利用下一代序列染色体构象捕获 (4 c 序列) 的高通量识别基因调控数列

此方法可以回答转录调控领域中的关键问题，例如染色质相互作用的作用。这种技术的主要优点是，它为感兴趣的一个中心提供了相对公正的交互捕获。虽然此方法可以提供对促进剂增强剂相互作用的洞察，但它也可以用于识别其他类型的染色质相互作用。

通常，对此方法的个体将难以操作，因为协议需要几天时间，并且底法设计需要试验和错误以及非典型底法方向。为了保持选择细胞中的染色质相互作用，通过每1000万细胞在PBS中加入9.5毫升1%电子显微镜级甲醛来交叉链接它们。在室温下摇动10分钟时孵育细胞。

将反应管转移到冰中，以淬火交汇反应，将冰冷一摩尔甘油加入0.125摩尔的最终浓度，然后轻轻反转混合。在根据文本协议离心和清洗细胞后，用0.5%SDS和一种X蛋白酶抑制剂将颗粒悬浮在5毫摩尔EDTA的125微升中。在冰上孵育细胞悬浮液10分钟。

为确保细胞 lyse 完整，在显微镜幻灯片上将六个微升的细胞与六个微升的 trypan 蓝色混合，并盖上盖板。在显微镜下查看，查看被解的细胞内部为蓝色，未解白细胞为白色。对于第一个限制消化添加30微升10X限制酶缓冲液，和27微升20%Triton X-100到细胞悬浮液，并调整总体积到300微升与水。

拆下 15 微升等分，在 4 摄氏度下存储为未消化控制。在剩余的反应混合物中加入200个约束酶的一体。在900 RPM搅拌的震动加热块中，在适合酶的温度下孵育过夜。

第二天，再加入200个单位的酶，并持续一夜的这种孵化。取出 15 微升等分，储存在 4 摄氏度下作为消化控制。为了确定消化效率，在每个未消化和消化的对照装置中添加 82.5 微升 10 毫摩尔 Tris-HCl，pH 7.5。

加入2.5微升的蛋白酶K，在65摄氏度下孵育一小时，以逆转甲醛交叉连接。要分离消化的DNA，在管中加入100微升酚氯仿。通过几个快速反转混合，去除残留的蛋白质污染。

在室温下在 16，100 G 下离心 5 分钟。离心后，将水相转移到新管中。将醋酸钠、糖原和100%乙醇加入管中，通过反转轻轻混合。

在零下80摄氏度下孵育一小时，以沉淀DNA。在摄氏4度的16，100 G下将管离心20分钟。取出上一液，然后加入500微升70%乙醇洗涤DNA颗粒。

在室温下在 16，100 G 下离心 5 分钟。去除上一杯空气后，在室温下干燥颗粒两分钟，以去除残留乙醇。将干颗粒重新悬浮在50微升无核酸酶无核酸水中，然后按照文本协议中所述，通过QPCR确定消化效率。

为了准备结扎，加热和激活限制酶，在65摄氏度下孵育管子20分钟。然后将管内的内容转移到50毫升锥形管中，加入无核酸酶、10 X连体缓冲液和T4 DNA连结酶。通过旋转轻轻混合，在16摄氏度下孵育过夜，然后按照文本协议中所述进行。

反向交叉链接添加15微升蛋白酶K，并在65摄氏度过夜孵育。第二天，加入30微升的RNase A，并在37摄氏度下45分钟孵育。要继续进行染色质分离，加入七毫升苯酚氯仿，通过几个快速反转混合。

在室温下将管在3，300 G下离心15分钟。离心后，将水相转移到新的50毫升管中，加入无核酸酶、三摩尔醋酸钠、糖原和100%乙醇。混合内容物，在负80摄氏度下孵育一小时。

孵育后，在4摄氏度的3，900G下将管离心20分钟。取出上清液，然后用10毫升冰70%乙醇清洗颗粒。在 3，300 G 的 4 摄氏度下离心 15 分钟。

取出上一液，并在室温下短暂干燥颗粒。在 37 摄氏度下将颗粒溶解在 150 微升中，10 毫摩尔三升-HCl pH 7.5。储存在负20摄氏度或继续第二次限制消化，结扎和DNA纯化，如文本协议中所述。

DNA纯化后，使用反向PCR底因剂和网络及ROX染料执行QPCR，以确定对未知相互作用序列进行反向PCR放大的放大周期数，如本文所述。为了准备DNA的测序，通过消化一微克的纯化产品反向PCR以及限制性酶监测器，修剪第三个限制消化的诱饵序列。在与预期片段的浓度的凝固糖凝胶上运行消化的限制性酶或 RE 监测器。

一旦消化效率由凝胶电泳确定，继续反向PCR产品纯化和测序库的准备，如文本协议中所述。第三次限制消化对于下一代循环染色体确认捕获测序方案非常重要。这种消化修剪诱饵序列，这可以帮助确定染色质的吸引力。

已消化的 RE 监测仪的 Agarose 凝胶电泳表明，对并行消化的反向 PCR 产品有充分的消化。完成四个C测序读取被修剪并映射到人类参考基因组hg38，使用BWA软件包。大多数读取在限制站点印地语III 或 CviQ1I 站点与印地语网站相邻，如预期的那样对齐。

在尝试此过程时，确保细胞被lysed和染色质被充分消化是重要的。按照此过程，可以执行其他方法，如染色质免疫沉淀或 CHIP，以回答其他问题，如识别染色质相互作用中涉及的转录因子。该技术开发后，为染色质领域的研究人员探索物理调控网络铺平了道路。