNL4-3质粒），而非受试者样本。这可在使用HIV-1阳性细胞前进行必要的故障排查，因为所获得的序列可与这些质粒的已知参考序列进行比对。当使用HIV-1阳性细胞时，若扩增出的前病毒极少或未扩增出，需考虑HIV-1亚型（FLIPS所设计的引物特异性针对B亚型）以及细胞群体的感染频率。可根据需要对引物序列进行修改或重新设计，以适配其他亚型。此外，每次进行PCR时，均应设置包含阳性对照的反应孔。
FLIPS 克服了先前测序检测方法（包括 SPS）的局限性。通过扩增并测序接近全长的 HIV-1 前病毒，FLIPS 能够确定 HIV-1 前病毒潜在的复制能力。而 SPS 仅能测序基因组的部分区域，因此倾向于选择具有完整引物结合位点的序列，无法实现这一目标。此外，与以往全长测序方法所采用的多种扩增和测序引物策略相比，FLIPS 克服了由此带来的局限性1,4。FLIPS 通过针对 HIV-1 LTR 区域进行两轮 PCR 扩增，并结合高通量测序（NGS），减少了所需引物的数量和复杂性。因此，FLIPS 对引物错配所导致的问题具有更强的抗性，例如错误地将缺陷型前病毒识别为完整型，或无法扩增群体中的某些前病毒。此外，FLIPS 实验方案效率更高，相较于以往方法可实现更高的测序通量。
显然，FLIPS 相较于现有的确定 HIV-1 前病毒遗传组成的方法具有优势。然而，必须认识到 FLIPS 的局限性。首先，FLIPS 检测尚未被开发用于测量潜伏性 HIV-1 储存库的大小，因为尚未完成用于确定 FLIPS 是否能够扩增细胞群体中所有存在的 HIV-1 前病毒的分析。FLIPS 更适用于在不同细胞群体之间对储存库组成的相对比较2。其次，在缺乏诸如 Ho et al.4 所进行的 in vivo 分析的情况下，无法确切判断完整 HIV-1 前病毒的复制能力。第三，FLIPS 并未设计用于确定 HIV-1 前病毒的整合位点。
对FLIPS方案进行微小调整可扩大其应用范围。例如，改变引物序列可实现对不同及多种HIV-1亚型的扩增与测序。通过在巢式PCR之前增加cDNA合成步骤，可对血浆中的HIV-1病毒颗粒进行测序。未来采用单分子测序技术将无需进行从头组装（de novo assembly）。
整合的HIV-1前病毒的基因测序加深了我们对潜伏HIV-1储存库的理解。FLIPS是未来阐明潜伏储存库组成与分布研究中的重要工具。然而，FLIPS的应用不仅限于储存库研究。未来的研究可利用FLIPS确定CRISPR-Cas技术的特定靶点，或协助识别使病毒对潜伏逆转剂更敏感的编码区与非编码区。通过分析大段内部缺失的连接位点，可更深入地理解病毒重组机制。

对长期接受抗逆转录病毒治疗（ART）个体中持续存在的潜伏性HIV-1储存库进行遗传学表征，对于理解整合前病毒的特性至关重要；研究发现，大多数整合的前病毒存在缺陷且不具备复制能力1,2。在逆转录过程中，错误会被引入整合的前病毒序列中。导致前病毒序列缺陷的机制包括易出错的HIV-1逆转录酶3、模板转换4和/或APOBEC介导的超突变5,6。最近两项研究发现，从长期接受ART的个体中分离出的HIV-1前病毒中，约有5%在基因结构上是完整的，可能具有复制能力，并可在停用ART后导致血浆HIV-1水平迅速反弹1,2,7。既往研究已证实，具有复制能力的HIV-1前病毒可在初始型和静息记忆型CD4+ T细胞亚群（包括中央记忆、过渡记忆和效应记忆T细胞）中长期存在，提示在未来的根除策略中靶向这些细胞的重要性2,8,9。
通过利用单原病毒测序（SPS）方法对 HIV-1 基因组的亚基因组区域进行遗传学表征，研究人员早期获得了关于潜伏性 HIV-1 储库分布、动态变化及维持机制的重要认识10,11,12,13。SPS 是一种多功能工具，能够从单个感染细胞中对单个 HIV-1 原病毒进行测序。然而，由于 SPS 仅测序亚基因组区域，且会遗漏引物结合位点内含有大片段缺失的原病毒，因此无法确定原病毒的复制能力。先前一项研究显示，SPS 通过选择性地测序完整的亚基因组区域，使复制能力型储库的估计值被高估了 13 至 17 倍2。
为解决SPS的局限性，Ho et al.4 和 Bruner et al.1 开发了可测序接近全长HIV-1前病毒的检测方法。这使得研究人员能够确定长期接受抗逆转录病毒治疗（ART）个体体内基因组完整且可能具有复制能力的HIV-1前病毒的频率。这些检测方法通过扩增并测序（采用Sanger测序）前病毒的亚基因组区域，再将这些序列拼接，以获得完整（完整或缺陷型）HIV-1前病毒序列。该方法存在三个局限性：1）使用多个测序引物会增加无意中将序列缺陷引入前病毒序列的风险；2）引物不匹配可能导致某些前病毒无法扩增；3）由于这些方法的技术复杂性，往往难以获得完整的前病毒序列。
为了克服现有全长 HIV-1 前病毒测序检测方法的局限性，我们开发了全长个体前病毒序列（FLIPS）检测法。FLIPS 是一种基于高通量测序（NGS）的技术，能够以高通量且高效的方式扩增并测序接近全长的（完整或缺陷型）HIV-1 前病毒。与以往的检测方法相比，FLIPS 具有优势，因为它减少了所用引物的数量，从而降低了引物错配的可能性，避免了因错配而遗漏部分前病毒群体或在病毒序列中无意引入假性缺陷。此外，FLIPS 的技术难度也低于以往方法，主要包括六个步骤：1）裂解 HIV-1 感染细胞；2）通过巢式 PCR 在极限稀释条件下扩增单个 HIV-1 前病毒，所用引物特异性针对高度保守的 HIV-1 5' 和 3' U5 LTR 区域（图 1A）；3）纯化并定量扩增产物；4）为 NGS 构建扩增后前病毒的文库；5）进行 NGS 测序；6）对测序获得的前病毒序列进行de novo 组装，以获得每个个体前病毒的重叠群序列（contig）。
FLIPS 生成的序列可经过严格的筛选流程，以鉴定出基因组完整且可能具有复制能力的序列（图 1C）2。基因组完整的前病毒缺乏所有已知会导致复制缺陷型前病毒产生的缺陷，这些缺陷包括：序列倒位、大片段内部缺失、超突变/有害终止密码子、移码突变，或 5' 包装信号及主要剪接供体（MSD）位点的突变。
<img alt="HIV前病毒分析图表，PCR定位，稀释测定，突变检测流程图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58016/58016fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图1"> 
图1：全长单个前病毒测序（FLIPS）检测中的关键步骤。（A）HIV-1 DNA基因组，其5'和3' U5 LTR区域含有FLIPS所用的引物结合位点，通过巢式PCR扩增接近全长的（缺陷型和完整型）HIV-1前病毒。（B）96孔PCR板的布局，包含80个样本孔（每个稀释度20孔）、4个阴性对照孔和1个阳性对照孔。（C）用于鉴定基因组完整且可能具有复制能力的HIV-1前病毒的排除流程。本图经Hiener et al.2. 修改。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58016/58016fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>

<table><tbody><tr><td>UltraPure 1 M Tris-HCl，pH 8.0</td><td>Invitrogen</td><td>15568025</td><td>稀释至 5 mM 用于巢式 PCR</td></tr><tr><td>Nonidet P-40 替代溶液</td><td>Sigma</td><td>98379</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma</td><td>P9416</td><td></td></tr><tr><td>蛋白酶 K 溶液（20 mg/mL）</td><td>Promega</td><td>AM2548</td><td></td></tr><tr><td>96 孔 PCR 仪</td><td></td><td></td><td>任何 96 孔 PCR 仪均可使用</td></tr><tr><td>Platinum Taq DNA 聚合酶高保真酶</td><td>Invitrogen</td><td>11304011</td><td></td></tr><tr><td>10x 高保真缓冲液 [600 mM Tris-SO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; (pH 8.9), 180 mM (NH&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;SO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;]</td><td>Invitrogen</td><td>11304011</td><td></td></tr><tr><td>50 mM MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Invitrogen</td><td>11304011</td><td></td></tr><tr><td>PCR 核苷酸混合液，10 mM</td><td>Promega</td><td>C1141</td><td></td></tr><tr><td>超纯 H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Invitrogen</td><td>10977023</td><td></td></tr><tr><td>PCR1 和 PCR2 引物</td><td></td><td></td><td>脱盐处理。用 H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O 稀释至 100 &amp;micro;M</td></tr><tr><td>96 孔半裙边透明 PCR 板，单缺口角</td><td>Axygen</td><td>PCR-96M2-HS-C</td><td></td></tr><tr><td>Microseal 'B' 粘性封膜</td><td>BioRad</td><td>MSB1001</td><td>用于密封 96 孔 PCR 板</td></tr><tr><td>HIV-1 NL4-3 感染性分子克隆（pNL4-3）</td><td>以下试剂由美国国家卫生研究院艾滋病试剂计划、艾滋病司、NIAID、NIH 提供：HIV-1 NL4-3 感染性分子克隆（pNL4-3），来自 Malcolm Martin 博士（货号 114）。</td><td></td><td>稀释至 10&lt;sup&gt;5&lt;/sup&gt; 拷贝/mL，作为阳性对照使用</td></tr><tr><td>PCR 板旋转器或台式离心机</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>E-GEL 48 1% 琼脂糖凝胶</td><td>Invitrogen</td><td>G800801</td><td>预制 1% 琼脂糖凝胶（每 96 孔板使用两块）。可用任何 1% 琼脂糖凝胶替代。含溴化乙锭。</td></tr><tr><td>DirectLoad 宽范围 DNA Marker</td><td>Sigma</td><td>D7058</td><td>可用范围达 10 kb 的任意 DNA ladder 替代</td></tr><tr><td>Mother E-Base 装置</td><td>Invitrogen</td><td>EBM03</td><td>用于运行预制 48 孔 1% 琼脂糖凝胶</td></tr><tr><td>Gel Doc EZ 凝胶成像系统</td><td>BioRad</td><td>1708270</td><td>任何可用于含溴化乙锭琼脂糖凝胶的成像系统均可使用</td></tr><tr><td>PlateMax 可剥离热封膜</td><td>Axygen</td><td>HS-200</td><td>用于长期储存的热封膜</td></tr><tr><td>96 孔 0.8 mL 储存板</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AB0765</td><td>磁珠法 PCR 纯化所需的 0.8 mL 96 孔板</td></tr><tr><td>Agencourt AMPure XP（PCR 纯化试剂盒）</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63880</td><td>基于磁珠的 PCR 纯化试剂盒。此处可使用其他 PCR 纯化试剂盒替代（&lt;em&gt;例如&lt;/em&gt; QIAquick PCR 纯化试剂盒（Qiagen 货号 28106））</td></tr><tr><td>乙醇，纯级，200 proof，分子生物学用</td><td>Sigma</td><td>E7023</td><td></td></tr><tr><td>96 孔磁力架</td><td>Invitrogen</td><td>AM10027</td><td></td></tr><tr><td>微孔板振荡器</td><td></td><td></td><td>可选</td></tr><tr><td>Buffer EB</td><td>Qiagen</td><td>19086</td><td>洗脱缓冲液</td></tr><tr><td>Quant-iT PicoGreen dsDNA 检测试剂盒</td><td>Invitrogen</td><td>P11496</td><td>一种基于荧光的双链 DNA 浓度检测染料</td></tr><tr><td>微孔板读数仪</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nextera XT DNA 文库制备试剂盒</td><td>Illumina</td><td>FC-131-1096</td><td></td></tr><tr><td>Nextera XT Index 试剂盒</td><td>Illumina</td><td>FC-131-2001</td><td></td></tr><tr><td>Hard-Shell 96 孔 PCR 板</td><td>Biorad</td><td>HSP9601</td><td>Nextera XT DNA 文库制备试剂盒必需</td></tr><tr><td>文库定量试剂盒 - Illumina/通用型</td><td>Kapa Biosystems</td><td>KK4824</td><td>可使用其他文库定量试剂盒替代（&lt;em&gt;例如&lt;/em&gt; JetSeq DNA 文库定量 Lo-Rox 试剂盒（Bioline 货号 BIO-68029））</td></tr><tr><td>2100 Bioanalyzer</td><td>Agilent Technology</td><td></td><td>自动化电泳系统。需与高灵敏度 DNA 试剂盒联用</td></tr><tr><td>高灵敏度 DNA 试剂盒</td><td>Agilent Technology</td><td>5067-4626</td><td></td></tr><tr><td>Illumina MiSeq 测序平台</td><td>Illumina</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

用于下一代测序的近全长hiv-1前病毒扩增

Amplification of Near Full-length HIV-1 Proviruses for Next-Generation Sequencing

全长单个前病毒测序（FLIPS）检测是一种高效、高通量的方法，旨在扩增并测序单个接近全长的（完整与有缺陷的）HIV-1前病毒。FLIPS可用于确定细胞群体中整合型HIV-1的遗传组成。通过识别在逆转录过程中产生的HIV-1前病毒序列中的缺陷，例如大的内部缺失、有害的终止密码子/超突变、移码突变以及病毒颗粒成熟所必需的顺式作用元件中的突变或缺失，FLIPS能够鉴定出无法复制的整合前病毒。FLIPS检测可用于识别缺乏上述缺陷且具有复制能力的HIV-1前病毒&#160;因此可能具有复制能力。FLIPS 试剂盒包括：HIV-1 感染细胞的裂解，针对接近全长的 HIV-1 前病毒进行巢式 PCR（使用靶向 HIV-1 5' 和 3' LTR 的引物），DNA 纯化与定量，下一代测序（NGS）文库构建，NGS 测序 从头合成 前病毒重叠群的组装，以及通过简单的排除法鉴定具有复制能力的前病毒。FLIPS 相较于传统的整合型 HIV-1 前病毒测序方法（如单前病毒测序）具有优势。FLIPS 可扩增并测序接近全长的前病毒，从而判断其复制能力，同时使用更少的扩增引物，避免了引物错配带来的影响。FLIPS 是研究整合型 HIV-1 前病毒遗传特征的有力工具，尤其适用于潜伏病毒库的分析，但其应用范围可扩展至任何需要解析整合型 HIV-1 遗传组成的研究领域。

FLIPS 检测可扩增并测序单个接近全长的 HIV-1 前病毒。该方案包含 6 个步骤以获得接近全长的前病毒序列，具体步骤包括：感染细胞的裂解、全长（完整和缺陷型）HIV-1 前病毒的巢式 PCR、DNA 纯化与定量、测序文库制备、高通量测序（NGS）以及测序前病毒的从头（de novo）组装。每个步骤的结束均可视为一个检查点，在进入下一步之前可对产物质量（例如 扩增的 DNA、纯化的 DNA、测序文库或序列）进行评估。下文概述了在每个步骤结束后所进行的评估内容及预期结果。
巢式PCR扩增后，将扩增产物在1%琼脂糖凝胶上进行电泳（图3）。通过观察阴性对照和阳性对照可以初步判断PCR扩增的质量。若阴性对照孔中出现扩增产物，表明存在污染；若阳性对照孔中无扩增产物，则表明扩增不充分。接下来，选择含有扩增产物的孔用于测序。为避免选择含有多种不同前病毒扩增产物混合物的孔，仅考虑在终点稀释条件下获得扩增产物的孔进行测序。根据泊松分布，当30%的孔呈现扩增产物阳性时，即达到终点稀释。在此稀释度下，这些孔中含有单一扩增前病毒的概率为80%。此外，在此阶段还可通过凝胶上出现多条条带而识别出含有不同长度的多种前病毒扩增产物的孔。此类孔不应被选用于测序（图3）。
在对选定测序的扩增前病毒进行纯化后，定量可确保纯化过程中无前病毒DNA丢失。若扩增前病毒的DNA浓度为 &lt;0.2 ng/µLPCR2板中剩余的样本可进行纯化。文库构建完成后也会进行类似的质控检查，即对每个单独的文库进行定量，以确保在测序前每个前病毒已得到适当的片段化、加标签和扩增。各个前病毒文库按等摩尔量混合，最终文库浓度为4 nM（或根据测序服务提供方的具体要求）。若某个前病毒文库浓度过低，可将其从测序文库混合物中剔除，或重新制备该文库。在测序前需对混合后的文库进行最终浓度检测，并确认其平均片段长度。
实验前的质量控制步骤 从头合成 组装阶段可确保用于组装最终前病毒重叠群的测序读段质量。这些步骤包括：去除接头序列、切除5'和3'端核苷酸、设定严格的质控阈值，以及剔除过短的读段。CLC Genomics Workbench 可提供质量控制报告，可用于在修剪前评估读段的初始质量并指导修剪参数设置，以及在修剪后判断是否已充分去除低质量区域。此外，对于 从头合成 组装后，可通过足够的测序深度来评估组装所得重叠群的质量（&gt;1000X）以及覆盖均匀性（图 4A）。在此阶段也可识别混合群体。通过存在多个频率超过40%的单核苷酸多态性（SNP），可鉴定出多种全长（约9 kb）前病毒的混合物；而短型（含有大片段内部缺失）与全长前病毒的混合物，则可通过将测序读段比对至同一受试者的全长参考序列后所呈现的不均匀读段覆盖度来识别。图4B).
根据具体应用，可使用诸如 ggtree 等工具对最终比对结果进行可视化，ggtree 是“R：用于统计计算的语言和环境”中的一个软件包27。在最近的一项研究中，FLIPS 被用于对长期接受抗逆转录病毒治疗（ART）个体中分离出的初始型、中央记忆型、过渡记忆型和效应记忆型 CD4+ T 细胞中的 HIV-1 前病毒进行测序，旨在确定某些特定细胞亚群是否含有更高比例的基因组完整且可能具有复制能力的 HIV-12。此处展示了该研究中一名参与者（参与者 2026）所获得序列的可视化图示（图 5）。在该参与者中，绝大多数序列（97%）存在缺陷，仅在效应记忆型和过渡记忆型 CD4+ T 细胞中检测到完整的序列。该可视化工具可用于展示具有大片段内部缺失的序列数量及其在基因组中的位置。此外，还可进一步标注含有有害终止密码子、移码突变以及 MSD 位点和/或包装信号区域缺失/突变的序列。
FLIPS 检测的一个应用是鉴定基因组完整且可能具有复制能力的 HIV-1 前病毒。在一项近期研究中，从6名接受长期抗逆转录病毒治疗（ART）的参与者CD4+ T 细胞中分离出的531条序列中，鉴定出26条（5%）基因组完整的 HIV-1 前病毒2。其余有缺陷的前病毒包括含有倒位序列的前病毒（6%）、大片段内部缺失的前病毒（68%）、有害终止密码子/超突变的前病毒（9%）、移码突变的前病毒（1%），以及包装信号缺陷和/或 MSD 位点突变的前病毒（11%）。
<img alt="序列读段的质量控制与组装流程图，包含重叠片段合并及SNP检测。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58016/58016fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图2"> 
图2：工作流程概览 从头合成 HIV-1 前病毒的组装 工作流程中的主要步骤包括：1）序列读长的质量控制，2）合并重叠的配对，3） 从头合成 组装，以及 4) 重定位与共识构建分别用红色、蓝色、绿色和橙色表示。该图已根据 Hiener 修改 等2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58016/58016fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="凝胶电泳结果；DNA分离；marker条带；以碱基对表示的条带大小；实验分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58016/58016fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图3"> 
图3：PCR扩增HIV-1前病毒的琼脂糖凝胶示例。 第1、2、3、6、9和10孔含有扩增的HIV-1前病毒。第10孔含有一个具有大片段内部缺失的前病毒，第2孔含有两种不同长度的HIV-1前病毒共扩增产物（混合物），第12孔为阳性对照。注意，含有扩增产物的孔比例为60%，高于分离单模板所需的最低比例。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58016/58016fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="读长覆盖度与重叠群长度关系图；DNA测序结果比较；基因组数据分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58016/58016fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 4"> 
图4：读长比对结果示例。（A）示例显示由于单个全长HIV-1前病毒的扩增而产生的均匀覆盖度。在进行从头组装（de novo assembly）后，所有读长均比对至组装出的重叠群（contig），以生成一致序列。软件平台允许检查比对后的读长是否具有足够且均匀的覆盖度。（B）示例显示两个不同长度的HIV-1前病毒共扩增（混合物）。为确定是否存在混合物，将读长比对至来自同一样本的全长（约9 kb）参考序列，并检查读长比对情况。覆盖度不均表明存在混合物。本图经Qiagen许可复制14。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58016/58016fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="HIV基因组示意图，显示基因片段及记忆T细胞图表展示基因完整性。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58016/58016fig5.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图5"> 
图5：来自长期接受抗逆转录病毒治疗（ART）个体的CD4+ T细胞亚群中分离出的HIV-1前病毒序列的可视化示例。单个HIV-1前病毒序列以水平线表示。本图经Hiener et al.2. 修改。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58016/58016fig5large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>

全长单个前病毒测序（FLIPS）是一种高效、高通量的方法，可用于扩增和测序单个接近全长的（完整和有缺陷的）HIV-1前病毒，并可评估其潜在的复制能力。FLIPS克服了以往用于测序潜伏HIV-1储存库的检测方法的局限性。

用于下一代测序的近全长HIV-1前病毒扩增

全长单个前病毒测序（FLIPS）检测是一种高效、高通量的方法，旨在扩增和测序单个、近乎完整的前病毒基因组...

该方法有助于回答HIV研究领域中的关键问题，例如确定HIV前病毒的遗传组成及其感染的不同细胞类型，尤其是识别那些基因组完整且具有潜在复制能力的前病毒。该技术的主要优势在于，能够从单个HIV感染细胞中扩增出接近全长的HIV前病毒，并通过高通量测序对其进行测序分析。首先，按照文本方案中所述配制所有缓冲液。获取细胞沉淀，每百万个细胞加入100 µL裂解缓冲液。通过移液器吹打混匀。通过在55摄氏度的热循环仪中孵育1小时来裂解细胞，然后在85摄氏度下加热15分钟。为开始扩增单个HIV-1 DNA前病毒，按照文本方案中表一列出的成分配制第一轮PCR反应体系。将38微升反应液加入96孔PCR板的85个孔中，并将该板标记为PCR 1。此后，将 PCR 1 板转移至指定用于添加基因组 DNA 的洁净区域。使用三羟甲基氨基甲烷盐酸盐（Tris-HCl）将基因组 DNA 从 1:3 的比例连续稀释至 1:81 的比例，并确保每种稀释液制备 45 微升。向每个样本孔中加入 2 微升稀释后的基因组 DNA，向每个阴性对照孔中加入 2 微升三羟甲基氨基甲烷盐酸盐（Tris-HCl）。除阳性对照孔外，将整块板的其他孔密封。随后，转移至指定区域进行阳性对照的添加。向相应的孔中加入2 µL阳性对照，然后将整块板完全密封。使用PCR板离心机短暂离心PCR 1板，使管壁残留的液体沉降至管底。按照文本方案中所述条件，在热循环仪中运行PCR 1板。随后，根据表一列出的成分配制第二轮PCR所需的试剂。向新的96孔PCR板的85个孔中各加入28微升的PCR 2混合液。将此板标记为PCR 2。使用板式离心机，短暂离心PCR 1板，使管壁残留的液体沉降至孔底。向该板的每个孔中加入 80 微升三羟甲基氨基甲烷盐酸盐。随后，使用多通道移液器将 PCR 1 板每个孔中的 2 微升液体转移至 PCR 2 板的对应孔中。用透明粘性封口膜密封 PCR 2 板。将PCR 2号板在板式离心机中短暂离心。同时，用热封膜密封PCR 1号板，于-20摄氏度长期保存。按照文本方案所述程序，在热循环仪中运行PCR 2号板。然后短暂离心PCR 2板，使管壁残留的液体沉降至管底。使用多通道移液器，向每个孔中加入60 µL的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐（tris hydrochloride）。接着，将每个孔中的15 µL样品分别上样至两块含有溴化乙锭的48孔预浇制1%琼脂糖凝胶中进行电泳。确定含有扩增产物的孔及其大致大小，并保存凝胶图像。随后，确定扩增产物阳性孔数不超过30%的稀释度。首先，使用板式离心机短暂离心PCR 2板，使附着在孔壁上的残留液体沉降至孔底。从含有扩增产物的孔中转移 40 微升至新的 96 孔中型板的对应孔中。接着，准备好基于磁珠纯化的试剂盒，确保将磁珠恢复至室温，并配制新鲜的 80% 乙醇溶液。待磁珠达到室温后，涡旋振荡以确保其充分重悬。使用多通道移液器，向中通量板的每个孔中的40微升扩增产物中加入40微升磁珠。轻柔地上下移液10次以混匀。室温孵育5分钟。然后，将培养板转移至磁力架上，静置两分钟。随后，移除并弃去上清液。保持培养板仍在磁力架上，通过向每个孔中加入200 µL 80%乙醇溶液来洗涤磁珠。室温孵育30秒，然后移除并弃去上清液。从加入乙醇开始至弃去上清液，重复此洗涤步骤一次。使用多通道移液器去除残留的过量乙醇。将磁珠室温静置干燥15分钟。随后，从支架上取下反应板。向每孔中加入30 µL洗脱缓冲液，轻轻吹打10次以充分混匀。室温孵育两分钟。将酶标板放回磁力架上，静置两分钟。使用多通道移液器，将25 µL上清液转移至新的96孔PCR板的对应孔中。接下来，使用光谱光度计测定并记录每种扩增后DNA产物的大致浓度。准备双链DNA定量试剂盒，并用无DNA酶的无菌水将缓冲液稀释至1倍浓度。取99微升缓冲液加入平底组织培养板中适量数量的空孔中。然后，向三个空白孔中各加入100 µL缓冲液。对于每种待检测的扩增产物，将1 µL纯化后的DNA以三复孔形式分别加入含有缓冲液的孔中。将λ双链DNA从2 ng/µL稀释10倍至0.00 ng/µL，以制备标准品。向三个孔中各加入100 µL双链DNA标准品。用缓冲液将荧光染料稀释1:200。迅速向含有样品、空白或标准品的每个孔中加入100 µL稀释后的染料，并通过上下吹打混匀。此后，用铝箔覆盖培养板以避免接触光线。使用酶标仪记录荧光发射值。利用记录的测量数据确定每个样品中双链 DNA 的浓度。然后用水将每种纯化产物稀释至浓度为0.2纳克/微升。嵌套PCR完成后，将扩增产物在1%琼脂糖凝胶上进行电泳。通过观察对照可以确定PCR的初始质量。含有扩增产物的阴性对照表明存在污染，而无扩增产物的阳性对照则表明扩增不充分。仅将终点稀释时含有单个扩增前病毒的孔用于测序。尽管在此阶段可观察到含有不同长度的多个扩增前病毒的孔，但不应选择这些孔进行测序。对于从头组装，可通过足够的测序深度和覆盖均匀性来评估组装重叠群的质量。在此阶段，还可通过覆盖不均的现象识别混合种群。对某一位参与者分离出的序列进行可视化展示，结果显示其序列中有97%存在缺陷。在效应记忆和过渡记忆CD4阳性T细胞中发现完整的序列。进行该操作时，需注意只有在极限稀释条件下获得的扩增产物（即不超过30%的孔呈阳性）才含有单个前病毒。完成该操作后，可对扩增产物进行测序，以确定HIV前病毒的遗传组成。该技术建立后，为HIV领域的研究人员探索接受治疗患者体内基因组完整的HIV前病毒在不同细胞类型中的分布情况铺平了道路，有助于确定基因组完整且具有潜在复制能力的前病毒的藏匿位置。请注意，操作HIV感染细胞可能存在生物安全风险，因此在执行本实验时，必须采取适当防护措施，例如穿戴合适的个人防护装备，并在经过认证的实验室中进行操作。

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科研

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Genetics

遗传学

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