Name: 利用下一代序列染色体构象捕获 (4 c 序列) 的高通量识别基因调控数列 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 6 s
Description: 学习改进的4C-seq染色体构象捕获技术，用于研究基因转录调控和染色质相互作用。该方法通过减少PCR偏差提高数据质量，帮助科研人员深入探索启动子-增强子互作网络。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

本工作由美国国家关节炎与肌肉骨骼和皮肤病研究所（NIAMS）资助（项目编号：R01AR065523）。

<ol><li>Dunham, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+integrated+encyclopedia+of+DNA+elements+in+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome.</a> Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).</li>
<li>Hoffman, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+annotation+of+chromatin+elements+from+ENCODE+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Integrative annotation of chromatin elements from ENCODE data.</a> Nucleic Acids Research. 41 (2), 827-841 (2013).</li>
<li>Dekker, J., Rippe, K., Dekker, M., Kleckner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capturing+Chromosome+Conformation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Capturing Chromosome Conformation.</a> Science. 295 (5558), 1306-1311 (2002).</li>
<li>Sanyal, A., Lajoie, B. R., Jain, G., Dekker, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+long-range+interaction+landscape+of+gene+promoters%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The long-range interaction landscape of gene promoters.</a> Nature. 489 (7414), 109-113 (2012).</li>
<li>Li, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extensive+promoter-centered+chromatin+interactions+provide+a+topological+basis+for+transcription+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Extensive promoter-centered chromatin interactions provide a topological basis for transcription regulation.</a> Cell. 148 (1-2), 84-98 (2012).</li>
<li>Schmitt, A. D., Hu, M., Ren, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+mapping+and+analysis+of+chromosome+architecture%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Genome-wide mapping and analysis of chromosome architecture.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (12), 743-755 (2016).</li>
<li>Zhao, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circular+chromosome+conformation+capture+%284C%29+uncovers+extensive+networks+of+epigenetically+regulated+intra-+and+interchromosomal+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+genetics%22%5BJournal%5D)">Circular chromosome conformation capture (4C) uncovers extensive networks of epigenetically regulated intra- and interchromosomal interactions.</a> Nature genetics. 38 (11), 1341-1347 (2006).</li>
<li>Splinter, E., de Wit, E., van de Werken, H. J. G., Klous, P., de Laat, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determining+long-range+chromatin+interactions+for+selected+genomic+sites+using+4C-seq+technology%3A+From+fixation+to+computation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Determining long-range chromatin interactions for selected genomic sites using 4C-seq technology: From fixation to computation.</a> Methods. 58 (3), 221-230 (2012).</li>
<li>Van De Werken, H. J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((4C+technology%3A+Protocols+and+data+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">4C technology: Protocols and data analysis.</a> Methods in Enzymology. 513, Elsevier Inc. (2012).</li>
<li>Brouwer, R. W. W., van den Hout, M. C. G. N., van IJcken, W. F. J., Soler, E., Stadhouders, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unbiased+Interrogation+of+3D+Genome+Topology+Using+Chromosome+Conformation+Capture+Coupled+to+High-Throughput+Sequencing+%284C-Seq%29%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryotic+Transcriptional+and+Post-Transcriptional+Gene+Expression+Regulation%22%5BJournal%5D)">Unbiased Interrogation of 3D Genome Topology Using Chromosome Conformation Capture Coupled to High-Throughput Sequencing (4C-Seq).</a> Eukaryotic Transcriptional and Post-Transcriptional Gene Expression Regulation. , 199-220 (2017).</li>
<li>Matelot, M., Noordermeer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+High-Resolution+3D+Chromatin+Organization+Using+Circular+Chromosome+Conformation+Capture+%284C-seq%29%5BTitle%5D)+AND+%22Polycomb+Group+Proteins%3A+Methods+and+Protocols%22%5BJournal%5D)">Determination of High-Resolution 3D Chromatin Organization Using Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq).</a> Polycomb Group Proteins: Methods and Protocols. , 223-241 (2016).</li>
<li>Gheldof, N., Leleu, M., Noordermeer, D., Rougemont, J., Reymond, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detecting+Long-Range+Chromatin+Interactions+Using+the+Chromosome+Conformation+Capture+Sequencing+%284C-seq%29+Method%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Regulatory+Networks%3A+Methods+and+Protocols%22%5BJournal%5D)">Detecting Long-Range Chromatin Interactions Using the Chromosome Conformation Capture Sequencing (4C-seq) Method.</a> Gene Regulatory Networks: Methods and Protocols. , 211-225 (2012).</li>
<li>Göndör, A., Rougier, C., Ohlsson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+circular+chromosome+conformation+capture+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">High-resolution circular chromosome conformation capture assay.</a> Nature. 3 (2), 303-313 (2008).</li>
<li>Hagège, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+chromosome+conformation+capture+assays+%283C-qPCR%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of chromosome conformation capture assays (3C-qPCR).</a> Nature. 2 (7), 1722-1733 (2007).</li>
<li>Anand, R. D., Sertil, O., Lowry, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restriction+digestion+monitors+facilitate+plasmid+construction+and+PCR+cloning%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Restriction digestion monitors facilitate plasmid construction and PCR cloning.</a> BioTechniques. 36 (6), 982-985 (2004).</li>
<li>Afgan, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Galaxy+platform+for+accessible%2C+reproducible+and+collaborative+biomedical+analyses%3A+2016+update%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+acids+research%22%5BJournal%5D)">The Galaxy platform for accessible, reproducible and collaborative biomedical analyses: 2016 update.</a> Nucleic acids research. 44 (W1), W3-W10 (2016).</li>
<li>Li, H., Durbin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+and+accurate+long-read+alignment+with+Burrows-Wheeler+transform%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Fast and accurate long-read alignment with Burrows-Wheeler transform.</a> Bioinformatics. 26 (5), 589-595 (2010).</li>
<li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Sequence+Alignment%2FMap+format+and+SAMtools%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">The Sequence Alignment/Map format and SAMtools.</a> Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).</li>
<li>Walter, C., Schuetzmann, D., Rosenbauer, F., Dugas, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic4Cseq%3A+An+R%2FBioconductor+package+for+analyzing+4C-seq+data%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Basic4Cseq: An R/Bioconductor package for analyzing 4C-seq data.</a> Bioinformatics. 30 (22), 3268-3269 (2014).</li>
<li>Raviram, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((4C-ker%3A+A+Method+to+Reproducibly+Identify+Genome-Wide+Interactions+Captured+by+4C-Seq+Experiments%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Computational+Biology%22%5BJournal%5D)">4C-ker: A Method to Reproducibly Identify Genome-Wide Interactions Captured by 4C-Seq Experiments.</a> PLoS Computational Biology. 12 (3), (2016).</li>
<li>Klein, F. A., Pakozdi, T., Anders, S., Ghavi-helm, Y., Furlong, E. E. M., Huber, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FourCSeq%3A+analysis+of+4C+sequencing+data%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">FourCSeq: analysis of 4C sequencing data.</a> Bioinformatics. 31 (19), 3085-3091 (2015).</li>
<li>Williams, R. L. Jr, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((fourSig+a+method+for+determining+chromosomal+interactions+in+4C-Seq+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">fourSig a method for determining chromosomal interactions in 4C-Seq data.</a> Nucleic Acids Research. 42 (8), (2014).</li>
<li>McLean, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GREAT+improves+functional+interpretation+of+cis-regulatory+regions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">GREAT improves functional interpretation of cis-regulatory regions.</a> Nature Biotechnology. 28 (5), 495-501 (2010).</li>
<li>Stolzenburg, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulatory+dynamics+of+11p13+suggest+a+role+for+EHF+in+modifying+CF+lung+disease+severity%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Regulatory dynamics of 11p13 suggest a role for EHF in modifying CF lung disease severity.</a> Nucleic Acids Research. 45 (15), 8773-8784 (2017).</li>
<li>Meddens, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+analysis+of+chromatin+interactions+at+disease+associated+loci+links+novel+candidate+genes+to+inflammatory+bowel+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Systematic analysis of chromatin interactions at disease associated loci links novel candidate genes to inflammatory bowel disease.</a> Genome Biology. 17 (1), 1-15 (2016).</li>
<li>Yeung, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+factor+activity+rhythms+and+tissue-specific+chromatin+interactions+explain+circadian+gene+expression+across+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+research%22%5BJournal%5D)">Transcription factor activity rhythms and tissue-specific chromatin interactions explain circadian gene expression across organs.</a> Genome research. , 207787(2017).</li>
</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

4C 结果有可能揭示染色质相互作用，从而鉴定出在特定生物学背景下具有重要功能的先前未知的调控元件和/或靶基因24,25,26。然而，技术障碍可能会限制这些实验所获得的数据。在 4C 实验流程中，由于模板过度扩增而引起的 PCR 偏倚是可能发生的。本实验方案通过使用 qPCR 客观地确定最佳扩增循环次数，以解决这一问题。此外，通过限制性酶切去除扩增后的反向 PCR 产物中的诱饵序列，可以从两个方面促进染色质相互作用的鉴定：第一，它减少了待测序材料中无信息量的（诱饵）碱基对长度；第二，因此提高了从多样化序列中获得测序读长的可能性（这是准确碱基识别所必需的特性），从而能够比对到更多具有信息量的相互作用序列。其他实验方案需要合并使用不同诱饵序列和/或不同限制性内切酶构建的多个文库，或者需要提高测序样本中 phiX 的浓度，以克服因序列均一性不足而导致的碱基识别困难。本方法允许将多个具有相同诱饵序列的样本合并至单个测序通道中，而无需使用过多的 phiX 占用宝贵...

基因表达调控元件的鉴定得益于DNA元件百科全书（ENCODE）计划，该计划对人类基因组80%的区域进行了功能活性的全面注释1,2。在特定细胞类型中，体内转录因子结合位点、DNase I超敏感位点以及表观遗传学组蛋白修饰和DNA甲基化修饰位点的鉴定，为靶基因表达相关候选调控元件的功能分析奠定了基础。基于这些发现，我们面临的新挑战是确定调控元件与基因之间的功能互联性。具体而言，一个特定的靶基因与其增强子（们）之间存在怎样的关系？染色质构象捕获技术（3C）通过在固定化的染色质中捕获相互作用事件，直接回答了这一问题，识别出目标区域与候选互作序列之间的物理性且可能具有功能性的相互作用3。然而，随着对染色质相互作用理解的深入，人们认识到仅研究预先选定的候选基因座不足以全面揭示基因与增强子之间的相互作用。例如，ENCODE项目采用高通量染色体构象捕获碳拷贝（5C）方法，仅检测了人类基因组的一小部分（1%，包含44个基因座的试点集合），即发现这些基因座之间存在复杂的互连网络。具有已鉴定相互作用的基因和增强子平均拥有2–4个不同的互作伙伴，其中许多在基因组线性距离上相距达数百千碱基4。此外，Li et al. 采用配对末端标签测序法进行染色质相互作用分析（ChIA-PET），研究了全基因组范围内的启动子相互作用，发现65%的RNA聚合酶II结合位点参与了染色质相互作用。其中一些相互作用形成了跨越数百千碱基基因组距离的大型多基因复合物，每个复合物平均包含8–9个基因5。这些发现共同凸显了开发无偏倚的全基因组方法以系统研究染色质相互作用的必要性。部分此类方法已在Schmitt et al. 的综述中进行了总结6。
近期结合下一代测序技术的染色质构象捕获方法（Hi-C 和 4C-seq）能够发现与目标区域相互作用的未知序列6具体而言，染色体构象捕获结合高通量测序技术（4C-seq）被开发用于无偏倚地鉴定与目标序列发生互作的基因组位点7 通过测序在三维空间中靠近目标区域的捕获染色质中的DNA。简言之，染色质经固定以保持其天然的蛋白质-DNA相互作用，随后用限制性内切酶切割，并在稀释条件下进行连接，以捕获具有生物学意义的相互作用 &#34;缠结&#34; 相互作用的基因座图1通过逆转交联去除蛋白质，从而释放DNA，以便用第二种限制性内切酶进行进一步切割。最终的连接反应生成包含相互作用位点的小型环状DNA分子。随后利用目标序列的引物对环化片段中的未知序列进行扩增建库，再进行后续的高通量测序。
本文所述方案侧重于样品制备，对现有的4C-seq方法进行了两项主要改进8,9,10,11,12首先，该方法采用基于qPCR的技术，通过实验确定4C-seq文库制备过程中最适扩增循环数，从而减轻因文库过度扩增所导致的PCR偏差。其次，该方法引入额外的限制性酶切步骤，旨在降低已知均一性的影响。 &#34;诱饵&#34; 会阻碍测序仪器准确碱基识别的序列，从而最大化每条读段中独特且具有信息量的序列。其他方案通过混合大量（12-15）个样本以规避此问题8 使用不同诱饵序列和/或限制性酶切位点的4C-seq文库，可进行大量实验，而这些实验数量可能是其他实验室难以实现的。本文介绍的改进方法允许将少量实验、样本和/或重复样本进行索引并合并至同一测序通道中。

<table><tbody><tr><td>HindIII</td><td>NEB</td><td>R0104S</td><td></td></tr><tr><td>CviQI</td><td>NEB</td><td>R0639S</td><td></td></tr><tr><td>DNA寡核苷酸引物</td><td>IDT</td><td></td><td>由读者自行设计</td></tr><tr><td>50 mL圆锥形离心管</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-443-19</td><td></td></tr><tr><td>1.7 mL微量离心管</td><td>MidSci</td><td>AVSS1700</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液</td><td>Thermo Fisher</td><td>14190-136</td><td></td></tr><tr><td>甲醛，无甲醇</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>旋转混合仪</td><td>VWR</td><td>15172-203</td><td></td></tr><tr><td>甘氨酸</td><td>JT Baker</td><td>4059-00</td><td></td></tr><tr><td>台式离心机</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>制冷微量离心机</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>乙二胺四乙酸（EDTA）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>ED2SS</td><td></td></tr><tr><td>20% SDS溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>05030</td><td></td></tr><tr><td>台盼蓝</td><td>Thermo Fisher</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>载玻片</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-143</td><td></td></tr><tr><td>盖玻片</td><td>VWR</td><td>16004-094</td><td></td></tr><tr><td>光学显微镜</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>吐温X-100</td><td>Alfa Aesar</td><td>A16046</td><td></td></tr><tr><td>振荡加热金属浴</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2 M Tris-HCl</td><td>Quality Biological</td><td>351-048-101</td><td></td></tr><tr><td>蛋白酶K</td><td>NEB</td><td>P8107S</td><td></td></tr><tr><td>苯酚:氯仿:异戊醇（25:24:1）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2069</td><td></td></tr><tr><td>乙酸钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5661</td><td></td></tr><tr><td>20 mg/mL糖原</td><td>Thermo Fisher</td><td>R0561</td><td></td></tr><tr><td>乙醇</td><td>Fisher Scientific</td><td>04-355-223</td><td></td></tr><tr><td>无核酸酶水</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT-46-000-CM</td><td></td></tr><tr><td>qPCR仪</td><td>Thermo Fisher</td><td>4453536</td><td></td></tr><tr><td>qPCR板</td><td>Thermo Fisher</td><td>4309849</td><td></td></tr><tr><td>PCR仪</td><td>Thermo Fisher</td><td>4375786</td><td></td></tr><tr><td>PCR排管</td><td>MidSci</td><td>AVSST-FL</td><td></td></tr><tr><td>1 M氯化镁</td><td>Quality Biological</td><td>351-033-721</td><td></td></tr><tr><td>二硫苏糖醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>43815</td><td></td></tr><tr><td>三磷酸腺苷</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2383</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA连接酶</td><td>NEB</td><td>M0202S</td><td></td></tr><tr><td>琼脂糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6013</td><td></td></tr><tr><td>RNase A</td><td>Thermo Fisher</td><td>EN0531</td><td></td></tr><tr><td>Qiaquick PCR纯化试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>MinElute PCR纯化试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>28004</td><td></td></tr><tr><td>分光光度计</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Expand Long Template PCR体系</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11681834001</td><td></td></tr><tr><td>dNTP混合液</td><td>Thermo Fisher</td><td>R0191</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Green I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9430</td><td></td></tr><tr><td>ROX</td><td>BioRad</td><td>172-5858</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5886</td><td></td></tr><tr><td>End-It DNA末端修复试剂盒</td><td>Lucigen</td><td>ER0720</td><td></td></tr><tr><td>LigaFast快速DNA连接系统</td><td>Promega</td><td>M8221</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Safe</td><td>Thermo Fisher</td><td>S33102</td><td></td></tr><tr><td>Taq聚合酶</td><td>NEB</td><td>M0267S</td><td></td></tr><tr><td>UltraSieve琼脂糖</td><td>IBI Scientific</td><td>IB70054</td><td></td></tr><tr><td>Qiaquick凝胶回收试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td></td></tr></tbody></table>

利用下一代测序技术对染色体构象捕获环化文库（4c-seq）进行基因调控序列的高通量鉴定

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq)

针对特定目的基因，鉴定其调控元件在技术上具有显著挑战性，原因在于调控元件相对于目的基因的位置和效应大小存在较大变异性。通过保守的转录因子结合位点，利用生物信息学方法预测与基因激活表达相关的近端表观遗传修饰的存在及其功能，已取得一定进展。染色质构象捕获技术极大地提升了我们发现序列间乃至全基因组范围内染色质物理相互作用的能力。特别是结合高通量测序的环状染色质构象捕获技术（4C-seq），旨在发现特定目标序列（即“视角序列”，viewpoint）的所有可能的染色质物理相互作用，例如目的基因或调控增强子。目前的4C-seq策略直接从视角序列内部进行测序，但为避免高通量测序平台在碱基识别（成像）过程中出现技术偏差，需同时对大量且多样化的视角序列进行测序。这种实验规模对许多实验室而言可能难以实现。本文报道了一种改进的4C-seq实验方案，该方法引入了额外的限制性内切酶消化步骤以及基于qPCR的扩增步骤，分别旨在提高对多样化序列读长的捕获效率，并减轻PCR扩增可能带来的偏差。我们改进的4C方法适用于常规分子生物学实验室，可用于染色质高级结构的研究。

从2–3份废弃的新生儿包皮组织中分离原代人角质形成细胞，混合后在KSFM培养基中培养，培养基中添加30 µg/mL牛垂体提取物、0.26 ng/mL重组人表皮生长因子和0.09 mM氯化钙（CaCl2），培养条件为37 °C、5%二氧化碳。将细胞分至两个培养瓶中，其中一瓶通过加入CaCl2至终浓度1.2 mM诱导分化，持续72小时。分别取107个增殖期和分化期的角质形成细胞，在室温下用1%甲醛固定10分钟。另取K562细胞，在添加10%胎牛血清的RPMI培养基中于37 °C、5%二氧化碳条件下培养，并取107个细胞在室温下用1%甲醛固定10分钟。
细胞被裂解，固定后的染色质按照上述方法用 HindIII 消化并进行连接。逆转交联后，DNA 被纯化并用 CviQI 消化。将 DNA 连接后作为反向 PCR 扩增的模板。所用引物为：5'-GATCAGGAGGGACTGG...

鉴定基因与调控元件之间的物理相互作用具有挑战性，但染色体构象捕获技术为此提供了便利。该4C-seq方案的改进通过减少PCR模板的过度扩增，减轻了PCR偏好性，同时通过增加限制性内切酶消化步骤，提高了测序读段的可比对性。

利用下一代测序技术对染色体构象捕获环化文库（4C-seq）进行基因调控序列的高通量鉴定

特定目标基因调控元件的鉴定由于其在位置和...上的可变性，构成了重大的技术挑战

该方法可解答转录调控领域中的关键问题，例如染色质相互作用的作用。该技术的主要优势在于，它能够相对无偏倚地捕获目标基因座的相互作用。尽管该方法可揭示启动子与增强子之间的相互作用，也可用于鉴定其他类型的染色质相互作用。通常，初次接触该方法的研究人员会遇到困难，因为该实验流程耗时数天，且引物设计需要反复尝试，并采用非典型的引物方向。为了在选定的细胞中保留染色质相互作用，每1000万个细胞加入9.5毫升PBS中含1%电子显微镜级甲醛进行交联。将细胞在室温下轻轻摇动孵育10分钟。将反应管转移至冰上以终止交联反应，加入冰冷的1摩尔甘氨酸，使其终浓度为0.125摩尔，轻轻倒置混匀。按照文本方案离心并洗涤细胞后，将沉淀重悬于125微升含5毫摩尔EDTA、0.5% SDS及1×蛋白酶抑制剂的溶液中。将细胞悬液置于冰上孵育10分钟。为确保细胞裂解完全，取六微升细胞与六微升台盼蓝在显微镜载玻片上混匀，盖上盖玻片。在显微镜下观察，裂解细胞的内部呈蓝色，未裂解细胞呈白色。进行第一次限制性酶切时，向细胞悬液中加入30微升10 X限制性内切酶缓冲液和27微升20% Triton X-100，并加水调整总体积至300微升。取15微升等分试样，于4摄氏度保存，作为未消化对照。向剩余的反应混合物中加入200单位的限制性内切酶一。在适用于该酶的温度下，于振荡加热金属块中以900 RPM振荡速度过夜孵育。第二天，加入额外的 200 单位酶，并继续过夜孵育。取 15 微升等分试样，于 4 摄氏度保存，作为已消化的对照样本。为确定消化效率，向每个未消化和已消化的对照样本中加入 82.5 微升 10 毫摩尔 Tris-HCl（pH 7.5）。加入 2.5 µL 蛋白酶 K，在 65 °C 下孵育 1 小时，以逆转甲醛交联。为分离已消化的 DNA，向离心管中加入 100 µL 酚-氯仿溶液。通过数次快速颠倒混匀，以去除残留的蛋白质污染。在室温下以16,100 ×g离心5分钟。离心后，将水相转移至新离心管中。向管中加入乙酸钠、糖原和100%乙醇，轻轻颠倒混匀。在负80摄氏度下孵育一小时，以沉淀DNA。在4摄氏度下以16,100 ×g离心20分钟。弃去上清液，然后加入500微升70%乙醇洗涤DNA沉淀。在室温下以 16,100 ×g 离心 5 分钟。弃去上清液后，将沉淀在室温下空气干燥 2 分钟，以去除残留的乙醇。将干燥的沉淀重悬于 50 µL 无核酸酶水中，并按照文本方案中所述，通过 QPCR 测定消化效率。为进行连接反应做准备，将限制性内切酶在65摄氏度孵育20分钟以加热并激活。然后将管内溶液转移至一个50毫升的锥形管中，加入无核酸酶水、10×连接酶缓冲液和T4 DNA连接酶。轻轻涡旋混匀，于16摄氏度过夜孵育，随后按照文本方案中所述步骤进行操作。为逆转交联，加入15微升蛋白酶K，并在65摄氏度下孵育过夜

high-throughput-identification-gene-regulatory-sequences-using-next

Research

科研

JoVE Journal

Genetics

遗传学

利用下一代序列染色体构象捕获 (4 c 序列) 的高通量识别基因调控数列

本文介绍了一种名为Circle-Seq的高灵敏度方法，用于纯化染色体外环状DNA（eccDNA）。该方法包括柱纯化、去除残留的线性染色体DNA、滚环扩增以及高通量测序。Circle-Seq适用于真核生物eccDNA的全基因组规模筛选，并可用于研究基因组不稳定性和拷贝数变异。...

真核细胞中外染色体环状DNA的全基因组纯化

本方案为研究人员提供了一种新工具，可用于监测多种模式生物中转录的保真度。...

真核生物中转录错误的全基因组监测

CRISPR/sgRNA 文库已应用于研究蛋白质编码基因。然而，sgRNA 文库在揭示 CTCF 边界在基因调控中功能方面的可行性仍尚未探索。本文中，我们描述了一种针对 HOX 位点的特异性 sgRNA 文库，以阐明 CTCF 边界在 HOX...

HOX 基因座靶向的CRISPR/sgRNA文库筛选鉴定关键CTCF边界

环状RNA（circRNA）是一类非编码RNA，可能在转录调控以及介导蛋白质间相互作用中发挥功能。在评估了构建circRNA测序文库的多个不同参数后，本文整合并提出了一种利用RNase...

利用RNA测序鉴定环状RNA

我们报道了在由胚胎干细胞生成的拟胚体中应用定量染色体构象捕获技术并结合高通量测序的方法。该技术可用于鉴定和定量分析在胚胎干细胞分化过程中特定基因的潜在增强子与启动子区域之间的相互作用。...

通过定量染色体构象捕获技术（4C）鉴定类胚体中的增强子-启动子相互作用

Hi-C 3.0 是一种改进的 Hi-C 实验方案，结合使用甲醛和二琥珀酰亚胺基戊二酸酯交联剂，并采用 DpnII 和 DdeI...

跨尺度染色体构象捕获

本方案描述了染色质捕获结合高通量测序（Capture...

通过捕获式 Hi-C 解析高分辨率 3D 染色质结构 via Capture Hi-C

本文详细介绍了染色体构象捕获（3C）技术的一种改进方法，重点强调本科生的参与和学习过程。...

通过3C获得A：面向本科生的染色体构象捕获技术

基因表达受到基因启动子与远端调控元件相互作用的调控。本文介绍了低起始量的捕获染色体构象捕获技术（liCHi-C）如何实现对稀有细胞类型中这些相互作用的鉴定，而这些细胞类型在此前是无法测量的。...

一种用于在稀有细胞群体中研究以启动子为中心的时空基因组结构的整合工作流程

CRISPR等技术面临的一个重大障碍是脱靶效应，其可能破坏重要基因。“环化用于 体外...

使用CIRCLE-Seq检测基因编辑脱靶效应

学习改进的4C-seq染色体构象捕获技术，用于研究基因转录调控和染色质相互作用。该方法通过减少PCR偏差提高数据质量，帮助科研人员深入探索启动子-增强子互作网络。

利用下一代测序技术对染色体构象捕获环化文库（4C-seq）进行基因调控序列的高通量鉴定

探索更多视频