利用下一代测序技术对染色体构象捕获环化文库（4C-seq）进行基因调控序列的高通量鉴定

该方法可解答转录调控领域中的关键问题，例如染色质相互作用的作用。该技术的主要优势在于，它能够相对无偏倚地捕获目标基因座的相互作用。尽管该方法可揭示启动子与增强子之间的相互作用，也可用于鉴定其他类型的染色质相互作用。

通常，初次接触该方法的研究人员会遇到困难，因为该实验流程耗时数天，且引物设计需要反复尝试，并采用非典型的引物方向。为了在选定的细胞中保留染色质相互作用，每1000万个细胞加入9.5毫升PBS中含1%电子显微镜级甲醛进行交联。将细胞在室温下轻轻摇动孵育10分钟。

将反应管转移至冰上以终止交联反应，加入冰冷的1摩尔甘氨酸，使其终浓度为0.125摩尔，轻轻倒置混匀。按照文本方案离心并洗涤细胞后，将沉淀重悬于125微升含5毫摩尔EDTA、0.5% SDS及1×蛋白酶抑制剂的溶液中。将细胞悬液置于冰上孵育10分钟。

为确保细胞裂解完全，取六微升细胞与六微升台盼蓝在显微镜载玻片上混匀，盖上盖玻片。在显微镜下观察，裂解细胞的内部呈蓝色，未裂解细胞呈白色。进行第一次限制性酶切时，向细胞悬液中加入30微升10 X限制性内切酶缓冲液和27微升20% Triton X-100，并加水调整总体积至300微升。

取15微升等分试样，于4摄氏度保存，作为未消化对照。向剩余的反应混合物中加入200单位的限制性内切酶一。在适用于该酶的温度下，于振荡加热金属块中以900 RPM振荡速度过夜孵育。

第二天，加入额外的 200 单位酶，并继续过夜孵育。取 15 微升等分试样，于 4 摄氏度保存，作为已消化的对照样本。为确定消化效率，向每个未消化和已消化的对照样本中加入 82.5 微升 10 毫摩尔 Tris-HCl（pH 7.5）。

加入 2.5 µL 蛋白酶 K，在 65 °C 下孵育 1 小时，以逆转甲醛交联。为分离已消化的 DNA，向离心管中加入 100 µL 酚-氯仿溶液。通过数次快速颠倒混匀，以去除残留的蛋白质污染。

在室温下以16,100 ×g离心5分钟。离心后，将水相转移至新离心管中。向管中加入乙酸钠、糖原和100%乙醇，轻轻颠倒混匀。

在负80摄氏度下孵育一小时，以沉淀DNA。在4摄氏度下以16,100 ×g离心20分钟。弃去上清液，然后加入500微升70%乙醇洗涤DNA沉淀。

在室温下以 16,100 ×g 离心 5 分钟。弃去上清液后，将沉淀在室温下空气干燥 2 分钟，以去除残留的乙醇。将干燥的沉淀重悬于 50 µL 无核酸酶水中，并按照文本方案中所述，通过 QPCR 测定消化效率。

为进行连接反应做准备，将限制性内切酶在65摄氏度孵育20分钟以加热并激活。然后将管内溶液转移至一个50毫升的锥形管中，加入无核酸酶水、10×连接酶缓冲液和T4 DNA连接酶。轻轻涡旋混匀，于16摄氏度过夜孵育，随后按照文本方案中所述步骤进行操作。

为逆转交联，加入15微升蛋白酶K，并在65摄氏度下孵育过夜。次日加入30微升RNase A，在37摄氏度下孵育45分钟。继续进行染色质分离时，加入七毫升苯酚-氯仿，通过数次快速倒置混匀。

在室温下以 3,300 G 离心 15 分钟。离心后，将水相转移至新的 50 毫升离心管中，加入无核酸酶水、3 摩尔乙酸钠、酵母菌糖原和 100% 乙醇。混匀内容物，并在 -80 摄氏度孵育 1 小时。

孵育后，在4°C条件下以3,900 × g离心20分钟。弃去上清液，然后用10毫升预冷的70%乙醇洗涤沉淀。在4°C条件下以3,300 × g离心15分钟。

移除上清液，并在室温下短暂干燥沉淀。将沉淀溶于150微升10毫摩尔/升Tris-HCl（pH 7.5）中，37摄氏度条件下进行。储存于负20摄氏度，或按照文本方案所述继续进行第二次限制性消化、连接反应及DNA纯化。

在DNA纯化后，使用反向PCR引物以及Cyber和ROX染料进行定量PCR（qPCR），以确定扩增未知相互作用序列所需的反向PCR循环次数，具体方法如文中所述。为准备测序用DNA，通过第三次限制性酶切去除诱饵序列，即对1微克纯化后的反向PCR产物以及限制性酶切监测样本进行酶切反应。将经酶切的限制性酶切监测样本（RE monitor）在适合预期片段大小的琼脂糖凝胶上电泳分离。

通过凝胶电泳确定消化效率后，继续进行反向PCR产物纯化及测序文库的制备，具体步骤如文本方案所述。在本方案中，第三次限制性消化对于环状染色体确认捕获的下一代测序至关重要。该消化步骤可去除诱饵序列，从而有助于染色质互作位点的鉴定。

对已消化的限制性内切酶监测样本进行琼脂糖凝胶电泳，结果显示与反向PCR产物平行消化的样本已得到充分消化。完成四次C测序后，将测序读段经修剪后使用BWA软件包比对至人类参考基因组hg38。大部分读段如预期般比对至HindIII或CviQ1I限制性位点，或邻近HindIII位点的区域。

在进行该实验操作时，重要的是确保细胞已充分裂解，且染色质已被充分消化。完成该步骤后，可进一步采用其他方法，如染色质免疫沉淀（ChIP），以回答更多科学问题，例如鉴定参与染色质相互作用的转录因子。该技术自建立以来，为染色质领域的研究人员探索物理性调控网络奠定了基础。