Toluidine Blue Staining of Resin-Embedded Sections for Evaluation of Peripheral Nerve Morphology

这种方法可以帮助回答周围神经损伤和再生领域的关键问题，例如周围神经的形态测量是什么，存在多少轴突，髓鞘形成的状态如何，是否存在纤维化组织？这种技术的主要优点是它允许神经特征的高分辨率可视化。首先将麻醉的大鼠置于解剖垫顶部的俯卧位。

放置鼻锥以维持 1-2% 异氟醚的麻醉。为确保足够的麻醉深度，测试动物的踏板撤离和后足的触诊反射。一旦达到适当的麻醉深度，剃掉后肢的毛发，并用 70% 乙醇对剃光的区域进行消毒。

触诊股骨以确定切口的合适位置。股骨位于坐骨神经最容易接近的段的近端。沿着后肢从膝盖到大转子在皮肤上做两到三厘米的切口后，找到股二头肌和臀大肌之间的平面。

然后使用显微解剖剪刀分离下面的筋膜，并暴露下面的坐骨神经 2 到 3 厘米。使用牵开器扩大两块肌肉之间的间隙。用细镊子和虹膜剪刀小心地将神经与周围的结缔组织分开，要非常小心不要压迫或割伤神经。

接下来，用 Trump's Fixative 覆盖暴露的神经，静置 10 分钟。如有必要，将纱布放在后腿下方以改善角度，以便将更多的固定剂添加到腔中。10 分钟后去除固定剂，再重复此步骤两次。

在解剖显微镜下，使用精细解剖剪刀从两侧剪断坐骨神经，确保不要拉伸或挤压神经。立即将神经切片放入含有 Trump's Fixative 的 15 mL 试管中，并在 4 摄氏度下固定一周，每 48 小时更换一次固定剂。固定后，小心地从神经中去除任何残留的脂肪和结缔组织，并使用锋利的手术刀将神经切成约 5 毫米长的段。

神经节段可以分成不同标记的管。将神经节段浸入新鲜制备的 2% 四氧化锇中 2 小时。使用环氧树脂包埋试剂盒，准备最终的包埋混合物。

将环氧树脂包埋介质与 DDSA 溶液混合，并将环氧树脂包埋介质与 NMA 溶液混合。用磁力搅拌器将两种溶液混合至少 20 分钟。使用前，将促进剂 DPM 与溶液 B 混合，然后将其与溶液 A 混合，使促进剂的最终比例在总体积的 1 点 5% 到 2% 之间。

将神经节段转移到一个 5 毫升的试管中，用 PBS 洗涤后，用浓度递增的丙酮和蒸馏水替换 PBS 开始脱水过程，每次 10 分钟，然后在 100% 丙酮中 3 次，每次 10 分钟。一个关键步骤是组织脱水。水和树脂不会相互作用，因此残留在组织中的任何水都不会被树脂渗透，从而在切片上留下没有组织学特性的孔洞。

对于树脂浸润，首先将神经节段置于包埋混合物和 100% 丙酮的一对一混合物中 30 分钟。30 分钟后，将片段转移到包埋混合物和 100% 丙酮的二比一混合物中，持续 30 分钟。将神经分离物放入硅橡胶包埋模具中，轻轻地将树脂添加到神经顶部，确保覆盖整个神经段，同时避免气泡。

让树脂在 60 摄氏度下聚合过夜。将带有嵌入神经的树脂块放入超薄切片机支架中，梯形面朝上。通过超薄切片机观察时，使用单刃刀片修剪神经组织周围的多余树脂。

不要穿透神经段的纵向表面，这可以通过四氧化锇的深色染色来识别。在超薄切片机上用普通玻璃刀制作多个横截面，以暴露神经的均匀横截面表面。完成后，在室温下改用玻璃刀，将船装满蒸馏水，并将超薄切片机调整到 1 到 2 微米以切割薄片。

使用金属环将漂浮的薄片从玻璃刀船转移到载玻片上的一滴去离子水中。另一个关键步骤是将薄片从玻璃刀转移到玻片上。这些薄片非常脆弱，可能会断裂或折叠。

切片后，将载玻片在火焰上多次擦干载玻片上的切片，确保切片不会过热。载玻片可以在室温下储存数天，如果不能立即用甲苯胺蓝染色。要对神经切片进行染色，请使用塑料移液管或微量移液器在神经切片顶部添加一滴甲苯胺蓝溶液。

20 到 30 秒后，将玻片轻轻浸入一罐去离子水中，冲洗掉所有多余的甲苯胺蓝溶液，重复 3 到 4 次，直到切片清晰。将玻片在 60 摄氏度下干燥至少 15 分钟或在室温下过夜。干燥后，加入常规封固剂并用盖玻片覆盖切片。

最后，在光学显微镜下检查安装的部分。建议使用 100 倍油浸镜头来获得详细的图像以计算 g 比率。包埋在树脂培养基中并用甲苯胺蓝染色的坐骨神经切片在放大倍率从 10 倍增加到 20 倍、40 倍和 60 倍时显示出具有最佳分辨率的清晰图像。

这种方法保留了神经结构并允许高分辨率、高放大倍率成像，这有助于测量多个参数，例如 g 比，即轴突直径的比率，由标记为 B 的箭头表示，与标记为 A 的总纤维直径的比率。多种因素可能导致周围神经切片不理想，包括由于神经处理不当而导致切片中存在裂缝。由于脱水不足，截面上也可能出现孔洞。该程序中另一个可能的错误是切片折叠，这可以通过使用接种环将切片转移到载玻片上来补救。

按照这个程序，可以执行其他方法，如轴突定量，以回答其他问题，例如再生神经的再生程度是多少？观看此视频后，您应该对如何获得 1 到 2 微米的周围神经切片以评估神经形态测量有很好的了解。