Name: 用小鼠脾评估病原体相关分子模式对时钟基因表达的影响 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 50 s
Description: 学习使用小鼠脾细胞评估病原体相关分子模式对时钟基因表达的影响。该方法操作简便、可重复性高，有助于研究免疫学与昼夜节律生物学中的关键问题。

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本工作获得了哈特福德大学文理学院院长办公室教员研究资助的支持。

研究期间，动物的护理和处理遵循美国国立卫生研究院的政策，符合机构指南，并获得了哈特福德大学动物保护与使用委员会的批准。
1. 动物的同步化
注意：本研究使用 20 周龄的雄性 B6129SF2/J 小鼠。
<ol>
	<li>在实验开始前2周，将小鼠置于12小时光照（标准顶置白光）/12小时黑暗的循环环境中进行节律同步。 
	注意：此处昼夜节律时间（ZT）0 对应光照开启，ZT12 对应光照关闭，同时保持所有其他环境因素（即， 食物、水和室温）保持恒定 21.</li>
</ol>
2. 仪器、培养基和攻毒培养基的准备
<ol>
	<li>将镊子和解剖剪进行高压灭菌。用铝箔包裹成对的磨砂载玻片，并进行高压灭菌。</li>
	<li>通过向 RPMI 1640 培养基中加入胎牛血清（FBS），配制终浓度为 10% 的培养基。在 50 mL 离心管中，向 10 mL 培养基（含 10% FBS 的 RPMI）中加入以下病原体相关分子模式（PAMPs），配制 10 mL 刺激培养基：脂多糖（LPS，5 µg/mL）、ODN1826（5 µg/mL）、热灭活单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes，108 HKLM/mL），或其它推荐浓度的 PAMP。</li>
	<li>将培养基和刺激培养基在水浴中预热至 37 °C，并在室温下准备约 70 mL 无菌磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.2）。</li>
	<li>使用 10 mL 移液器和移液辅助器，向 50 mL 离心管中加入 10 mL 培养基，并置于冰上。</li>
	<li>向 100 mL 烧杯中加入约 30 mL 70% 乙醇，并将解剖剪和镊子的末端浸入其中，以防止微生物污染。</li>
	<li>在通风橱中，向每 1 mL Buffer RLT（RNA 提取试剂盒组分）中加入 10 µL β-巯基乙醇，配制用于 RNA 提取的裂解缓冲液。仅配制所需量（每样本约 600 µL，对应约 1 × 106 个细胞）。 
	注：Buffer RLT 是 RNA 提取试剂盒的组分，可促进 RNA 与硅胶膜的结合。</li>
</ol>
3. 脾细胞分离与刺激
<ol>
	<li>在特定的授时因子时间，将小鼠保留在原始笼具中，通过吸入二氧化碳使其麻醉，实施安乐死2 以 3 L/min 的流速向笼中通入 CO2 呼吸停止后持续1分钟。</li>
	<li>通过颈椎脱位确认死亡，将拇指和食指置于颅底颈部两侧。或者，在颅底处按压一根金属棒，同时用另一只手快速牵拉尾根部或后肢，使颈椎与颅骨分离22.</li>
	<li>用70%乙醇喷洒小鼠躯干，并用纸巾擦拭。将小鼠仰卧放置，略微向右侧倾斜。使用解剖剪沿小鼠左侧、前后肢之间约中点处剪除毛发。</li>
	<li>用镊子夹住腹膜，小心切开，避免损伤脾脏。用镊子取出脾脏，放入含有约10 mL培养基的无菌50 mL离心管中，置于冰上。对剩余动物重复此操作。 
	&#8203;注意：脾脏呈肾形，较肾脏更长且更扁平。</li>
	<li>将一个脾脏与2 mL培养基转移至小型无菌培养皿中。
	<ol>
		<li>通过将脾脏在两片无菌磨砂载玻片的磨砂面上相互研磨来实现匀浆。若可能，在匀浆过程中保持组织和细胞处于培养基中。</li>
		<li>充分混匀后，将含有脾细胞的2 mL培养基通过40 µm尼龙细胞滤网移入50 mL离心管中。</li>
		<li>对剩余的脾脏重复上述步骤，每次使用新的磨砂载玻片、装有培养基的50 mL离心管以及新的细胞筛。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>向每个含有脾细胞的50 mL离心管中加入8 mL冷培养基，使每管总体积达到10 mL。使用血细胞计数板测定每毫升的细胞数量。</li>
	<li>加入约 1 x 106 将细胞以每孔一定数量接种至6孔培养板中。根据实验所用不同PAMP的数量，向相应数量的孔中加入细胞，并设置一个对照孔。向各孔中分别加入3 mL培养基或3 mL刺激培养基。</li>
	<li>在37 °C、5% CO₂条件下孵育培养板2 3小时。</li>
	<li>使用连接P1000移液器的1,000 µL吸头刮取孔底细胞。用同一支1,000 µL吸头将含有细胞的培养基转移至15 mL离心管中。</li>
	<li>通过离心（167 x g）收集细胞沉淀 g 室温下孵育5分钟。移除上清液，并用5 mL PBS洗涤细胞沉淀。</li>
	<li>再次以167 x g离心收集细胞 g 5分钟，弃上清，向细胞沉淀中加入600 µL裂解缓冲液以裂解细胞，随后进行RNA提取。</li>
</ol>
4. RNA 提取与 cDNA 合成
<ol>
	<li>根据试剂盒说明书，使用RNA提取试剂盒从脾细胞中分离RNA，并进行“可选”的柱上DNA消化步骤。</li>
	<li>在进行cDNA合成之前，使用微量分光光度计测定RNA浓度，确认其处于cDNA合成试剂盒推荐的最佳RNA浓度范围内（最高达2 µg）。</li>
	<li>根据反转录试剂盒说明书，对每个样品进行cDNA合成。每个样品使用10 µL RNA，总体积为20 µL。反转录程序完成后（热循环仪运行结束），向每管反应体系中加入20 μL H2O。</li>
	<li>使用P10或P20移液器，将少量对照样品的mRNA混合（例如，从2个样品中各取5 µL，共10 µL），加入0.5 mL离心管中，用于制备标准曲线用cDNA。
	<ol>
		<li>加入10 µL 2×反转录酶预混液。</li>
		<li>反转录反应完成后，向反应管中加入10 µL H2O，作为标准曲线稀释系列的起始浓度（&#34;1&#34;）。</li>
		<li>使用P100或P200移液器，向四个标记为10-1、10-2、10-3和10-4的0.5 mL离心管中各加入45 µL水，进行10倍梯度稀释（1至10-4）。
		<ol>
			<li>使用P20移液器将5 µL起始浓度&#34;1&#34;加入第一管（10-1），通过反复吹打混匀，然后从10-1管中转移5 µL至标记为10-2的管中并混匀。</li>
			<li>使用P20移液器从10-2管中转移5 µL至标记为10-3的管中并混匀；再使用P20移液器从10-3管中转移5 µL至标记为10-4的管中并混匀。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 定量聚合酶链式反应（qPCR）
<ol>
	<li>通过qPCR测定mRNA水平的相对定量。在实验设计中选择 &#34;定量分析 - 相对标准曲线&#34; 和 &#34;TaqMan&#34; 化学。将反应体积更改为 10 µL。将相关信息输入到孔板布局中（例如，目的基因，标准曲线，报告基因， 等等。).</li>
	<li>配制反应体系，使其包含 0.5 µL 引物/探针试剂、5 µL 基因表达预混液、2 µL H2O 和 2.5 µL cDNA（10–100 ng）。
	<ol>
		<li>通过将前述每种试剂（cDNA除外）乘以反应总数来配制主混合液，反应总数需包括标准曲线、阴性对照的反应数，每个反应设两个复孔，并额外增加2个反应以弥补移液误差。</li>
		<li>将7.5 µL配制好的主混合液用单通道或多人道移液器加入96孔反应板中预先确定的各孔中。向对应孔中加入2.5 µL cDNA用于未知样本和标准品，另加入2.5 µL H2O 加入阴性对照孔中。</li>
		<li>包括多种分子钟基因的引物/探针检测，以及内源性对照的检测例如，β-actin).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>为了确定相对表达量，先计算每个重复样本的平均相对数量，然后对于每个样本，将目的基因的平均相对数量除以参照基因的平均相对数量 β-actin.</li>
</ol>
6. 统计分析
<ol>
	<li>使用统计分析软件，在程序的“列统计”选项下输入数据。选择单因素方差分析（one-way ANOVA）并采用Dunnett's事后检验，以评估PAMP刺激后钟基因表达均值与对照组之间的差异。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

在本实验方案中，可使用微量分光光度计对用于基因表达分析的RNA进行定量并评估其纯度。核酸在260 nm处吸收紫外光，蛋白质通常在280 nm处吸收光，而在RNA提取过程中可能残留的其他污染物（例如苯酚）则可在230 nm处被检测到。因此，通过测定260/280 nm（RNA与蛋白质之比）和260/230 nm（RNA与非蛋白质污染物之比）的吸光度（A）比值，可评估RNA的质量。高质量的RNA其A260/280比值应在1.8–2.1之间，较低的比值提示存在蛋白质污染。纯的RNA样品其A260/230比值应为2.0。
在确定目的基因的相对表达水平时（即 Per2、Clock、Rev-erbα， 和 Dbp），还必须选择一个内参基因（即在不同样本间表达水平无显著差异的基因）。随后，目标基因的相对表达量将根据内参基因的表达水平进行标准化。起始材料的差异（如脾细胞数量不同）、逆转录酶效率的差异以及RNA降解速率的不同， 等等。，将通过内源性对照基因进行校正（β-actin 在此方案中）。然而，应验证所研...

哺乳动物的主时钟位于下丘脑的视交叉上核（SCN）内，它调控着生理和行为几乎所有方面的24小时节律振荡。1,2除了在机体水平上调控生物过程外，主时钟还能同步全身的外周细胞时钟。3,4,5尽管分子钟机制至少包含三个相互关联的转录-翻译反馈环路，其核心部分由 周期 (Per1-3), 隐花色素 (Cry1-2), Bmal1，以及 时钟 基因6,7. 除了维持核心分子钟的精确节律外，一些辅助性生物钟基因产物（例如，Rev-erbα 和 Dbp也调控非生物钟基因的表达， 即， 钟控基因（CCGs）6,7.
功能性分子钟已在多种免疫组织中被描述例如， 脾脏和淋巴结8 和细胞（例如， B细胞、树突状细胞、巨噬细胞8,9这些细胞通过Toll样受体（TLRs）等天然免疫识别受体，检测并响应病原体相关分子模式（PAMPs），即保守的微生物组分。10迄今为止，已发现13种具有功能的Toll样受体（TLR），可识别微生物组分，如细菌细胞壁成分、鞭毛蛋白以及微生物核酸10病原体相关分子模式（PAMP）脂多糖（LPS）是革兰氏阴性菌细胞壁的组分，可被TLR4识别，已被证明在个体和分子水平上均可改变昼夜节律。例如， 体内 通过小鼠活动测量脂多糖诱导的类似光相位延迟的挑战11 并导致下丘脑视交叉上核（SCN）和肝脏中的时钟基因表达下降，该结果由以下方法确定 原位 杂交和定量 PCR，分别在大鼠中进行12。在 体内 脂多糖刺激，人外周血白细胞分析13 和皮下脂肪组织14 通过qPCR检测发现多个钟基因的表达发生改变。最后， 离体 LPS对人巨噬细胞和小鼠腹腔巨噬细胞的刺激也导致时钟基因表达的改变，该结果通过qPCR测定。14.
本文描述了一种用于评估病原体相关分子模式（PAMPs）LPS、ODN1826（含有非甲基化CpG基序的合成寡核苷酸）以及热灭活的Listeria monocytogenes（HKLM）对小鼠脾细胞中分子钟基因表达影响的实验方案。这三种PAMPs分别被TLR4、TLR9和TLR2识别。该方案包括小鼠脾脏切除、脾细胞分离与刺激、RNA提取、cDNA合成以及通过qPCR检测多个钟基因的表达水平。本方法可在对动物和细胞进行极少操作的情况下，及时获得大量免疫细胞，并可在体外（ex vivo）用多种PAMPs进行刺激。已有研究表明，分子钟可调控免疫应答的多个方面8,15,16，因此，分子钟的紊乱极有可能损害免疫应答正常的时间依赖性变化。此外，由于昼夜节律的紊乱可导致多种严重病理状态17,18,19,20，研究人员可能有兴趣使用多种分子刺激脾细胞，并评估其对分子钟的影响。

<table><tbody><tr><td>磨砂载玻片</td><td>Fisher</td><td>12-550-343</td><td></td></tr><tr><td>细胞筛</td><td>Fisher</td><td>22363547</td><td></td></tr><tr><td>Lipopolysaccharide&amp;nbsp;</td><td>InvivoGen</td><td>ltrl-eklps</td><td></td></tr><tr><td>ODN1826</td><td>InvivoGen</td><td>Tlrl-1826-1</td><td></td></tr><tr><td>HKLM</td><td>InvivoGen</td><td>Tlrl-hklm</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Gibco</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>20012-043</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>74104 或 74106</td><td></td></tr><tr><td>无RNase的DNase试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>79254</td><td></td></tr><tr><td>6孔细胞培养板</td><td>Denville</td><td>T1006</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 离心管</td><td>Corning</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 离心管</td><td>Corning</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>高容量cDNA反转录试剂盒</td><td>ThermoFisher</td><td>4368814</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan基因表达检测 b-actin</td><td>ThermoFisher</td><td>Mm00607939_s1</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan基因表达检测 Per2</td><td>ThermoFisher</td><td>Mm00478113_m1</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan基因表达检测 Rev-erba</td><td>ThermoFisher</td><td>Mm00520708_m1</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan基因表达检测 Bmal1</td><td>ThermoFisher</td><td>Mm00500226_m1</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan基因表达检测 Dbp</td><td>ThermoFisher</td><td>Mm00497539_m1</td><td></td></tr><tr><td>qPCR仪 StepOnePlus</td><td>ThermoFisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TaqMan基因表达主混合液</td><td>ThermoFisher</td><td>4369016</td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp快速96孔反应板（0.1 mL）</td><td>ThermoFisher</td><td>4346907</td><td></td></tr><tr><td>统计分析软件</td><td>Prism 7.0a</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

利用小鼠脾细胞评估病原体相关分子模式对时钟基因表达的影响

The Use of Mouse Splenocytes to Assess Pathogen-associated Molecular Pattern Influence on Clock Gene Expression

从行为到基因表达，昼夜节律调控着生理功能的几乎所有方面。本文介绍一种利用病原体相关分子模式（PAMPs）脂多糖（LPS）、ODN1826 和热灭活的病原体刺激小鼠脾细胞的方法。 单核细胞增生李斯特菌 并研究它们对分子昼夜节律钟的影响。以往的研究主要集中在利用多种方法考察脂多糖（LPS）对分子钟的影响 体内 和 离体 来自多种模型的方法（例如， 小鼠、大鼠和人类。本实验方案描述了脾细胞的分离与刺激方法，以及通过定量PCR检测刺激后钟基因表达水平的技术流程。该方法不仅可用于评估微生物组分对分子钟的影响，也可用于研究其他可能改变钟基因表达的分子。该方法有助于解析病原体相关分子模式（PAMP）与Toll样受体相互作用影响钟基因表达的分子机制。

小鼠在 ZT13 时 sacrificed，分离脾细胞并进行刺激 离体 使用PAMPs LPS、ODN1826或HKLM处理。3小时后提取RNA，并通过qPCR检测分子钟基因的相对表达水平 时钟, Per2, Dbp, 和 Rev-erbα 与未受刺激的对照细胞相比。在PAMP刺激后， 时钟 表达水平与对照细胞中的表达水平相比无显著差异（图1A). Per2 与未受刺激的对照组相比，经LPS和ODN1826刺激后，细胞中基因表达水平显著升高（图1B）。LPS 是唯一能够改变 Rev-erbα 表达水平，因为mRNA水平显著低于未受刺激的对照组（图1C最后...

本方案描述了一种利用小鼠脾细胞发现可改变分子钟基因表达的病原体相关分子模式的技术。

从行为到基因表达，昼夜节律调控着生理学的几乎所有方面。在此，我们介绍一种用于挑战小鼠……的方法

该方法有助于解答免疫学和生物节律学领域中的关键问题，例如微生物组分如何改变分子钟。该技术的主要优势在于操作简便、可评估不同微生物组分对分子钟的影响，且具有高度可重复性。开始实验前，通过向RPMI 1640培养基中添加胎牛血清至终浓度10%，配制培养基。在50毫升离心管中，为每种待测PAMP分别配制10毫升刺激培养基，加入所列的PAMP至培养基中。用预先配制的70%乙醇喷洒小鼠躯干，并用纸巾擦拭。将小鼠仰卧放置，略微向右侧倾斜。接着，使用解剖剪在小鼠左侧、前后肢之间的中点处沿体侧剪除毛发。用镊子夹住腹膜，小心切开，避免损伤脾脏。用镊子取出脾脏，并放入含有约10毫升预冷培养基的无菌50毫升离心管中，置于冰上。随后，将脾脏连同2毫升培养基转移至一个小型无菌培养皿中。通过将脾脏在两片无菌磨砂玻片的磨砂面之间研磨来充分匀浆。匀浆完成后，用移液器将含有脾细胞的两毫升培养基通过40微米尼龙细胞滤网转移至50毫升离心管中。向每支含有脾细胞的50毫升离心管中加入八毫升冷培养基，使每管总体积达到10毫升。使用血细胞计数板测定每毫升的细胞数量。向6孔培养板中每孔加入约1 × 10⁶个细胞。接种细胞后，向每孔加入3 mL培养基或3 mL刺激培养基。然后将培养板置于37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育3小时。使用连接P1000微量移液器的1,000微升移液器吸头，刮取孔底部的细胞。用同一吸头将含有细胞的培养基转移至15毫升离心管中。在室温下以167 × g离心5分钟，使细胞沉淀。弃去上清液，并用5 mL磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞沉淀。再次在室温下以167 × g离心5分钟，弃去上清液后，向细胞沉淀中加入600 µL裂解缓冲液。根据试剂盒制造商的说明，使用RNA提取试剂盒从脾细胞中分离RNA，并进行可选的柱上DNA消化步骤。根据逆转录试剂盒的说明书，对每个样品进行cDNA的合成。在20 µL的总体积反应体系中，每个样品使用10 µL的RNA。取少量对照样品的 mRNA 加入一个 0.5 毫升离心管中，用于制备在进行定量 PCR 时所需的 cDNA 标准曲线。加入 10 微升 2X 逆转录酶预混液。逆转录反应完成后，在反应管中加入 10 微升水，作为标准曲线稀释系列的起始浓度。进行十倍梯度稀释：将45微升水加入四个0.5毫升离心管中，分别标记为10⁻¹、10⁻²、10⁻³和10⁻⁴。使用P20微量移液器将5微升起始浓度样品加入第二个标记为10⁻¹的离心管中。通过反复吹吸数次混匀，然后从10⁻¹管中转移5微升至标记为10⁻²的离心管中，混匀。使用P20微量移液器从10⁻²管中转移5 µL至标记为10⁻³的试管中，并混匀。最后，使用P20微量移液器从10⁻³管中转移5 µL至标记为10⁻⁴的试管中，并混匀。配制反应体系，使其包含0.5 µL引物探针试剂、5 µL基因表达主混合液、2 µL水

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Research

科研

JoVE Journal

Genetics

遗传学

用小鼠脾评估病原体相关分子模式对时钟基因表达的影响

昼夜节律钟在单个细胞内发挥作用，即具有细胞自主性。本文描述了利用非侵入性的、基于荧光素酶的实时生物发光技术构建细胞自主性节律钟模型的方法。报告基因细胞为研究昼夜节律生物学提供了易于操作且功能明确的模型系统。...

利用荧光素酶生物发光报告系统监测细胞自主性基因表达的昼夜节律

来源：Madenspacher, J. H. 和 Fessler, M. B. 小鼠实验性细菌性肺炎诱导与表型分析的一种非侵入性且技术要求低的方法。J. Vis. Exp.

评估感染研究中小鼠脾脏的细菌负荷

来源：Ahn, J. J., 等 ，利用Listeria monocytogenes实验性感染作为研究宿主干扰素-γ应答的模型。J. Vis. Exp. (2016)本视频演示了从感染单核细胞增生李斯特菌（Listeria...

小鼠脾细胞体外热灭活刺激 单核细胞增生李斯特菌

将bm12淋巴细胞移植到C57BL/6受体小鼠体内是系统性红斑狼疮的成熟动物模型。本文介绍如何利用该模型诱导疾病发生，并通过流式细胞术对滤泡辅助性T细胞、生发中心B细胞和浆细胞进行表征分析。...

C57BL/6小鼠中系统性红斑狼疮（SLE）的bm12可诱导模型

在此，我们描述了用于并行监测人胰岛细胞和原代肌管细胞昼夜节律性生物发光及分泌活性的实验设置。为此，我们采用慢病毒载体递送荧光素酶核心钟基因报告系统，随后 体外...

平行测量人原代细胞培养物中的昼夜节律钟基因表达与激素分泌

本方案描述了利用基于微球的多重免疫检定平台和流式细胞仪，对经刺激的小鼠脾细胞培养上清液中多种细胞因子靶标进行同时定量的方法。...

利用基于细胞计数微球的免疫检测平台对刺激后的小鼠脾细胞进行多重细胞因子分析

这种新开发的基于荧光的技术能够对自由活动小鼠的视交叉上核（SCN）中昼夜节律钟基因的转录进行长期、实时且高时间分辨率的监测。...

体内 利用荧光报告基因监测小鼠视交叉上核中昼夜节律钟基因的表达

我们描述了可用于分析宿主编码因子活性的体外和体内感染实验方法。...

利用细菌病原体探究宿主在细胞和有机体水平的应答

本文介绍了一种简单的共聚焦成像方法，用于可视化小鼠次级淋巴器官中分泌细胞因子干扰素γ的细胞原位定位。该方案可拓展应用于多种组织中其他细胞因子的可视化研究。...

小鼠脾脏中原位干扰素γ产生的成像 单核细胞增生李斯特菌 感染

本研究介绍了基于化学遗传学和紫光的策略，以实现可靠的白天昼夜节律相位移动。...

使用化学遗传学与光谱学方法诱导白天昼夜节律相位偏移

学习使用小鼠脾细胞评估病原体相关分子模式对时钟基因表达的影响。该方法操作简便、可重复性高，有助于研究免疫学与昼夜节律生物学中的关键问题。

利用小鼠脾细胞评估病原体相关分子模式对时钟基因表达的影响

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