Name: 3dpf 斑马鱼幼虫的高通量 DNA 提取及基因分型研究 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 12 s
Description: 学习斑马鱼幼虫尾鳍剪切高通量基因分型方法，用于72小时受精后早期基因型鉴定。该技术支持遗传性疾病模型研究，简化Danio rerio基因功能分析流程。

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作者感谢罕见病模型与机制（RDMM）网络（由加拿大卫生研究院（CIHR）和基因组加拿大资助）。CK 获得渥太华大学本科生科研奖学金（UROP）的支持。DLJ 获得加拿大研究生范尼尔奖学金的支持。IAP 获得加拿大卫生研究院（CIHR）博士后奖学金的支持。作者感谢美国遗传学学会授权发表本方案，并授权使用 Pena 等人补充图 5 的改编版本。 等.

涉及动物实验的操作均已获得批准，并符合加拿大动物护理委员会和渥太华大学动物护理委员会提供的动物护理指南。
1. 准备
<ol>
	<li>用 autoclave 胶带将一个 9 cm 培养皿盖的内表面贴好，作为解剖面，并将其置于体视显微镜下。</li>
	<li>将受精后 3 - 5 天（dpf）的斑马鱼幼鱼放入培养皿中，并在含 ˜1.5 mM Tricaine 的 1x E3 胚胎培养基（5 mM NaCl、0.17 mM KCl、0.33 mM CaCl2、0.33 mM MgSO4，pH 7.2）中进行麻醉。</li>
	<li>使用剪刀或刀片将 P1000 移液器吸头末端剪开，使其直径约为 2 mm，以便在最小应激条件下容纳一条 3 dpf 的幼鱼。</li>
</ol>
2. 斑马鱼幼鱼的鳍部剪切
<ol>
	<li>使用改装过的 P1000 移液枪吸取一条已麻醉的幼鱼，并将其放置在培养皿盖上预先固定好的灭菌胶带上。</li>
	<li>用移液枪吸除幼鱼周围多余的三卡因溶液。操作区域应尽可能干燥，以便顺利切取和拾取尾鳍，但仍需保持一定湿润以确保幼鱼存活。</li>
	<li>在体视显微镜下使用显微手术刀按照 图1 所示位置切取尾鳍，操作方法参照 Wilkinson&#160;et al16 的描述。切割时，在尾鳍色素间隙区域施加稳定向下的压力，位置应位于血液循环边界远端（图1A）。操作过程中需施加轻柔压力，避免损伤脊索。</li>
	<li>在显微镜下观察切下的尾鳍，并将其移至显微手术刀刀尖表面（图2A）。将带有尾鳍的手术刀轻轻接触一小片滤纸表面。 
	注：由于被切断的组织中含有黑色素细胞，此步骤中尾鳍可呈现为一个小黑点，便于观察（图2B）。</li>
	<li>使用剪刀和镊子（图2C）将带有尾鳍的滤纸转移至 96 孔 PCR 板中，每孔预先加入 25 μL 的 50 mM NaOH 溶液（图2D）。</li>
	<li>准备一个平底 96 孔板，并按 PCR 板的编号对孔位进行标记。使用改装过的 P1000 移液枪吸取 200 µL 新鲜的 1× E3 胚胎培养液，通过轻柔负压小心吸取斑马鱼幼鱼，并将其释放至组织培养板中与 PCR 板相对应编号的孔内（图2E）。</li>
	<li>确保滤纸完全浸没于溶液中（图2F）。每次切割后，需将显微手术刀刀片和镊子浸入 70% 乙醇溶液中清洗，以防止交叉污染，并用洁净的纸巾或擦拭布擦干刀片。</li>
	<li>重复步骤 2.1 至 2.7，直至完成所有胚胎的尾鳍取样。</li>
	<li>将幼鱼保留在 96 孔板中，于 28 °C 条件下培养，直至完成基因型鉴定。 
	注：由于该操作可在两天内快速完成，无需更换培养液；若需更长时间，则建议更换培养液。</li>
</ol>
3. 基因组DNA提取
<ol>
	<li>密封96孔PCR板，并以1,000 × g离心样品1分钟，确保所有滤纸均浸入NaOH溶液中。</li>
	<li>为进行组织裂解，将样品在PCR仪中95 °C加热5分钟，随后冷却至4 °C，保持10分钟。</li>
	<li>向每个样品中加入6 μL 500 mM Tris-HCl（pH 8.0），涡旋混匀。</li>
	<li>在室温下以1,500 × g短暂离心5分钟。</li>
	<li>每项PCR反应使用1.5 μL DNA上清液。</li>
	<li>按照表1-2所示方法进行PCR以对幼鱼进行基因分型。 
	注意：本方案已用于两个应用方向：通过琼脂糖凝胶检测基因型的多重PCR反应9，以及通过聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）检测基因型的异源双链熔解曲线分析（HMA）17。</li>
</ol>
4. 使用螯合树脂的基因组替代提取方法
<ol>
	<li>通过将剪下的鱼鳍连同滤纸条加入含有 30 μL 5% 螯合树脂（含成对亚氨基二乙酸离子的苯乙烯-二乙烯基苯共聚物）的 96 孔 PCR 板中，完成步骤 2.5。 
	注意：此类树脂通常用于组织裂解及快速高效地制备可用于 PCR 的 DNA18。</li>
	<li>按照所示步骤 2.6 - 2.8 操作。</li>
	<li>密封 96 孔 PCR 板，并短暂离心样品，确保所有滤纸条均浸没于螯合树脂中。</li>
	<li>为进行组织裂解，将样品在热循环仪中于 95 °C 加热 15 分钟，随后冷却至 4 °C，持续 10 分钟。 
	注意：此步骤可实现细胞裂解，同时使极性树脂微珠与细胞组分结合，而 DNA 和 RNA 保留在溶液中。</li>
	<li>短暂离心样品，使树脂微珠沉淀，从而获得悬浮液中的 DNA。</li>
	<li>按照步骤 3.5 - 3.6 完成基因分型流程。</li>
</ol>
5. 应用示例1：多重PCR扩增后进行琼脂糖凝胶分析
<ol>
	<li>随后 表1，建立多重 PCR 反应以区分纯合突变体、杂合子和野生型幼鱼。使用 96 孔热循环仪进行 PCR 扩增，并采用如下所述的循环条件 表3. 
	注意：PCR 反应也可在任何其他常规 PCR 扩增仪中进行。本示例描述了 Pena 所采用的 PCR 策略。 等9 用于鉴定 aldh7a1 野生型和5个碱基对插入突变等位基因在同一多重反应中。</li>
	<li>在硼酸钠缓冲液中制备含1%琼脂糖的凝胶，并加入1× GelRed染色。 
	注意：20倍浓度的硼酸钠缓冲液储备液由40 mL 10 M NaOH和1800 mL ddH₂O组成。2O，用76 g硼酸将pH调至8.5，然后用ddH₂O定容至2 L2O.</li>
	<li>在1×硼酸钠缓冲液中以250 V电压电泳15分钟。为加快流程，若条件允许，使用可兼容多通道移液器的凝胶系统，以减少加样时间，提高通量。</li>
	<li>在紫外光（UV）下成像凝胶，以区分不同基因型。</li>
</ol>
6. 应用2：异源双链熔解分析
<ol>
	<li>使用1.5 mm间隔板和15孔梳子制备12%的PAGE凝胶。制备两块PAGE凝胶，每块加入12.21 mL去离子水（ddH2O）、2.52 mL 10x Tris/硼酸/EDTA（TBE）缓冲液、10 mL 30%丙烯酰胺溶液、250 μL 10%过硫酸铵（APS）和20 μL四甲基乙二胺（TEMED）。电泳运行缓冲液使用1x TBE缓冲液（0.089 M Tris-HCl、0.089 M硼酸和0.002 M乙二胺四乙酸（EDTA））。</li>
	<li>将PCR产物在94 °C加热5分钟。</li>
	<li>将离心管置于冰上或在4 °C的PCR仪中冷却10分钟。</li>
	<li>每份PCR样品上样10 μL，分子量标记物上样8 μL。</li>
	<li>在垂直电泳系统中，以1x TBE缓冲液为运行缓冲液，150 V恒压电泳1小时，或直至分子量标记物接近玻璃板底部边缘。</li>
	<li>在紫外光下成像凝胶，以区分不同基因型。</li>
</ol>

<ol><li>Howe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+reference+genome+sequence+and+its+relationship+to+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome.</a> Nature. 496 (7446), (2013).</li>
<li>Stewart, A. M., Kalueff, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developing+better+and+more+valid+animal+models+of+brain+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Behav+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Developing better and more valid animal models of brain disorders.</a> Behav Brain Res. 276, 28-31 (2015).</li>
<li>Grone, B. P., Baraban, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+in+epilepsy+research%3A+legacies+and+new+directions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Animal models in epilepsy research: legacies and new directions.</a> Nat Neurosci. 18 (3), 339-343 (2015).</li>
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<li>Doyon, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heritable+targeted+gene+disruption+in+zebrafish+using+designed+zinc-finger+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Heritable targeted gene disruption in zebrafish using designed zinc-finger nucleases.</a> Nat Biotechnol. 26 (6), 702-708 (2008).</li>
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<li>Zabinyakov, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+first+knock-out+aldh7a1+zebrafish+model+for+pyridoxine-dependent+epilepsy+using+CRISPR-Cas9+technology%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Characterization of the first knock-out aldh7a1 zebrafish model for pyridoxine-dependent epilepsy using CRISPR-Cas9 technology.</a> PLoS One. 12 (10), 1-14 (2017).</li>
<li>Grone, B. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epilepsy%2C+behavioral+abnormalities%2C+and+physiological+comorbidities+in+syntaxin-binding+protein+1+%28STXBP1%29+mutant+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Epilepsy, behavioral abnormalities, and physiological comorbidities in syntaxin-binding protein 1 (STXBP1) mutant zebrafish.</a> PLoS One. 11 (3), (2016).</li>
<li>Kawakami, K., Hopkins, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+identification+of+transgenic+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">Rapid identification of transgenic zebrafish.</a> Trends Genet. 12 (1), 9-10 (1996).</li>
<li>Wilkinson, R. N., Elworthy, S., Ingham, P. W., van Eeden, F. J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+high-throughput+PCR-based+genotyping+of+larval+zebrafish+tail+biopsies%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">A method for high-throughput PCR-based genotyping of larval zebrafish tail biopsies.</a> Biotechniques. 55 (6), 314-316 (2013).</li>
<li>Zhu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+genotyping+method+for+genome-modified+animals+and+human+cells+generated+with+CRISPR%2FCas9+system%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">An efficient genotyping method for genome-modified animals and human cells generated with CRISPR/Cas9 system.</a> Sci Rep. 4, 6420(2014).</li>
<li>Walsh, P. S., Metzger, D. A., Higuchi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chelex+100+as+a+medium+for+simple+extraction+of+DNA+for+PCR-based+typing+from+forensic+material%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Chelex 100 as a medium for simple extraction of DNA for PCR-based typing from forensic material.</a> Biotechniques. 54 (3), 506-513 (2013).</li>
<li>Ewing, B., Green, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basecalling+of+automated+sequencer+traces+using+phred.+II.+Error+probabilities%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Basecalling of automated sequencer traces using phred. II. Error probabilities.</a> Genome Res. 8, 175-185 (1998).</li>
</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

近年来，基因编辑工具已被用于在斑马鱼中精确引入突变和转基因5,6,7,8在斑马鱼中进行疾病建模时，通常会观察到早期幼虫或幼体表型9,12,13,14本方案描述了从小型斑马鱼幼体尾部活检样本中提取可用于PCR的DNA，能够对低至3天龄的幼体进行基因分型。早期鉴定基因型对于多种实验室应用至关重要，尤其是在 事后检验 基因分型无法实现9从早期开始了解基因型也有助于突变体的存活率研究和表型分析。本方案对于将特定基因型的幼鱼培育至成体阶段也尤为有用。目前，幼鱼基因分型技术尚未...

斑马鱼（Danio rerio）是一种被广泛用作疾病研究以及治疗假设临床前测试模型的脊椎动物1,2,3。这类动物具有繁殖周期短、易于操作、繁殖率高、成本低等优点，并且可通过胚胎显微注射DNA的方式方便地进行遗传操作4。随着锌指核酸酶（Zinc-Finger nucleases, ZFN）5、类转录激活因子效应物核酸酶（TAL-like Effector Nucleases, TALENs）6,7以及成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）/CRISPR相关蛋白9（Cas9）系统8等新型转基因和基因编辑技术的不断发展，斑马鱼有望显著促进人们对多种病理状态的理解。这些技术已被用于在斑马鱼的体细胞和生殖细胞中高效构建靶向基因敲除模型，从而成功获得遗传修饰动物8。文献中近期的例子包括在斑马鱼中成功建立癫痫和代谢性疾病的遗传模型3,9,10,11,12。
随着斑马鱼基因组编辑技术的进步，快速且可靠的基因分型已成为不可忽视的限速步骤。鉴定预测基因组编辑靶点附近特定DNA突变是该实验方案中的关键环节。传统上，通过鳍条剪取进行基因分型的技术通常仅在幼年或成年斑马鱼中实施。然而，将斑马鱼培养至成年所需的时间（&#62;2个月）会显著延缓研究进展。在许多情况下，由于关键基因被敲除，个体无法达到成年阶段（例如， 在疾病建模中）或导致有害表型效应的获得功能突变。此外，某些检测需要合并幼虫样本，例如进行RNA或代谢物提取时，因此需预先确定基因型，而当仅 事后检验 基因分型技术已有多种可用方法。上述例子凸显了幼体基因分型技术的重要性，这类技术需兼具精确性，同时能够实现幼体的完全回收和正常发育。目前，早期斑马鱼幼体的基因分型尚未得到广泛应用；这一点在近期发表的疾病模型研究中有所体现，这些研究通常通过死后基因分型来确定幼体基因型，而非在实验开始前进行基因分型。12,13,14本文提出了一种幼体鳍条剪切策略，旨在改进既往已建立的基因分型流程。
过去，采用蛋白酶K消化法对活体斑马鱼幼鱼进行基因分型的策略，导致了聚合酶链式反应（PCR）效率不稳定15。尽管最近发表的一种显微尾部活检技术取得了更有希望的结果16，但我们和其他研究团队均未能重现作者所报告的高效率和DNA回收率。Wilkinson &#160;et al.16所述方案的一个主要缺陷可能是将尾部组织转移至PCR管的过程。由于组织尺寸极小，难以确保鳍组织被准确采集并通过移液操作转移。为克服这一障碍，我们开发了一种改进的方案，可对大量活体斑马鱼幼鱼进行基因分型，效率接近100%9。使用显微手术刀切除尾鳍尖端，并将其放置在滤纸片上。含有组织的滤纸片可被清晰观察，并能准确地置入PCR管中。随后进行基因组DNA提取，并通过PCR扩增目标区域以完成样本的基因分型。该方法的优势包括PCR效率高、假阳性率低以及死亡率低。此外，该方案适用于对大量胚胎进行基因分型。本文所述方案可在2至3小时内完成数百尾幼鱼的鳍组织剪取，并可在两天内准确鉴定基因型及尾鳍再生情况。

<table><tbody><tr><td>培养皿</td><td>Corning</td><td>430167</td><td></td></tr><tr><td>微型手术刀</td><td>World Precision Instruments</td><td>500249</td><td></td></tr><tr><td>体视显微镜</td><td>Nikon</td><td>SMZ1500</td><td></td></tr><tr><td>三卡因/甲磺酸乙酯-3-氨基苯甲酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E10521</td><td></td></tr><tr><td>96孔组织培养板</td><td>Costar</td><td>3595</td><td></td></tr><tr><td>96孔PCR板</td><td>Fisher</td><td>14230232</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Fisher</td><td>S25548A&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Tris碱&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher</td><td>BP358-10</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>230391</td><td></td></tr><tr><td>5% Chelex 100 钠型</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7901</td><td></td></tr><tr><td>GelRed 1x</td><td>Biotium</td><td>41003</td><td></td></tr><tr><td>硼酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B6768</td><td></td></tr><tr><td>Sub-Cell Model 192 系统</td><td>Bio-Rad&amp;nbsp;</td><td>1704508</td><td></td></tr><tr><td>30% 丙烯酰胺/双丙烯酰胺溶液，37.5:1</td><td>Bio-Rad&amp;nbsp;</td><td>1610158</td><td></td></tr><tr><td>GoTaq Green Master Mix, 2X</td><td>Promega</td><td>M7123</td><td></td></tr><tr><td>纸巾（Kimwipes&amp;reg; 一次性擦拭纸）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z188956</td><td></td></tr><tr><td>1kb-plus 分子量标记物&amp;nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>SM1343</td><td></td></tr><tr><td>无核酸酶水&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W4502</td><td></td></tr><tr><td>Sub-Cell Model 192 系统（高通量琼脂糖凝胶系统）</td><td>Bio-Rad&amp;nbsp;</td><td>1704508</td><td></td></tr><tr><td>垂直凝胶电泳系统 Mini-PROTEAN Tetra Cell&amp;nbsp;</td><td>Bio-Rad&amp;nbsp;</td><td>1658004</td><td></td></tr></tbody></table>

高通量dna提取与基于鳍剪法的3日龄斑马鱼幼鱼基因分型

High-throughput DNA Extraction and Genotyping of 3dpf Zebrafish Larvae by Fin Clipping

斑马鱼（Danio rerio）拥有与人类疾病相关基因中84%的直系同源基因。此外，这类动物世代周期短，易于操作，繁殖率高，饲养成本低，并可通过向胚胎显微注射DNA的方式方便地进行遗传操作。近年来基因编辑工具的进步使得在斑马鱼中精确引入突变和转基因成为可能。斑马鱼疾病模型常导致幼体出现表型变化或早期死亡，若基因型未知，则表型解读可能面临挑战。在需要样本合并的实验中（如基因表达分析或质谱研究），也需尽早确定基因型。然而，传统的基因型鉴定方法通常仅适用于成年斑马鱼或死亡后的幼鱼，限制了大规模基因分型的应用。为解决这一问题，我们改进了一种可在受精后72小时（hpf）即对活体斑马鱼幼鱼提取可用于PCR的基因组DNA的方法。该技术在先前发表的基因分型方案基础上进行了优化，具有省时、经济的优点，可利用显微取样的鳍组织进行基因型鉴定。幼鱼的鳍组织在取样后能够迅速再生。研究人员由此可借助这一高通量的基于PCR的基因分型流程，筛选并培育具有目标基因型的个体至成年阶段。

通过对抗杂合子杂交后代进行基因分型，验证了该方案的效率（aldh7a1+/ot100，此处显示为 aldh7a1+/-) (图3A- C)9。该 aldh7a1ot100 突变等位基因在斑马鱼的第一个编码外显子中插入了5个碱基对（bp） aldh7a1 导致移码并因提前出现终止密码子而丧失功能的基因9使用四条引物进行多重反应，获得三条不同的条带，以区分野生型（WT）、杂合子（heterozygous）aldh7a1+/-），以及纯合突变型（aldh7a1-/-）基因型（来自 Pena， 等<sup class="xref...

斑马鱼已被广泛用作生物医学研究中可靠的遗传学模式生物，尤其是在基因编辑技术出现之后。当预期出现幼体表型时，DNA 提取和基因型鉴定可能具有挑战性。本文介绍了一种高效的斑马鱼幼体基因分型方法，可在受精后 72 小时即通过尾部剪切进行。

高通量DNA提取与基于鳍剪法的3日龄斑马鱼幼鱼基因分型

斑马鱼（Danio rerio）拥有与人类疾病相关基因中84%的同源基因。此外，这些动物具有较短的……

该方法有助于解答生物医学领域的关键问题，例如利用斑马鱼构建疾病遗传模型。该技术的主要优势在于，能够通过一种简单的高通量方法实现基因型的早期鉴定。尽管该方法可用于利用斑马鱼遗传性癫痫模型开展广泛的研究，但也可应用于其他遗传病模型以及任何类型的突变研究。通常，初次使用该方法的研究人员可能会遇到困难，因为必须在尾部色素间隙内精确地进行幼鱼鳍的横切。在开始剪切斑马鱼幼鱼的鳍之前，应准备好解剖表面。将一段高压灭菌指示胶带贴在直径九厘米的培养皿盖内表面，并将皿盖置于体视显微镜下。为减少对3天龄幼鱼的损伤，可将P1000移液器吸头末端剪去，使其直径达到2毫米，以适配幼鱼。将受精后3至5天（dpf）的斑马鱼幼鱼放入培养皿中，并用含1.5毫摩尔三卡因的1x E3胚胎培养基进行麻醉。使用改良的 P1000 微量移液器，吸取并麻醉斑马鱼幼体，将其放置于培养皿盖上已定位的灭菌胶带位置。去除幼体周围多余的三卡因溶液。操作区域应尽可能干燥，以确保成功切取和拾取鳍组织，但需保持一定湿润以维持幼体存活。为避免出血并确保幼鱼在鳍条剪取过程中的存活，截断必须在色素间隙内进行，即位于血液循环范围的远端，如本图所示。在体视显微镜下操作，使用显微手术刀切断尾鳍。切口时，应施加稳定而轻柔的向下压力，以避免损伤脊索。在显微镜下观察已切下的鳍组织，将其放置在显微手术刀片尖端上方。将带有鳍组织的显微手术刀置于一小片滤纸表面。由于截取的组织中含有黑色素细胞，鳍组织呈现为一个小黑点。为确保DNA提取成功，在继续后续操作前，必须观察到滤纸上留有标记鳍组织位置的黑点。使用剪刀和镊子将含有鳍组织的滤纸转移至96孔PCR板的一个孔中，该孔内已加入25 µL的50 mmol/L氢氧化钠溶液。接下来，准备一个平底96孔组织培养板，根据PCR板的标签对各孔进行编号。使用已装入200 µL新鲜E3胚胎培养基的改良P1000移液器，通过轻柔施加压力小心吸取斑马鱼幼鱼。将幼鱼接种至96孔板中，确保其孔位编号与PCR板一致。确保含有鱼鳍的滤纸完全浸没在溶液中。为防止每次切割之间的交叉污染，将显微手术刀片和镊子浸入70%乙醇溶液中进行清洁。用干净的纸巾擦拭刀片。当所有幼鱼完成剪取后，将幼鱼存放在96孔板中，于28摄氏度条件下保存，直至确定其基因型。开始此操作时，先密封含有鳍条组织的96孔PCR板，并以1000 ×g离心样品1分钟。确保所有滤纸均完全浸入氢氧化钠溶液中。进行组织裂解时，将样品置于热循环仪中，95摄氏度加热5分钟，随后冷却至4摄氏度，持续10分钟。接下来，向每个样品中加入6微升500毫摩尔的Tris-HCl（pH 8.0）。涡旋混匀样品。在室温下，以1500 × g短暂离心5分钟。采用此方法提取基因组DNA时，剪取鱼鳍组织（操作如前所述），并将带有剪下的鱼鳍组织的滤纸放入96孔PCR板的孔中，每孔预先加入30 µL 5%螯合树脂。所有鳍条样本剪取完毕后，密封96孔PCR板，并短暂离心样品，确保所有滤纸片均浸没于螯合树脂中。将样品置于PCR仪中，95摄氏度加热15分钟，随后降温至4摄氏度，保持10分钟。短暂离心样品，使树脂微珠沉淀，从而获得悬浮液中的DNA。多重 PCR 检测将能够区分纯合突变体、杂合子和野生型幼虫。按照文本方案中详述的步骤设置 PCR 反应。在 96 孔热循环仪中进行 PCR 反应。用含1x Gel Red的硼酸钠缓冲液配制1%琼脂糖凝胶。为加快实验进程，若条件允许，建议使用可兼容多通道移液器的凝胶电泳系统，以通过减少加样时间提高通量。在1x硼酸钠缓冲液中以250伏电压电泳运行15分钟。在紫外光下成像凝胶，以区分不同基因型。按照文本方案所述，使用1.5毫米间隔板和15孔样品梳制备两块12%聚丙烯酰胺凝胶，开始本实验。采用垂直电泳系统，并以1× TBE缓冲液作为电泳运行缓冲液。按照文本方案进行PCR反应后，将PCR产物在94摄氏度加热5分钟，随后在4摄氏度冷却10分钟。每份PCR样品上样10微升，分子量标记物上样8微升。以150伏电压电泳1小时，或直至分子量标记物接近玻璃板底部边缘。在紫外光下成像凝胶，以区分不同基因型。本实验方案用于对杂合子交配后代进行基因分型，其中突变型回肠在 aldh7a1 基因的第一编码外显子中插入了5个碱基对。对野生型和突变型回肠进行PCR扩增后，预期结果均为434 bp的扩增片段。扩增突变型回肠基因片段产生一条293 bp的条带，而野生型回肠基因片段则得到一条195 bp的条带。通过1%琼脂糖硼酸凝胶对PCR反应产物进行分析，结果显示：第2道和第6道为野生型基因型，第3、4、5道为杂合型基因型，第1道为纯合突变型基因型。多种突变均通过异源双链熔解曲线分析进行了基因分型。plpbp基因的plpbpot101和plpbpot102突变型回肠各自导致移码突变和提前终止密码子。经过变性和退火后，杂合子动物的PCR片段将包含异源双链和同源双链DNA，可通过聚丙烯酰胺凝胶电泳轻松分离并可视化。复合杂合突变基因型出现在第2、4、8泳道，杂合基因型出现在第3、6、7、9、10泳道，野生型基因型出现在第5泳道。一旦掌握，若操作得当，使用该技术对 96 条幼鱼进行鳍剪切可在一小时之内完成。在完成该步骤后，可进一步开展其他方法，例如将相同基因型的斑马鱼幼鱼合并用于组织提取，并依序进行以回答更多科学问题，如生物标志物研究和疾病模型分析。该技术建立后，为代谢性癫痫模型领域的研究铺平了道路，推动了利用斑马鱼探索疾病病理生理机制的相关研究。观看本视频后，您应能够充分掌握如何通过尾鳍显微解剖对三天龄的斑马鱼幼鱼进行准确的基因分型。

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Research

科研

JoVE Journal

Genetics

遗传学

3dpf 斑马鱼幼虫的高通量 DNA 提取及基因分型研究

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