Name: 神经刺激器引导注射自体干细胞近马左喉返神经 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 36 s
Description: 学习使用神经刺激器引导注射自体干细胞治疗马左喉返神经病变的方法。该技术通过微创活检采集肌肉源性干细胞，为再生医学研究提供安全有效的治疗手段。

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本研究由蒙特勒斯瓦马匹研究中心资助。

列日大学动物伦理使用委员会批准了该研究方案。
1. 肌肉微活检
<ol>
	<li>通过视诊和触诊确定取样部位，位于肱三头肌长头，约在肘部与肩部隆起之间的中点位置。</li>
	<li>使用电动剃刀剪除约 2 × 2 cm2 区域的毛发。在剪毛区域使用聚维碘液肥皂和酒精棉片进行外科擦洗，持续 1 分钟。用 25 G 针头在剪毛并消毒区域的中心皮下注射 1 mL 2% 利多卡因溶液。</li>
	<li>用抗菌洗手液清洗双手，戴上无菌手套。使用一次性无菌洞巾作为无菌操作面，放置活检针和套管针。</li>
	<li>通过拉动弹簧装置，使半自动 14 G 活检针处于待触发状态，如 图 1b 和 图 1c 所示。释放活检针以熟悉其工作原理。将已上膛的活检针放置在无菌操作面上。熟悉套管针的结构，其由套管和针芯组成，如 图 1a 所示。</li>
</ol>
<img alt="活检针装置示意图；用于医学诊断中的组织取样。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58023/58023fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 1"> 
图 1：活检针套装。 活检针套装包括（a）套管及其针芯和活检针（从上到下）。其他图示展示了活检针的（b）中立位置和（c）预加载位置。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58023/58023fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<ol start="5">
	<li>通过组装套管和穿刺锥并保持其锁定状态来准备穿刺器。将穿刺器垂直于皮肤穿过先前已麻醉的区域。推进穿刺器，使穿刺器尖端深入肌肉约1.5 cm。取出穿刺器，将套管与穿刺锥分离，并将穿刺锥放置在无菌表面上。</li>
	<li>将装有弹射装置的活检针经由套管插入。将活检针与套管一起经皮肤切口插入肌肉内。推进活检针，使其尖端位于肱三头肌长头的中部位置。</li>
	<li>释放活检针，然后将活检针与套管一同拔出。将活检针从套管中抽出。将套管留在无菌表面上。</li>
	<li>用一只手拉动弹簧，另一只手固定活检针，打开活检针。 
	注意：此时可在活检针尖端看到组织样本。</li>
	<li>在第二位人员协助下，打开含有样本保存液的采样管。使用19 G注射针头从活检针上取下微小的肌肉组织块。将肌肉样本放入采样液中。用螺旋盖封闭采样管，并轻轻倾斜2次，确保样本悬浮于液体中。</li>
	<li>重新装填活检针。从无菌表面取回套管，重新组装装有弹射装置的活检针与套管。按照前述方法，将装填好的活检针和套管经皮肤切口插入。重复取样操作2–3次，直至采集约20 mg肌肉组织。关闭采样管，轻轻旋转管体2次，使肌肉组织块与采样液充分混合。</li>
	<li>将样本在4至8 °C的恒定温度下运送至实验室。 
	注意：实验室将对样本进行后续处理。此处可暂停实验流程。</li>
	<li>该操作耐受性良好，通常不会在取样部位出现肌肉酸痛。若极少数情况下取样部位出现肌肉酸痛，应给予适当的镇痛治疗。</li>
</ol>
2. 细胞处理
注意：本研究中使用的干细胞已根据 Ceusters 等人 et al.7 所描述的方法制备。该文章还描述了细胞的表征。
<ol>
	<li>首先准备特定的培养基 DF20：向一瓶含谷氨酰胺和酚红的市售培养基（500 mL）中加入 20% 的热灭活胎牛血清、5 mL 的青霉素（1,000 IU/mL）-链霉素（10,000 µg/mL）溶液以及 2.5 mL 的两性霉素 B（250 µg/mL）溶液。</li>
	<li>将 150 µL DF20 培养基加入 24 孔板的每个内侧 16 个孔中。将 1 mL 磷酸盐缓冲液（PBS）[含氯化钾（200 mg/L）、单碱式磷酸钾（200 mg/L）、氯化钠（8,000 mg/L）和双碱式磷酸钾（2,160 mg/L）] 加入剩余的外周孔中。</li>
	<li>用 PBS 将微小的肌肉组织块清洗 2 次。借助解剖刀和镊子将其进一步分离为极小的碎片，并将一小块（约解剖刀刀尖大小）放入多孔板的每个内侧 16 个孔中。</li>
	<li>将多孔板置于培养箱中，维持以下条件：37 °C、21% O2 和 5% CO2。每天在倒置显微镜下观察各孔，必要时补充 50 µL DF20 培养基，防止细胞干燥。 
	注意：大约 10 天后，组织块周围将长出足够数量的细胞，可用于干细胞分离。本方案可在此暂停。</li>
	<li>当在肌肉组织块周围观察到细胞晕环时，弃去肌肉组织块。使用含 EDTA 的胰蛋白酶溶液（每孔 150 µL）消化细胞：弃去培养基，用 1 mL PBS 清洗细胞，弃去 PBS，加入胰蛋白酶溶液，在 37 °C 下作用不超过 10 分钟。加入培养基以终止胰蛋白酶作用，收集细胞悬液，随后在 37 °C 下以 200 × g 离心 10 分钟。弃去上清液，将沉淀重悬于平衡盐溶液中。</li>
	<li>将细胞悬液转移至由 15%、25% 和 35% 组成的三层不连续密度梯度中。将含有细胞悬液和不连续密度梯度液的离心管在 25 °C 下以 1,250 × g 离心 20 分钟，离心过程中不得使用刹车。离心后，观察在不同梯度层之间出现的具有不同密度的细胞组分。</li>
	<li>继续培养 15% 与 25% 之间的组分。将其转移至离心管中，并用平衡盐溶液洗涤。在 37 °C 下以 200 × g 离心 10 分钟，弃去上清液。将沉淀重悬于 1 mL DF20 培养基中。预先在表面积为 25 cm2 的细胞培养瓶中加入 6 mL DF20 培养基。将细胞转移至已预加培养基的培养瓶中，并在 37 °C、21% O2 和 5% CO2 的培养箱中继续培养。 
	注意：本方案可在此暂停。</li>
	<li>每天在倒置显微镜下观察细胞。必要时更换培养基（弃去旧培养基，加入 6 mL 新鲜培养基）。通过光学显微镜在固定放大倍数下观察培养皿中的细胞层，确定细胞汇合度。估算细胞占据培养皿表面的面积。每次观察均采用相同的显微镜放大倍数，以便评估汇合度。当细胞占据培养皿表面 85% 时，进行细胞传代。</li>
	<li>当细胞达到汇合状态时，使用与步骤 2.4 相同的方法，采用含 EDTA 的胰蛋白酶溶液消化细胞。随后在 37 °C 下以 200 × g 离心 10 分钟，弃去上清液，将细胞重悬于 5 mL DF20 培养基中。将细胞接种至已预加 25 mL DF20 培养基的 175 cm2 细胞培养瓶中，并置于 37 °C、21% O2 和 5% CO2 的培养箱中培养。 
	注意：本方案可在此暂停。</li>
	<li>每天在倒置显微镜下观察细胞。必要时更换培养基（弃去旧培养基，每瓶加入 30 mL 新鲜培养基）。当细胞达到汇合状态时，使用步骤 2.4 所述的胰蛋白酶-EDTA 消化细胞。随后在 37 °C 下以 200 × g 离心 10 分钟，弃去上清液，将细胞重悬于 6 mL DF20 培养基中。取 1 mL 细胞悬液分别接种至六个 175 cm2 的培养瓶中，每个培养瓶已预加 25 mL DF20 培养基，并在含 21% O2 和 5% CO2 的 CO2 培养箱中于 37 °C 培养。</li>
	<li>每天在倒置显微镜下观察细胞。必要时更换培养基（弃去旧培养基，每瓶加入 30 mL 新鲜培养基）。当细胞达到汇合状态时，使用步骤 2.5 所述的胰蛋白酶-EDTA 消化细胞。在 37 °C 下以 200 × g 离心 10 分钟，重复洗涤 3 次，每次均弃去上清液。</li>
	<li>借助 Bürker 计数板和光学显微镜对细胞进行计数。用特定的冷冻保存液制备浓度为 1,000 万细胞/mL 的细胞悬液。</li>
	<li>将每剂 1 × 107 个细胞（溶于 1 mL 冷冻保存液中）进行深低温冷冻，并储存于液氮的气相中，直至使用。 
	注意：本方案可在此暂停。</li>
	<li>将细胞样品管置于干冰中运输，用于最终使用。</li>
</ol>
3. 细胞注射
注意：干细胞注射操作需要两人共同完成。
<ol>
	<li>将细胞悬液逐步升温至室温。用2 mL注射器吸取悬液。</li>
	<li>使用19 G注射针经颈静脉注射地托咪啶（10 µg/kg）对马进行镇静。等待5分钟，直至镇静效果完全显现，表现为马头部下垂的典型体态。</li>
	<li>使用电推剪在马左侧喉部区域修剪出20 × 10 cm2的区域，如图2所示。随后，在剃毛区域涂抹聚碘肥皂和酒精进行外科消毒。</li>
	<li>将一根标准的柔性视频内窥镜经马的左鼻孔插入，并向前推进至鼻咽部。调整内窥镜位置，直至可完整观察到两侧杓状软骨和会厌。在操作过程中保持内窥镜在此位置，并将视频内窥镜的屏幕转向操作人员。</li>
	<li>将刺激/注射针连接至神经刺激器的负极，保持针头无菌。将神经刺激器的正极连接至电极贴片，并将该贴片粘贴于已剃毛的皮肤区域。</li>
	<li>将装有细胞悬液的注射器连接至注射管路，并预先充满液体以排出系统中的空气。记录系统的体积，并准备一支含有相同体积无菌生理盐水的注射器。</li>
	<li>若不熟悉该技术，可使用经消毒的5至7 MHz线性超声探头观察目标区域的解剖结构。使用无菌超声耦合凝胶以提高图像质量。观察喉部结构以及走行于喉背侧区域的血管。</li>
	<li>熟悉该区域解剖结构后，将刺激/注射针朝向喉部背外侧方向进针。接近喉部背外侧区域时，启动神经刺激器，设置为1 Hz刺激模式，电流为2 mA。</li>
	<li>在观察屏幕上的内窥镜图像的同时，轻柔移动针头，使其接近喉返神经的位置。一旦视频屏幕上可见左侧杓状软骨出现外展运动，立即降低电流，直至运动消失，同时保持针头位置不变。</li>
	<li>确定针头的理想位置。当电流为0.5 mA时运动反应消失，提示针尖与神经距离理想。若在电流低于0.4 mA时仍存在杓状软骨运动，则不应注射细胞，以避免发生神经内注射。</li>
	<li>当观察到在0.5 mA时运动反应消失，即可注射含有107个自体干细胞的细胞悬液，并用第3.6步中准备的生理盐水冲洗注射管路，以确保残留在注射管中的细胞悬液全部注入。</li>
	<li>细胞注射完成后，拔出针头和内窥镜。</li>
	<li>让马从镇静状态中自然恢复。穿刺部位无需进一步处理。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本方案描述了采用神经刺激器引导的方法，将肌肉来源的自体干细胞成功应用于马的喉返神经。肌肉微活检样本的采集，以及干细胞的分离、培养和鉴定此前已有详细描述，而将这些细胞注射至外周神经附近的操作则属首次。本研究采用电刺激神经定位法，利用电刺激器对神经进行定位，并将间充质干细胞直接注射至喉返神经附近。通过鼻咽部视频内窥镜监测运动反应。在穿刺针定位过程中，若刺激到其他神经，相应的运动可在内窥镜屏幕上观察到。成功刺激喉返神经的特征是杓状软骨出现典型的外展运动。在其中一匹马中，注射局部麻醉药以诱导杓状肌暂时性麻痹。尽管本研究未专门检测细胞在神经附近的成功植入情况，但通过低电流下实现神经电定位及注射操作，证明干细胞已被施用于神经附近。此外，通过局部麻醉药注射后成功诱导运动阻滞，进一步证实了注射物与神经的邻近关系。
在其余五匹马中，从首次刺激到成功注射干细胞的时间为3至12分钟。操作过程中马匹接受了轻度镇静，以提高其对电刺激的配合度。所有马匹在任何阶段均未出现不良反应，表明如有必要，可延长刺激时间以获得良好的针头定位。若操作者在解剖结构不同的多匹马中定期使用该技术，预计学习曲线将较为陡峭。
马匹常患有喉返神经麻痹（RLN），其特征为左侧杓状软骨不同程度的瘫痪，导致异常呼吸音和运动不耐受。对受累神经进行组织学检查可发现典型的周围性神经病变病灶。16周围神经病变是一类用于描述多种周围神经损伤的术语，可导致感觉、运动或器官功能受损。其病因多种多样，可能包括糖尿病、营养缺乏、特定药物治疗、创伤性损伤、缺血或感染，也可能为特发性。无论病因如何，周围神经病变均具有一些共同的组织病理学特征，如华勒变性、远端轴索病或节段性脱髓鞘。已有研究表明，向受损的周围神经施用间充质干细胞可能有助于神经再生，但其潜在机制尚不明确。传统观点认为，间充质干细胞仅能分化为脂肪、肌肉、软骨和骨组织的前体细胞，但在特定条件下，它们也被证实可分化为肌细胞。17，星形胶质细胞18，以及周围神经系统的髓鞘形成细胞19 中枢神经系统19. 在一个过程中 体外 培养过程中，暴露于神经肽将促进间充质干细胞向表达神经元标志物的细胞分化21,22. 多个 体内 研究表明，间充质干细胞对坐骨神经损伤大鼠模型的神经再生和功能恢复具有促进作用10,23这可能是由于有利的环境条件促进了干细胞向组织特异性细胞的分化24未来的研究还应探讨该技术在喉返神经受损马匹中用于移植预分化细胞的应用。
据我们所知，这是首篇报道使用神经刺激器定位外周神经并将其作为特定治疗注射靶点的研究。其他物种的多种外周神经疾病（如神经病理性疼痛）可通过在神经附近注射干细胞进行治疗25,26。未来的研究应验证该技术在临床患者中的疗效，并进一步探讨注射细胞的迁移风险及其分化潜能。

喉返神经麻痹（RLN）是马匹上呼吸道的一种常见病理状态，其特征为不同程度的杓状软骨麻痹。喉部左侧最常受累。在某些马群中，该病的患病率可高达35%。尽管已有多种假说试图解释该病的病因和发病机制，但RLN的确切病因仍不明确。该病理表现为喉返神经的远端轴索病，伴有脱髓鞘病变，但也存在一定程度的再髓鞘化。这种轴索病导致喉内肌失神经支配，并伴随进行性萎缩1,2。该病程通常进展缓慢，最终可能导致患侧杓状软骨完全丧失外展功能3。
患病马匹在运动时会发出异常的呼吸道声音，在较严重的情况下有时还会表现出运动不耐受。确诊依据是对未镇静、站立状态的马匹进行内镜检查，观察到喉部外展部分或完全丧失1,2,4。目前最常用的治疗方法是喉成形术（也称为&#34;tie-back&#34;），有时联合进行室带声带切除术。尽管这些手术的总体成功率被认为良好至优异5，但术后并发症非常常见。最常见的并发症是外展功能逐渐丧失。Barnett et al.6报道，在至少76%的马匹中，术后六周内至少出现一个等级的外展功能下降。其他并发症还包括假体失效、咳嗽和气道污染等5。
间充质干细胞（MSCs）在马医学的研究与临床应用中已有十余年历史，但关于其有效性的经证实研究仍较为匮乏。马体内成体间充质干细胞最常见的两个来源是骨髓和脂肪组织7。这两种取样技术均具有一定的侵入性，且并不总能获得足够数量的细胞。最近，Ceusters et al.7报道了来源于横纹肌组织的干细胞培养方法，该组织可通过一种侵入性更小的微活检技术获取。
间充质干细胞（MSCs）具有自我更新、自我生成、多能性和分化能力7,8。目前已有充分证据表明，它们能够分化为脂肪、骨、肌肉和软骨等所有中胚层谱系9。然而，在特定环境条件下，MSCs 还可分化为非间充质谱系细胞，例如神经元、星形胶质细胞以及周围神经系统和脊髓中的髓鞘形成细胞9,10。MSCs 已被应用于多种神经病变模型中10,11。研究表明，无论通过全身性还是局部给药，MSCs 均能迁移至退化的神经组织区域，并促进神经细胞再生11。此外，由 MSCs 衍生的类施万细胞能够募集巨噬细胞以清除细胞碎片，并分泌神经营养因子，促进轴突生长和再髓鞘化9。
本研究旨在描述一种在健康马匹左侧喉返神经附近，采用神经刺激器引导注射肌肉来源自体干细胞的技术。通常，将连接注射针头的神经刺激器用于外周神经的电定位，以便在该区域施用局部麻醉药12。通过在神经附近施加微弱的直流脉冲以诱发运动反应。产生该运动反应的能力取决于多个参数，例如针头的导电面积、组织的阻抗、施加的电流、脉冲持续时间以及针头与神经之间的距离。神经刺激器专用针头的设计特点是针尖具有非常局限的导电区域，而针体其余部分则为绝缘涂层。这种设计有助于精确地定位神经。现代神经刺激器能够适应不同组织的阻抗变化，并输出设备设定的恒定电流强度。此外，大多数设备采用0.1秒的脉冲持续时间，因此决定性参数为施加的电流和针头与神经之间的距离。针头至神经的距离与诱发运动反应所需电流之间的关系遵循库仑定律：E = kQ/r；其中E为所需刺激电荷，k为库仑常数，Q为最小所需刺激电荷，r为两个电极之间的距离。在神经电定位过程中，两个电极之间的距离被视为针头至神经的距离12。电荷的衰减遵循针头至神经距离平方反比规律13。临床实践表明，在0.5 mA电流下产生运动神经刺激与成功实现神经阻滞高度相关，且在更低电流下运动信号消失可防止操作者误将药物注入神经内。本研究旨在少量马匹中验证该技术的可行性和安全性。若该技术的可行性和安全性得以证实，则可轻松应用于患病马匹。此外，马喉返神经可作为周围性变性神经病变的模型。

<table><tbody><tr><td>地托咪定（Domidine）&amp;nbsp;</td><td>Dechra</td><td></td><td>通过药房销售</td></tr><tr><td>利多卡因（Xylocaine）&amp;nbsp;</td><td>Movianto</td><td></td><td>通过药房销售</td></tr><tr><td>TOF Watch S（神经刺激器）</td><td>Alsevia</td><td>79950161</td><td></td></tr><tr><td>TSK Starcut（活检针）</td><td>STSK laboratory</td><td>SAG - 14090C</td><td></td></tr><tr><td>电刺激针&amp;nbsp;</td><td>Pajunk</td><td>001185-79</td><td></td></tr><tr><td>DMEM - F12（培养基）</td><td>Lonza</td><td>LO BE12-719F</td><td></td></tr><tr><td>热灭活胎牛血清</td><td>Life technologies</td><td>10500</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>Lonza</td><td>DE17-602E</td><td></td></tr><tr><td>两性霉素B（Fungizone）</td><td>Lonza</td><td>17-836E</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液</td><td>Lonza</td><td>LO BE17-512F</td><td></td></tr><tr><td>24孔培养板</td><td>Corning</td><td>3524</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶</td><td>Life technologies</td><td>12604</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Lonza</td><td>LO BE10-508F</td><td></td></tr><tr><td>Percoll PLUS</td><td>GE Healthcare</td><td>17544502</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S8776</td><td></td></tr><tr><td>T-25 cm&amp;sup2; 培养瓶</td><td>Nunclon</td><td>136196</td><td></td></tr><tr><td>T-175 cm&amp;sup2; 培养瓶</td><td>Nunclon</td><td>178883</td><td></td></tr><tr><td>Cryostore CS5</td><td>Biolife solutions</td><td>205373</td><td></td></tr></tbody></table>

在马左侧喉返神经附近进行神经刺激仪引导下的自体干细胞注射

Nerve Stimulator-guided Injection of Autologous Stem Cells Near the Equine Left Recurrent Laryngeal Nerve

复发性喉返神经病（RLN）常影响马匹，其特征为异常呼吸音和运动不耐受。喉返神经出现脱髓鞘病变。在多种动物模型中已证实，将干细胞应用于脱髓鞘神经具有治疗益处。本研究旨在通过使用电神经刺激器，在健康马匹的左侧喉返神经周围注射自体肌肉来源的间充质干细胞，以评估该操作的可行性和安全性。
从五匹健康的标准马中获取肌肉来源的干细胞，通过使用半自动14 G活检针从三头肌采集20 mg肌肉组织。监测喉部的运动 通过 上呼吸道视频内镜检查。使用绝缘神经阻滞针接近左侧喉返神经。施加神经刺激，起始电流为2 mA，并观察左侧杓状软骨外展运动是否成功。逐步降低刺激强度。当刺激电流降至0.5 mA时出现运动反应消失，107 注射自体肌肉来源的干细胞。两名对时间点不知情的检查者在治疗前以及细胞注射后第1天、第7天和第28天对马匹的喉部功能进行评分。在第六匹马中，注射1 mL 2%利多卡因以进一步确认针头位置的正确性。这导致左侧杓状软骨出现暂时性麻痹。
本研究证实，借助电神经刺激器可实现对喉返神经的定位，且马匹对神经的电刺激耐受性良好。在注射干细胞后，所有马匹均未观察到喉部功能发生改变。未来还需开展进一步研究，以明确自体肌肉来源的间充质干细胞在喉返神经周围注射对患喉返神经麻痹（RLN）马匹的治疗效果。

列日大学动物使用伦理委员会批准了本研究方案。本研究纳入了蒙特勒索研究中心马群中的六匹马。在第一匹马中，通过电刺激定位了喉返神经。图2展示了所使用的设置，其中刺激针插入马喉部左侧背外侧区域，并连接至神经刺激器。当在0.5 mA电流下观察到杓状软骨运动消失时，注射1 mL 2%利多卡因。这导致在更高电流下无运动反应，并出现左侧杓状软骨的暂时性麻痹。24小时后的对照内窥镜检查显示杓状软骨功能完全恢复。该完整方案在其余五匹马中均成功重复。所有马匹均未对肌肉微活检产生不良反应。在所有马匹中，均在规定时间内成功培养出足够数量的细胞。对全部五匹马进行了上呼吸道内窥镜检查，根据Robinson等14的标准评估，其喉功能评分为I级或II.1级。所有马匹对喉返神经电刺激耐受良好，在神经刺激或干细胞注射过程中及之后均未观察到任何不良反应。
所有内窥镜检查均由两名不知分组情况的临床医生进行记录和评分。通过Wilcoxon秩和检验分析15，喉部功能在注射前的评分与干细胞注射后第1天、第7天和第28天的评分之间无显著差异。表1总结了所有马在不同时间点的喉部评分，以及从针头插入至干细胞注射完成的时间和注射细胞时诱发杓状软骨运动的电流强度。
本研究中所使用的细胞系根据先前发表的方案制备7。所有组分中的细胞均具有三系分化能力，表达CD90和CD44，不表达CD45和MHC II，且具有克隆形成能力。选择15–25%组分的细胞进行后续处理，因其表现出最高的CD90表达水平和最强的增殖能力。
本研究的目的并非测试干细胞应用在修复受损外周神经方面的有效性，而仅是验证该操作的可行性，并评估在少量健康马匹中向其喉返神经注射干细胞的安全性。在注射后28天内，5匹马的内窥镜成像均未显示任何功能改变；在注射后长达1年的时间内，其中4匹马均未出现任何临床症状，这证实了该操作的可行性和安全性。在随访期间，有1匹马因与本研究无关的原因被实施了安乐死。尽管这些技术在少量马匹中显示是安全的，但本研究纳入的马匹数量过少，尚不足以排除罕见不良事件的发生可能性。
<table fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td>注射前评分</td>
			<td>注射所需时间（分钟）</td>
			<td>注射时电流（mA）</td>
			<td>注射后第1天评分</td>
			<td>注射后第7天评分</td>
			<td>注射后第28天评分</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse 1 (Standardbred, mare, 16 years old)</td>
			<td>II.1</td>
			<td>12</td>
			<td>0.5</td>
			<td>I</td>
			<td>II.1</td>
			<td>II.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse 2 (Standardbred, mare, 22 years old)</td>
			<td>I</td>
			<td>3</td>
			<td>0.7</td>
			<td>I</td>
			<td>I</td>
			<td>I</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse 3 (Standardbred, mare, 11  years old)</td>
			<td>II.1</td>
			<td>4</td>
			<td>0.5</td>
			<td>II.2</td>
			<td>II.1</td>
			<td>II.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse 4 (Standardbred, mare,  12 years old)</td>
			<td>I</td>
			<td>7</td>
			<td>0.5</td>
			<td>I</td>
			<td>II.1</td>
			<td>I</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse 5 (Standardbred, mare,  10 years old)</td>
			<td>I</td>
			<td>3</td>
			<td>0.7</td>
			<td>II.1</td>
			<td>I</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：马匹的基本信息和喉功能评分。 本表显示了注射时间、注射前引发任何杓状软骨运动的最低电流，以及五匹健康马在注射自体肌肉来源的间充质干细胞至左侧喉返神经附近后，注射前以及注射后第1天、第7天和第28天的喉功能评分。由于与本研究无关的原因，第5号马在注射后第28天未能进行对照评估。评分标准参照Robinson et al.14所述方法：其中，I级表示两侧杓状软骨运动同步且对称，能够实现并维持完全外展；II.1级表示杓状软骨运动存在不同步或在某些时刻出现不对称，但两侧杓状软骨仍能实现并维持完全外展。
<img alt="马心电图测量；兽医操作；心率监测；诊断设备使用。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58023/58023fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 2"> 
图 2：干细胞注射操作过程示意图。 神经刺激针从喉部左侧插入，朝向左侧喉返神经方向进针。神经刺激仪设置为 0.8 mA。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58023/58023fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

本文介绍了一种利用电刺激神经仪将自体来源的肌肉干细胞注射至喉返神经附近的实验方案。该新型技术可能对马喉返神经病变的治疗具有应用价值。

复发性喉返神经病变（RLN）常见于马匹，其特征为异常呼吸音和运动不耐受。复发性喉返神经病变...

该方法有助于解答关于基于干细胞治疗周围神经病变的关键问题，特别是针对马复发性喉神经麻痹的治疗。该技术的主要优势在于干细胞采集过程具有微创性，且该注射方法也可推广应用于其他周围神经病变的治疗。该技术的应用还可拓展至其他细胞类型的研究，因为干细胞在注射前可被诱导分化为其他目标细胞。该方法的可视化演示至关重要，因为通过视频内窥镜控制喉部运动以及掌握神经刺激器操作技术较难学习。通过视诊和触诊确定肱三头肌长头的采样部位，该部位位于肘尖与肩峰之间中点附近。使用电动剪刀剃除约2厘米×2厘米的区域，并对暴露的皮肤使用聚碘液体皂和酒精敷料进行外科擦洗，持续一分钟。使用25号针头，将1毫升2%利多卡因溶液皮下注射至消毒区域中心。用清洁的抗菌洗手液再次消毒，并戴上无菌手套后，将半自动14号活检针放置于一次性无菌洞巾上，拉动弹簧装置使针具处于待发状态。将套管和针芯组装并锁定成穿刺针（套管针），垂直穿过已麻醉的皮肤，插入皮下肌肉组织约1.5厘米深处。然后移除套管针的穿刺针芯，并将针芯放置在无菌巾上。将针头经由套管插入。接着，将针头与套管经皮肤切口插入肌肉，直至针头尖端到达肱三头肌长头的中段位置。然后松开活检针，将针头和套管一起从肌肉中拔出，并将针头从套管中取出。一只手握住针头，另一只手拉动弹簧，直至标本在活检针尖端可见。在助手协助下，打开含有样本保存液的样品管，使用19号皮下注射针头将微小的肌肉组织从活检针转移至采样液中。用螺旋盖盖紧管子，轻轻倾斜管子两次，确保样本悬浮在培养基中。然后重新启动活检针，通过皮肤切口再次插入套管，采集两到三个额外样本，直至获得约20毫克的肌肉组织。注射细胞时，先将细胞悬液升温至室温，用2毫升注射器吸取1毫升细胞，确认马匹处于低头体位，表明已完全镇静。接下来，剪除马左侧喉部区域约20厘米×10厘米范围的毛发，并对暴露区域使用聚碘皂液和酒精进行外科消毒。将一根标准的柔性视频内窥镜经马的左侧鼻孔插入，朝向鼻咽部推进，调整内窥镜位置，直至能够完整观察到两侧的杓状软骨和会厌。将刺激注射针连接至神经刺激器的负极。将含有细胞悬液的注射器连接到注射管路上，并预先填充管路以排出系统中的空气。将神经刺激器的正极连接到将要贴在暴露皮肤区域的电极片上。用与管路预填充体积相等的无菌生理盐水溶液装填一支注射器，并将刺激注射针朝向喉部背外侧推进，在接近喉部背外侧时，启动神经刺激器，设置为1赫兹刺激模式，电流为2毫安。轻柔地将针头移向喉返神经。一旦观察到左侧杓状软骨出现外展运动，立即降低电流，直至运动消失，同时保持针头位置不变。当观察到在0.5毫安电流下运动反应消失时，维持针头位置，注射1毫升自体干细胞，随后注入预先准备好的全部生理盐水体积。在此过程中应保持针头位置稳定，因为神经的距离是通过引发运动反应的电流来控制的，针头的微小移动可能导致反应突然消失。随后拔出针头和内窥镜，并在监测下让马匹恢复。既往研究显示，采样过程中及之后均未观察到不良反应，刺激过程或干细胞注射过程中及之后也未观察到任何炎症反应。此外，声带功能在干细胞注射前的评分与注射后第1天、第7天及第28天的评分之间未测得显著差异。在实施该操作时，需注意干细胞采集过程具有非侵入性，可在较短时间内培养出大量自体来源的间充质干细胞。在此基础上，可进一步采用其他方法，例如注射预先分化的细胞，以探讨施万细胞是否更有可能参与神经再生的调控机制。该技术问世后，为再生医学领域的研究人员探索干细胞在马复发性喉神经麻痹中的应用铺平了道路。

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Research

科研

JoVE Journal

Medicine

医学

神经刺激器引导注射自体干细胞近马左喉返神经

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脊髓内细胞移植用于靶向治疗肌萎缩侧索硬化症和创伤性脊髓损伤中的颈段腹角

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神经营养因子4、渗透泵、肌肉注射、喉肌、衰老、大鼠

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猪模型中甲状腺手术的术中神经监测

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乙醇诱导的颈交感神经节阻滞在利用人工神经促进犬下牙槽神经再生中的应用

本文介绍了一种用于体内连续记录诱发性和自发性肌电位的可植入系统的制造方案。该系统应用于喉部肌肉在神经损伤后重新神经支配过程的研究。...

一种用于慢性活体肌电图记录的可植入系统

在此，我们介绍一种结合了 体内...

颅顶耳长肌体内联合电穿孔与短期再神经支配

我们介绍一种用于大鼠的直接迷走神经注射方案，可将药物直接递送至神经内部，且不会引起注射后的并发症。该方法适用于涉及自主神经系统调控的临床前神经科学研究。通过必要的修改，该技术也可用于大鼠及其他物种其他神经的直接注射。...

大鼠迷走神经直接注射操作方案

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超声心动图引导下靶向且可靠的干细胞心肌内注射在心肌梗死大鼠模型中的应用

学习使用神经刺激器引导注射自体干细胞治疗马左喉返神经病变的方法。该技术通过微创活检采集肌肉源性干细胞，为再生医学研究提供安全有效的治疗手段。

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