活的嗅觉途径的功能评价

此方法可用于回答神经生物学领域的关键问题，例如前突触终端在体内如何发挥作用。这组技术的主要优点是，我们展示使用 Xenopus 蛾作为动物模型的嗅觉途径功能的免费方法。演示这个程序将是我自己，比阿特丽斯·特尼和保罗·帕乔拉。

在0.02%MS2 22麻醉溶液中润湿两片纤维素定性滤纸，并将它们置于解剖范围内，开始转切过程。然后从水箱中挑选一只小虫子，然后浸入麻醉液的盘中。小鱼应该在两到四分钟内停止游泳。

检查是否适当的麻醉，没有反应在尾部水平应用的机械刺激使用钳子。将麻醉的小虫子放在范围下的滤纸上。将动物的后侧朝上放置，以便可以可视化大脑结构。

对于行为实验，使用病毒剪刀将两种神经转开，以抑制到达嗅觉球的所有气味信息。用两升绿色钙溶液装装一个带状玻璃移液器，并放在微反应器中。在解剖显微镜下将麻醉的小虫子放在滤纸上，然后将移液器的尖端移入鼻腔的主要腔中，并交付0.15至0.3微升的染料。

将小虫子留在位两到三分钟。使用巴斯德移液器，将 0.02%MS2 22 溶液滴到动物的更溺爱部位，以避免干燥。将动物转移到恢复罐，在10分钟左右内，小动物应该恢复正常游泳。

在注射后的第二天观察嗅球状层的荧光。首先取出嗅觉球上方的皮肤，准备麻醉的蛾进行成像。使用尼丝剪刀在嗅球水平的中枢神经系统边缘的蛾子皮肤上做一个横向切口。

避免将切口扩展到 tectum，这可以通过视神经的位置轻松识别。使用巴斯德移液器涂抹 0.02%MS2 22 溶液，然后用钳子捏捏切皮，将其拉过神经系统，以保持动物湿润。通过嗅觉球上方没有黑色素细胞来验证成功去除。

将小虫子放入细胞护罩涂层盘的井中。放置涂有高真空润滑脂的玻璃盖滑，以将端部顶部覆盖到尾部的尾部。确保嗅觉灯泡和球茎仍然暴露在细胞外介质中。

用含有100微摩尔块黄素的Xenopus林格溶液填充皮里菜，以防止肌肉收缩。将盘子放在直立显微镜下。使用聚乙烯管将含有 Xenopus Ringer 溶液的储液罐与碟子连接，以连续大量注入 Xenopus Ringer 溶液。

开始使用 Xenopus 林格的解决方案。在整个实验中保持菜中溶液的恒定水平。通过观察血管中的血液循环，持续评估小矮人的可行性。

使用低放大镜目标开始实时成像，以可视化小矮人。移动微操纵轴，将提供气味溶液的毛细管放在一个鼻腔的顶部，与嗅觉神经形成 90 度角。找到嗅觉灯泡位于鼻腔。

切换到具有长工作距离的高放大水目标。检查光节的光常辐射应明显。首先将20毫升新鲜氨基酸溶液移液到高架储液罐中。

然后从房屋水箱中拿出六只食物，将它们放在两升干净的小虫子水中，以尽量减少接触异味剂。将经过修改的六井盘放在白色 LED 转发光器上。在每一个井里装满10毫升的水。

每井放置一根小虫子，然后离开休息至少三分钟。开始图像采集并获取包含基础、刺激和恢复周期的电影。一种有吸引力的反应可以检测为向喷嘴移动，提供氨基酸溶液。

成像后将动物返回到他们的水箱。跟踪 35 毫米 x 35 毫米区域内的蛾头位置，或等值大小（以像素为单位）内，可以定量分析嗅觉引导行为。虚线表示气味溶液入口的近位区域。

使用图像分析获得的 X Y 坐标构造了小极运动的单个绘图。提取的动能图必须忠实地再现视频图像。以溶液入口为中心的8.75毫米半径的感兴趣区域用于对动物与气味源的接近进行分类。

在气味喷头附近花费更多的时间表明有正的tropism。在定义的时间段内，喷嘴附近的小蛾所花费的时间（例如，15 秒的间隔）可以识别检测氨基酸溶液的能力。通过绘制单个数据的分布，可以获取种群的总体行为。

当氨基酸溶液以一毫摩尔或160微摩尔为单位时，可以检测到正性tropism。动物对水的应用没有反应。按照这个程序，其他方法，如组织学技术或电生理学，可以执行回答其他问题，如受伤后突触属性的改变。

该技术开发后，为神经生物学领域的研究人员探索Xenopus tad的嗅觉信息处理铺平了道路。