高通量DNA提取与基于鳍剪法的3日龄斑马鱼幼鱼基因分型

该方法有助于解答生物医学领域的关键问题，例如利用斑马鱼构建疾病遗传模型。该技术的主要优势在于，能够通过一种简单的高通量方法实现基因型的早期鉴定。

尽管该方法可用于利用斑马鱼遗传性癫痫模型开展广泛的研究，但也可应用于其他遗传病模型以及任何类型的突变研究。通常，初次使用该方法的研究人员可能会遇到困难，因为必须在尾部色素间隙内精确地进行幼鱼鳍的横切。在开始剪切斑马鱼幼鱼的鳍之前，应准备好解剖表面。

将一段高压灭菌指示胶带贴在直径九厘米的培养皿盖内表面，并将皿盖置于体视显微镜下。为减少对3天龄幼鱼的损伤，可将P1000移液器吸头末端剪去，使其直径达到2毫米，以适配幼鱼。将受精后3至5天（dpf）的斑马鱼幼鱼放入培养皿中，并用含1.5毫摩尔三卡因的1x E3胚胎培养基进行麻醉。

使用改良的 P1000 微量移液器，吸取并麻醉斑马鱼幼体，将其放置于培养皿盖上已定位的灭菌胶带位置。去除幼体周围多余的三卡因溶液。操作区域应尽可能干燥，以确保成功切取和拾取鳍组织，但需保持一定湿润以维持幼体存活。

为避免出血并确保幼鱼在鳍条剪取过程中的存活，截断必须在色素间隙内进行，即位于血液循环范围的远端，如本图所示。在体视显微镜下操作，使用显微手术刀切断尾鳍。

切口时，应施加稳定而轻柔的向下压力，以避免损伤脊索。在显微镜下观察已切下的鳍组织，将其放置在显微手术刀片尖端上方。将带有鳍组织的显微手术刀置于一小片滤纸表面。

由于截取的组织中含有黑色素细胞，鳍组织呈现为一个小黑点。为确保DNA提取成功，在继续后续操作前，必须观察到滤纸上留有标记鳍组织位置的黑点。使用剪刀和镊子将含有鳍组织的滤纸转移至96孔PCR板的一个孔中，该孔内已加入25 µL的50 mmol/L氢氧化钠溶液。

接下来，准备一个平底96孔组织培养板，根据PCR板的标签对各孔进行编号。使用已装入200 µL新鲜E3胚胎培养基的改良P1000移液器，通过轻柔施加压力小心吸取斑马鱼幼鱼。将幼鱼接种至96孔板中，确保其孔位编号与PCR板一致。

确保含有鱼鳍的滤纸完全浸没在溶液中。为防止每次切割之间的交叉污染，将显微手术刀片和镊子浸入70%乙醇溶液中进行清洁。用干净的纸巾擦拭刀片。

当所有幼鱼完成剪取后，将幼鱼存放在96孔板中，于28摄氏度条件下保存，直至确定其基因型。开始此操作时，先密封含有鳍条组织的96孔PCR板，并以1000 ×g离心样品1分钟。确保所有滤纸均完全浸入氢氧化钠溶液中。

进行组织裂解时，将样品置于热循环仪中，95摄氏度加热5分钟，随后冷却至4摄氏度，持续10分钟。接下来，向每个样品中加入6微升500毫摩尔的Tris-HCl（pH 8.0）。

涡旋混匀样品。在室温下，以1500 × g短暂离心5分钟。采用此方法提取基因组DNA时，剪取鱼鳍组织（操作如前所述），并将带有剪下的鱼鳍组织的滤纸放入96孔PCR板的孔中，每孔预先加入30 µL 5%螯合树脂。

所有鳍条样本剪取完毕后，密封96孔PCR板，并短暂离心样品，确保所有滤纸片均浸没于螯合树脂中。将样品置于PCR仪中，95摄氏度加热15分钟，随后降温至4摄氏度，保持10分钟。短暂离心样品，使树脂微珠沉淀，从而获得悬浮液中的DNA。

多重 PCR 检测将能够区分纯合突变体、杂合子和野生型幼虫。按照文本方案中详述的步骤设置 PCR 反应。在 96 孔热循环仪中进行 PCR 反应。

用含1x Gel Red的硼酸钠缓冲液配制1%琼脂糖凝胶。为加快实验进程，若条件允许，建议使用可兼容多通道移液器的凝胶电泳系统，以通过减少加样时间提高通量。在1x硼酸钠缓冲液中以250伏电压电泳运行15分钟。

在紫外光下成像凝胶，以区分不同基因型。按照文本方案所述，使用1.5毫米间隔板和15孔样品梳制备两块12%聚丙烯酰胺凝胶，开始本实验。采用垂直电泳系统，并以1× TBE缓冲液作为电泳运行缓冲液。

按照文本方案进行PCR反应后，将PCR产物在94摄氏度加热5分钟，随后在4摄氏度冷却10分钟。每份PCR样品上样10微升，分子量标记物上样8微升。以150伏电压电泳1小时，或直至分子量标记物接近玻璃板底部边缘。

在紫外光下成像凝胶，以区分不同基因型。本实验方案用于对杂合子交配后代进行基因分型，其中突变型回肠在 aldh7a1 基因的第一编码外显子中插入了5个碱基对。对野生型和突变型回肠进行PCR扩增后，预期结果均为434 bp的扩增片段。

扩增突变型回肠基因片段产生一条293 bp的条带，而野生型回肠基因片段则得到一条195 bp的条带。通过1%琼脂糖硼酸凝胶对PCR反应产物进行分析，结果显示：第2道和第6道为野生型基因型，第3、4、5道为杂合型基因型，第1道为纯合突变型基因型。多种突变均通过异源双链熔解曲线分析进行了基因分型。

plpbp基因的plpbpot101和plpbpot102突变型回肠各自导致移码突变和提前终止密码子。经过变性和退火后，杂合子动物的PCR片段将包含异源双链和同源双链DNA，可通过聚丙烯酰胺凝胶电泳轻松分离并可视化。复合杂合突变基因型出现在第2、4、8泳道，杂合基因型出现在第3、6、7、9、10泳道，野生型基因型出现在第5泳道。

一旦掌握，若操作得当，使用该技术对 96 条幼鱼进行鳍剪切可在一小时之内完成。在完成该步骤后，可进一步开展其他方法，例如将相同基因型的斑马鱼幼鱼合并用于组织提取，并依序进行以回答更多科学问题，如生物标志物研究和疾病模型分析。该技术建立后，为代谢性癫痫模型领域的研究铺平了道路，推动了利用斑马鱼探索疾病病理生理机制的相关研究。

观看本视频后，您应能够充分掌握如何通过尾鳍显微解剖对三天龄的斑马鱼幼鱼进行准确的基因分型。