研究核糖核苷酸的掺入：酵母基因组中核糖核苷酸的链特异性检测及核糖核苷酸诱导突变的测量

该方法可用于回答诸如基因组中新生的前导链和后随链DNA分别掺入了多少核糖核苷酸等问题。尽管该方法可提供有关酵母基因组中核糖核苷酸密度的定性和定量信息，但也可应用于其他系统，例如哺乳动物基因组。碱性凝胶电泳可对全基因组范围内的核糖核苷酸掺入情况提供半定量的分析，而链特异性的Southern印迹法则可在特定基因组位点实现更高的灵敏度和定量分析。

开始此实验步骤时，向每份新制备的酵母基因组DNA样品中加入6微升1摩尔的氢氧化钾，并在55摄氏度下孵育2小时。2小时后，将样品置于冰上孵育5分钟。然后向每份样品中加入4微升6-6碱性DNA上样缓冲液。

制备一块碱性凝胶，其中含有1%琼脂糖、50毫摩尔氢氧化钠和1毫摩尔pH 8的EDTA，使用可容纳每泳道24微升DNA样品的梳子。将样品管短暂离心。将每个样品的全部24微升上样至碱性琼脂糖凝胶中。

加入适当的DNA分子量标记物。以30伏电压电泳30分钟，然后将电压降至10伏，继续电泳18至20小时。

第二天，对凝胶进行中和。将凝胶浸入中和缓冲液一中，在室温下轻轻振荡孵育45分钟。用新鲜的中和缓冲液替换原有的中和缓冲液混合物。

再孵育45分钟。为了染色DNA，将中和后的凝胶浸泡在含有1:10000稀释的Sybr Gold染料的200毫升水中，在室温下轻轻摇动染色2小时。使用紫外透射仪观察DNA。

通过毛细作用，将碱性凝胶中的DNA转移至带正电荷的尼龙膜上。首先，将碱性凝胶在室温下浸泡于碱性转移缓冲液中15分钟。接着，用蒸馏水短暂润湿尼龙膜，然后将其浸入碱性转移缓冲液中5分钟。

通过将三个 100 毫升玻璃烧杯倒置在一个略大于琼脂糖凝胶尺寸的玻璃烤盘中，搭建转移平台。将一块玻璃板置于玻璃烧杯上方。将两张较大的 3 MMCHR 层析滤纸覆盖在玻璃板上。

将碱性转移缓冲液倒入层析滤纸上，并将玻璃皿倒至一半满。使用5毫升玻璃移液管排除气泡。将琼脂糖凝胶置于其上。

再次抚平气泡。用 Parafilm 保鲜膜包裹凝胶的所有边缘。在凝胶上倒入少量碱性转移缓冲液。

将预浸泡的尼龙膜置于凝胶上方，并抚平气泡。取两张剪裁至琼脂糖凝胶大小的层析滤纸，放置在膜上，并抚平任何气泡。

将一大叠纸巾放在转膜三明治结构上方，并小心地将一块玻璃板置于纸巾上。在上方放置一个重物，于室温下过夜进行转膜。次日，小心地拆开转膜叠层结构。

将膜在室温下浸入中和缓冲液二中 15 分钟。使用紫外交联仪将 DNA 交联至带电尼龙膜上，采用自动交联模式。

在开始杂交程序之前，按照文本方案中的描述制备放射性标记的探针。将润湿的膜卷成杂交管，加入25毫升新配制的杂交缓冲液。在65°C下于杂交炉中旋转孵育1至2小时。

小心倒出溶液，加入 25 毫升杂交缓冲液和探针。在 65 摄氏度下旋转孵育 16 至 18 小时。随后，将溶液倒入放射性废物容器中。

向杂交管中加入磷酸盐 STS 洗涤液一，室温下旋转孵育 5 分钟。以此方式，用磷酸盐 STS 洗涤液一进行 5 次洗涤，每次 5 分钟。完成第 5 次磷酸盐 STS 洗涤液一的洗涤后，再用磷酸盐 STS 洗涤液二在 65 摄氏度下旋转洗涤膜 2 次，每次 15 分钟。

使用镊子将膜从杂交管中取出，并将其放入打开的塑料保护套中。封好后置于成像板上曝光。如有必要，可用不同的探针剥离并重新杂交印迹膜。

剥离时，将膜浸入25毫升含50%甲酰胺的2×SSPE溶液中，在65摄氏度孵育2小时。将溶液倒入放射性废物容器中。向杂交管中加入磷酸盐STS洗涤液2，在65摄氏度旋转洗涤15分钟。

在进行预杂交和杂交之前，使用盖革计数器检测膜以确认无信号存在，具体操作如前所述。这些凝胶图像显示了经或未经氢氧化钾处理的酵母基因组DNA，表明缺乏RNH2的细胞在基因组中保留了更多的核糖核苷酸。DNA聚合酶ε的M644L变异体降低了掺入核糖核苷酸的能力，而M644G突变体掺入核糖核苷酸的能力则强于野生型聚合酶。

可通过链特异性Southern印迹分析进一步检测碱性琼脂糖凝胶。在此示例中，探针与插入到ARS306附近、方向相反的URA3报告基因中的新生前导DNA链发生退火。使用新生前导链特异性探针进行Southern印迹的代表性结果展示了由碱裂解核糖核苷酸以及新生前导链DNA在野生型菌株和表达对核糖核苷酸掺入具有宽松特异性的DNA聚合酶α、δ和ε变体的菌株中所产生的DNA片段化模式。

该图显示了通过 Southern 印迹每条带中放射性信号占总信号的比例进行的定量结果。在进行该实验操作时，务必始终使用从锁面细胞中新鲜分离的 DNA。该技术建立后，为 DNA 修复领域的研究人员提供了量化复制性 DNA 聚合酶将核糖核苷酸掺入到 DNA 链中的密度及链特异性的方法。

在完成本实验步骤后，可进一步开展其他方法，如水解末端测序（hydrolated end sequencing）或 HydEn-seq，以回答更多科学问题，例如核糖核苷酸在基因组中的具体位置。请注意，操作放射性材料可能具有极高危险性，在进行本实验时，必须始终采取预防措施，避免工作台面和仪器设备受到污染。