利用下一代序列染色体构象捕获 (4 c 序列) 的高通量识别基因调控数列
2018年10月5日
基因和调控元素之间的物理相互作用的识别是具有挑战性的, 但已被染色体构象捕获方法所促进。这种对 4 c 序列协议的修改可以减少 pcr 模板的过度放大, 并通过加入限制酶消化步骤来最大限度地提高 mappability 的读数。
此方法可以回答转录调控领域中的关键问题，例如染色质相互作用的作用。这种技术的主要优点是，它为感兴趣的一个中心提供了相对公正的交互捕获。虽然此方法可以提供对促进剂增强剂相互作用的洞察，但它也可以用于识别其他类型的染色质相互作用。
通常，对此方法的个体将难以操作，因为协议需要几天时间，并且底法设计需要试验和错误以及非典型底法方向。为了保持选择细胞中的染色质相互作用，通过每1000万细胞在PBS中加入9.5毫升1%电子显微镜级甲醛来交叉链接它们。在室温下摇动10分钟时孵育细胞。
将反应管转移到冰中，以淬火交汇反应，将冰冷一摩尔甘油加入0.125摩尔的最终浓度，然后轻轻反转混合。在根据文本协议离心和清洗细胞后，用0.5%SDS和一种X蛋白酶抑制剂将颗粒悬浮在5毫摩尔EDTA的125微升中。在冰上孵育细胞悬浮液10分钟。
为确保细胞 lyse 完整，在显微镜幻灯片上将六个微升的细胞与六个微升的 trypan 蓝色混合，并盖上盖板。在显微镜下查看，查看被解的细胞内部为蓝色，未解白细胞为白色。对于第一个限制消化添加30微升10X限制酶缓冲液，和27微升20%Triton X-100到细胞悬浮液，并调整总体积到300微升与水。
拆下 15 微升等分，在 4 摄氏度下存储为未消化控制。在剩余的反应混合物中加入200个约束酶的一体。在900 RPM搅拌的震动加热块中，在适合酶的温度下孵育过夜。
第二天，再加入200个单位的酶，并持续一夜的这种孵化。取出 15 微升等分，储存在 4 摄氏度下作为消化控制。为了确定消化效率，在每个未消化和消化的对照装置中添加 82.5 微升 10 毫摩尔 Tris-HCl，pH 7.5。
加入2.5微升的蛋白酶K，在65摄氏度下孵育一小时，以逆转甲醛交叉连接。要分离消化的DNA，在管中加入100微升酚氯仿。通过几个快速反转混合，去除残留的蛋白质污染。
在室温下在 16，100 G 下离心 5 分钟。离心后，将水相转移到新管中。将醋酸钠、糖原和100%乙醇加入管中，通过反转轻轻混合。
在零下80摄氏度下孵育一小时，以沉淀DNA。在摄氏4度的16，100 G下将管离心20分钟。取出上一液，然后加入500微升70%乙醇洗涤DNA颗粒。
在室温下在 16，100 G 下离心 5 分钟。去除上一杯空气后，在室温下干燥颗粒两分钟，以去除残留乙醇。将干颗粒重新悬浮在50微升无核酸酶无核酸水中，然后按照文本协议中所述，通过QPCR确定消化效率。
为了准备结扎，加热和激活限制酶，在65摄氏度下孵育管子20分钟。然后将管内的内容转移到50毫升锥形管中，加入无核酸酶、10 X连体缓冲液和T4 DNA连结酶。通过旋转轻轻混合，在16摄氏度下孵育过夜，然后按照文本协议中所述进行。
反向交叉链接添加15微升蛋白酶K，并在65摄氏度过夜孵育。第二天，加入30微升的RNase A，并在37摄氏度下45分钟孵育。要继续进行染色质分离，加入七毫升苯酚氯仿，通过几个快速反转混合。
在室温下将管在3，300 G下离心15分钟。离心后，将水相转移到新的50毫升管中，加入无核酸酶、三摩尔醋酸钠、糖原和100%乙醇。混合内容物，在负80摄氏度下孵育一小时。
孵育后，在4摄氏度的3，900G下将管离心20分钟。取出上清液，然后用10毫升冰70%乙醇清洗颗粒。在 3，300 G 的 4 摄氏度下离心 15 分钟。
取出上一液，并在室温下短暂干燥颗粒。在 37 摄氏度下将颗粒溶解在 150 微升中，10 毫摩尔三升-HCl pH 7.5。储存在负20摄氏度或继续第二次限制消化，结扎和DNA纯化，如文本协议中所述。
DNA纯化后，使用反向PCR底因剂和网络及ROX染料执行QPCR，以确定对未知相互作用序列进行反向PCR放大的放大周期数，如本文所述。为了准备DNA的测序，通过消化一微克的纯化产品反向PCR以及限制性酶监测器，修剪第三个限制消化的诱饵序列。在与预期片段的浓度的凝固糖凝胶上运行消化的限制性酶或 RE 监测器。
一旦消化效率由凝胶电泳确定，继续反向PCR产品纯化和测序库的准备，如文本协议中所述。第三次限制消化对于下一代循环染色体确认捕获测序方案非常重要。这种消化修剪诱饵序列，这可以帮助确定染色质的吸引力。
已消化的 RE 监测仪的 Agarose 凝胶电泳表明，对并行消化的反向 PCR 产品有充分的消化。完成四个C测序读取被修剪并映射到人类参考基因组hg38，使用BWA软件包。大多数读取在限制站点印地语III 或 CviQ1I 站点与印地语网站相邻，如预期的那样对齐。
在尝试此过程时，确保细胞被lysed和染色质被充分消化是重要的。按照此过程，可以执行其他方法，如染色质免疫沉淀或 CHIP，以回答其他问题，如识别染色质相互作用中涉及的转录因子。该技术开发后，为染色质领域的研究人员探索物理调控网络铺平了道路。
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概述
本文介绍了一种改进的4C-seq方案，通过减少PCR偏差并提高测序读段的可比对性，增强了染色质相互作用的识别能力。该方法在研究转录调控和染色质相互作用方面尤为有用。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 遗传学
- 染色质生物学
背景
- 染色体构象捕获方法对于研究基因调控元件间的相互作用至关重要。
- 传统方法常受到PCR偏差和过度扩增的影响。
- 理解染色质相互作用对于阐明转录调控机制至关重要。
- 该方法能够在特定基因座实现更无偏倚的相互作用捕获。
研究目的
- 提供一种可靠的染色质相互作用捕获方法。
- 促进启动子-增强子相互作用的研究。
- 提高该技术对科研人员的可及性。
使用的方法
- 改进 4C-seq 方案以减少 PCR 偏向性。
- 引入限制性内切酶消化步骤。
- 使用甲醛交联染色质。
- 精心设计引物以优化相互作用捕获效率。
主要结果
- 改进后的方案成功减少了过度扩增。
- 测序读段的比对效率提高，增强了数据质量。
- 获得了染色质相互作用的深入见解，有助于转录调控研究。
- 该方法适用于多种类型的染色质相互作用。
结论
- 改进的4C-seq方案是研究人员的有力工具。
- 它为研究染色质相互作用提供了一种更无偏倚的方法。
- 未来的研究可利用该方法探索复杂的调控网络。
常见问题
行业重要性概述
理解染色质相互作用对于在早期发现阶段降低靶点验证的风险至关重要，因为它能够阐明影响基因表达的调控机制。改进的4C-seq方法提供了无偏倚、位点特异性的物理染色质互作图谱，有助于深入揭示作用机制，从而增强靶点选择的预测可信度。该能力有助于优先排序治疗假设，并减少因生物学理解不充分而导致的后期研发失败。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 科学价值：通过绘制目标基因的物理染色质相互作用图谱，验证治疗假设。
- 操作价值：阐明增强子-启动子及其他调控元件间的相互作用，以功能验证靶点。
- 预测价值：通过降低转录调控机制中的不确定性，支持项目组合的筛选决策。
筛选与检测方法开发
- 检测准备就绪：生成可量化的相互作用图谱，可用于标准化的可重复筛选实验。
- 可扩展性：能够制备适用于高通量应用的下一代测序兼容的测序文库。
- 平台复用性：支持跨项目使用，用于研究不同治疗领域中的多种基因位点。
转化与临床前研究
- 转化连续性：将发现阶段的染色质图谱与基因调控机制的临床前验证相连接。
- 生物标志物一致性：支持识别具有作为转化生物标志物潜力的调控变异体。
- 风险调整推进：通过阐明与疾病相关的染色质拓扑结构，为推进或终止决策提供依据。
流程与工作流整合
该方法适用于从靶点假设验证到先导化合物鉴定的整个发现过程，可在化合物筛选之前提供深入的作用机制信息。
- 发现生物学：可实现基于染色质的调控机制的假设验证，并阐明相关通路。
- 筛选：生成标准化、定量的染色质相互作用数据，适用于检测方法的开发。
- 分析：提供可比对的测序读段和相互作用频率，支持不同条件间的比较分析。
- 转化研究：将位点特异性的染色质结构与基因调控的临床前模型关联起来。
- 企业级复用：建立可在多个靶标和项目间重复使用的染色质相互作用谱分析能力。
运营与企业影响
- 科学价值：通过无偏倚的染色质相互作用图谱绘制和机制性风险降低，增强靶点验证。
- 操作价值：通过减少PCR偏差和可控的限制性消化，提高实验的可重复性和标准化水平。
- 战略价值：提高靶点选择的可信度，从而实现更优的资源分配并降低失败风险。
- 项目组合影响：基于调控网络的可信度，实现数据驱动的靶点优先排序。
实施注意事项
- 需要具备分子生物学、染色质技术以及高通量测序文库构建方面的专业知识。
- 依赖于限制性内切酶、连接试剂、qPCR系统及测序基础设施的可及性。
- 需要在不同团队间对引物设计、交联效率和消化对照进行标准化。
- 在不同模式系统中应用时，可能需要优化交联和消化条件。
- 实际限制包括实验流程耗时较长（需数天）以及为实现最佳相互作用捕获而需反复尝试的引物设计。
