利用小鼠脾细胞评估病原体相关分子模式对时钟基因表达的影响

该方法有助于解答免疫学和生物节律学领域中的关键问题，例如微生物组分如何改变分子钟。该技术的主要优势在于操作简便、可评估不同微生物组分对分子钟的影响，且具有高度可重复性。开始实验前，通过向RPMI 1640培养基中添加胎牛血清至终浓度10%，配制培养基。在50毫升离心管中，为每种待测PAMP分别配制10毫升刺激培养基，加入所列的PAMP至培养基中。

用预先配制的70%乙醇喷洒小鼠躯干，并用纸巾擦拭。将小鼠仰卧放置，略微向右侧倾斜。接着，使用解剖剪在小鼠左侧、前后肢之间的中点处沿体侧剪除毛发。

用镊子夹住腹膜，小心切开，避免损伤脾脏。用镊子取出脾脏，并放入含有约10毫升预冷培养基的无菌50毫升离心管中，置于冰上。随后，将脾脏连同2毫升培养基转移至一个小型无菌培养皿中。

通过将脾脏在两片无菌磨砂玻片的磨砂面之间研磨来充分匀浆。匀浆完成后，用移液器将含有脾细胞的两毫升培养基通过40微米尼龙细胞滤网转移至50毫升离心管中。向每支含有脾细胞的50毫升离心管中加入八毫升冷培养基，使每管总体积达到10毫升。

使用血细胞计数板测定每毫升的细胞数量。向6孔培养板中每孔加入约1 × 10⁶个细胞。接种细胞后，向每孔加入3 mL培养基或3 mL刺激培养基。

然后将培养板置于37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育3小时。使用连接P1000微量移液器的1,000微升移液器吸头，刮取孔底部的细胞。用同一吸头将含有细胞的培养基转移至15毫升离心管中。

在室温下以167 × g离心5分钟，使细胞沉淀。弃去上清液，并用5 mL磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞沉淀。再次在室温下以167 × g离心5分钟，弃去上清液后，向细胞沉淀中加入600 µL裂解缓冲液。

根据试剂盒制造商的说明，使用RNA提取试剂盒从脾细胞中分离RNA，并进行可选的柱上DNA消化步骤。根据逆转录试剂盒的说明书，对每个样品进行cDNA的合成。在20 µL的总体积反应体系中，每个样品使用10 µL的RNA。

取少量对照样品的 mRNA 加入一个 0.5 毫升离心管中，用于制备在进行定量 PCR 时所需的 cDNA 标准曲线。加入 10 微升 2X 逆转录酶预混液。逆转录反应完成后，在反应管中加入 10 微升水，作为标准曲线稀释系列的起始浓度。

进行十倍梯度稀释：将45微升水加入四个0.5毫升离心管中，分别标记为10⁻¹、10⁻²、10⁻³和10⁻⁴。使用P20微量移液器将5微升起始浓度样品加入第二个标记为10⁻¹的离心管中。通过反复吹吸数次混匀，然后从10⁻¹管中转移5微升至标记为10⁻²的离心管中，混匀。

使用P20微量移液器从10⁻²管中转移5 µL至标记为10⁻³的试管中，并混匀。最后，使用P20微量移液器从10⁻³管中转移5 µL至标记为10⁻⁴的试管中，并混匀。配制反应体系，使其包含0.5 µL引物探针试剂、5 µL基因表达主混合液、2 µL水和2.5 µL cDNA。

将RNA样品加入96孔qPCR板中。孵育针对多种分子钟基因的引物探针检测体系，并包含一个内参对照的检测体系，然后将其加载到qPCR仪中，以确定mRNA水平的相对定量。在实验设置中，选择定量分析、相对标准曲线法和TaqMan化学法。

接下来，将反应体系调整为10微升。将相关信息输入到板布局中。对分离得到的RNA进行qPCR，以评估分子钟基因clock、Per2、Dbp和Rev-erbα的相对表达水平。

在PAMP刺激后，与对照细胞相比，生物钟基因的表达水平无显著差异。与未刺激的对照组相比，经LPS和ODN1826刺激的细胞中Per2的表达水平显著升高。在所测试的PAMP中，仅有LPS可改变Rev-erb alpha的表达，其mRNA水平显著低于未刺激的对照组。

在用每种PAMP刺激后，与对照组相比，Dbp的mRNA水平显著降低。采用此方法后，除PAMP外的其他分子也可用于评估其对脾细胞分子钟的影响。