Name: 3D Cocultures 星形胶质细胞与人多潜能干细胞神经元的突触电路建模 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 48 s
Description: 了解利用人多潜能干细胞构建星形胶质细胞与神经元三维共培养体系的方法，通过多电极阵列记录突触电路活动。该技术为神经再生和药物开发研究提供了可扩展的实验平台。

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我们感谢加州大学旧金山分校（UCSF）的 Erik Ullian 博士在这些实验方案设计方面提供的学术指导，感谢美国国立卫生研究院（NIH）的 Michael Ward 博士在诱导神经元分化技术方面的建议，以及 Saba Barlas 在初步图像分析方面的工作。

1. 细胞培养与试剂配制
注意：本节中的实验方案按照其在分化方案（第 2 节）中出现的顺序编写。有关材料及目录编号，请参见材料表。
<ol>
	<li>准备用于细胞培养的包被板。
	<ol>
		<li>将细胞外基质（ECM）包被溶液用DMEM/F12培养基稀释，配制浓度为1 mg/mL的储存液。将稀释后的ECM储存液分装至30个锥形管中，每管3 mL，并立即于-20 °C保存。使用前，取3 mL ECM储存液加入33 mL预冷的DMEM/F12培养基中，终体积为36 mL，得到浓度为80 µg/mL的工作液。</li>
		<li>用ECM工作液以每孔1 mL的量包被6孔细胞培养板。每孔额外加入1 mL DMEM/F12培养基（如需要），以确保孔底表面完全被覆盖。将包被好的6孔板在室温下静置至少1小时后使用。 
		注意：包被后的培养板可在培养箱或4 °C保存最多2周。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>准备培养基配方、生长因子和小分子化合物。
	<ol>
		<li>配制500 mL人多能干细胞（hPSC）培养基27时，按照生产商说明书添加20x和500x补充剂。</li>
		<li>配制500 mL神经培养基（NM）时，向含L-谷氨酰胺补充剂的500 mL DMEM/F12培养基中加入肝素至终浓度为2 mg/mL，以及1x抗生素/抗真菌溶液、1x B27补充剂或1x N2补充剂，具体如前所述28。</li>
		<li>配制10 mM（1,000x）浓度的Rho激酶抑制剂Y27632（Y）储存液：将10 mg粉末溶于3 mL磷酸盐缓冲液（PBS）中。过滤除菌后分装，并于-20 °C保存。使用时在培养基中的工作浓度为10 µM。</li>
		<li>配制20 mM（10,000x）浓度的SB431542储存液：将10 mg粉末溶于1.3 mL二甲基亚砜（DMSO）中；配制2 mM（1,000x）浓度的DMH1储存液：将10 mg粉末溶于13.1 mL DMSO中。过滤除菌后分别分装，并于-20 °C保存。使用时在培养基中的工作浓度均为2 µM（NM + SB431542 + DMH1）。 
		注意：本方案推荐SB431542和DMH1的工作浓度均为2 µM，依据为我们的观察结果及他人报道29，表明该浓度可有效促进hPSC向神经方向诱导。也有文献报道使用更高浓度30。此外，在其他培养体系中已有研究表明，小分子化合物并非实现高效神经转化所必需31。因此，最佳工作浓度可能因不同的细胞培养环境而异，需由研究人员根据实际情况进行优化测试。</li>
		<li>分别配制100 µg/mL（10,000x）浓度的表皮生长因子（EGF）和成纤维细胞生长因子-2（FGF2）储存液：将各1 mg粉末分别溶于10 mL含0.1% BSA的PBS中。将EGF和FGF2储存液分装为每份50 µL，并于-80 °C保存。使用时在培养基中的工作浓度为10 ng/mL；例如，向50 mL NM中加入5 µL EGF和5 µL FGF2（NM + EGF + FGF2）。</li>
		<li>配制盐酸多西环素（Dox）储存液时，先将粉末溶于DMSO中至100 mg/mL，于-20 °C保存。再用PBS稀释为2 mg/mL（1,000x）的储存液，并于-20 °C保存。使用时在培养基中的工作浓度为2 µg/mL；例如，向50 mL NM中加入50 µL Dox（NM + Dox）。 
		注意：溶液解冻后请勿再次冷冻。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 由人诱导性多能干细胞（hPSCs）生成神经亚型
注意：所有细胞培养物均应在含 5% CO2 的 37 °C 培养箱中进行培养。这些培养物维持在室温氧浓度下，但也可使用较低的氧浓度。
<ol>
	<li>从人多能干细胞（hPSCs）中生成并维持星形胶质细胞前体细胞（hAstros）。 
	注意：本节提供一个简要且简化的分化方案。如需详细描述（包括拟胚体形成、神经玫瑰花结选择及区域模式化步骤），请参考先前报道的方案28（图1A，绿色虚线框）。
	<ol>
		<li>将hPSC细胞团（图1B）接种至经细胞外基质（ECM）包被的6孔板中，每孔加入2 mL hPSC培养基 + Y。每日换液，直至细胞融合度约达50%，根据需要进行传代。
		<ol>
			<li>传代hPSC时，向孔中加入1 mL传代试剂，1分钟后吸除，室温孵育5分钟，加入1 mL hPSC培养基，将细胞团以1:10比例传代至新的ECM包被孔中，每孔加入2 mL hPSC培养基 + Y。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>维持干细胞培养至融合度约50%后，更换为NM + SB431542 + DMH1培养基以诱导神经分化（第0天）。当细胞融合度达约95%时，以1:6比例传代至新的ECM包被孔中，使用相同培养基。</li>
		<li>第14天，使用解离溶液解离细胞，并转移至未包被的培养瓶中，加入Y以促进细胞团聚集。 
		注意：添加Y可促进细胞存活和球体形成，但并非每次换液均需添加。</li>
		<li>如需生成神经前体细胞和神经元（hNeurons），可使用第14天的细胞，具体方法如下。或者，在神经元成熟或胶质发生启动之前，也可在后续时间点从单层或球体培养中取用这些细胞。 
		注意：默认情况下，本方案生成背侧皮层来源的星形胶质细胞。但如需获得特定区域亚型的星形胶质细胞，可通过添加模式化形态发生素实现28,32,33。添加视黄酸（RA）可使细胞向脊髓表型尾侧化，而 sonic hedgehog（SHH）、smoothened激动剂（SAG）或purmorphamine可诱导腹侧表型。</li>
		<li>如需在自发形成的三维细胞团（hAstrospheres）中生成星形胶质前体细胞和星形胶质细胞，更换为NM + EGF + FGF2培养基，每周换液一次（或根据需要维持稳定pH），具体操作如前所述34。
		<ol>
			<li>当细胞团出现深色中心时，使用解离溶液轻柔解离hAstro细胞团，并移除自发贴壁的球体。每周轻柔吹打破碎球体一次，以维持球体健康，避免形成坏死核心。 
			注意：解离溶液处理时间不得超过5分钟。</li>
			<li>经过4–6个月扩增后，确认细胞身份，可选择按照说明书使用冻存液冻存，或采用其他适宜条件长期保存于液氮中，也可直接用于实验。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>复苏冻存的hAstrospheres时，将冻存管在室温下快速解冻，转移内容物至一个空的15 mL离心管中，以300 ×g离心1分钟。小心吸除上清，用DMEM/F12洗涤一次，重复洗涤共两次。将细胞重悬于T25培养瓶中，加入总量为6 mL的NM + EGF + FGF2 + Y培养基（或根据需要按比例放大）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>从人多能干细胞（hPSCs）中生成并维持可诱导神经元（iNeurons）。
	<ol>
		<li>将转基因hPSCs（携带稳定表达的多西环素诱导型neurogenin 2转基因35）接种至ECM包被的6孔板中，每孔加入2 mL hPSC培养基 + Y（接种方法同非转基因细胞系）。每日每孔换液2 mL，直至细胞融合度达70%时准备传代。传代方法见步骤2.1.2。</li>
		<li>当细胞融合度约达35%时，加入NM + Dox以诱导分化为iNeurons。在进入步骤3.2前，以NM + Dox维持单层培养2天。 
		注意：细胞将转变为神经前体细胞，但尚未开始延伸神经突（图1C）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 三维球体共培养物的制备与维持
<ol>
	<li>将悬浮状态的3D聚集体中的hAstros解离（如步骤2.1.5.1所述）。</li>
	<li>从2D单层培养物中解离hNeurons或iNeurons。
	<ol>
		<li>从6孔板中移除培养基，并向每孔含有单层培养物的孔中加入500 µL解离溶液。在37 °C下孵育5分钟。轻轻加入2–3 mL DMEM/F12以去除贴壁细胞。</li>
		<li>收集细胞和培养基至15 mL锥形管中，在300 xg下离心1分钟。吸除上清液，加入1 mL新鲜培养基，并使用1,000 µL移液器轻轻吹打数次，以获得单细胞悬液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用微孔培养板形成3D球体。
	<ol>
		<li>通过向微孔板的每个孔中加入0.5 mL抗黏附冲洗液来准备板。在2,000 xg下离心板5分钟。吸除冲洗液，向每孔加入1 mL DMEM/F12进行洗涤，然后再次吸除。 
		注意：使用离心机时务必确保其处于平衡状态。</li>
		<li>使用血细胞计数板或自动细胞计数器对每种细胞类型进行计数。将解离后的hAstros与hNeurons或iNeurons按所需比例加入各孔中，总体积为2 mL NM + Y（若使用iNeurons，则包含Dox）。在100 xg下离心板3分钟，然后放回培养箱。 
		注意：24孔微孔板（见材料表）每孔包含300个微孔。每孔在2 mL培养基中至少加入6 × 105个细胞（每个球体含2 × 103个细胞），最多加入6 × 106个细胞（每个球体含2 × 104个细胞）。若需在此范围内获得特定密度的可存活球体，请使用确定数量的细胞并除以300，以计算每个球体的细胞数。如有需要，也可使用其他球体形成方法和工具。请遵循制造商关于细胞密度可接受范围的说明。</li>
		<li>在接下来的2天内，让细胞在微孔板中自组装成紧密堆积的球体（图2A）。若培养基变黄，则更换50%的培养基。 
		注意：更换培养基时仅替换一半体积，并在移除和添加培养基时轻柔操作移液器，以免扰动球体。施加较大力量可能导致球体从微孔中脱离并相互融合。</li>
		<li>2天后，使用1,000 µL移液器轻轻将球体从微孔中移出（图1D）。用培养基轻轻施力于微孔底部，以去除任何额外黏附的球体。让球体在15 mL锥形管中沉降，吸除旧培养基，并加入新鲜培养基。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>设置旋转烧瓶生物反应器系统以形成3D球体。
	<ol>
		<li>用70%乙醇清洁磁力搅拌板表面，并将其放入细胞培养箱中。对各个旋转烧瓶进行高压灭菌以实现消毒。</li>
		<li>向每个旋转烧瓶中加入球体及至少50–60 mL培养基（图1D，插图）。将烧瓶置于设定为60 rpm的磁力搅拌板上。在旋转烧瓶中培养球体直至准备进行数据采集。 
		注意：需要至少3周的培养时间以实现突触形成。若不希望使用旋转烧瓶生物反应器系统，也可在静止条件下于细胞培养瓶或培养皿中培养球体。球体也可包埋于ECM或水凝胶中。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 使用多电极阵列（MEAs）测量活体突触生理学
<ol>
	<li>准备用于细胞培养的多电极阵列（MEA）。
	<ol>
		<li>用1 mL去污剂清洁每个多电极阵列（MEA）表面，持续1小时。用无菌去离子水（DI水）冲洗，再用70%乙醇冲洗以灭菌，然后在生物安全柜内的紫外光下风干。 
		注意：多电极阵列（MEA）可在无菌条件下保存于4 °C的去离子水中，直至使用。</li>
		<li>将50 mg多聚鸟氨酸（PLO）溶解于100 mL硼酸缓冲液中，配制成0.5 mg/mL的PLO溶液。在每个多电极阵列（MEA）表面加入1 mL PLO溶液，使表面具有亲水性，并在37 °C下孵育至少4小时。去除PLO溶液，用去离子水清洗表面，加入1 mL细胞外基质（ECM）（见步骤1.1.1），并在37 °C下孵育至少4小时。</li>
		<li>去除细胞外基质（ECM），将神经球置于1.5 mL培养基中，放置在多电极阵列（MEA）表面，确保神经球位于电极阵列上方（图3A、3A’）。使其贴附2天。每2–3天更换一半培养基（必要时可更频繁），注意避免扰动神经球。 
		注意：添加生长因子可能有助于提高培养物的存活率和成熟度。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>测量神经球的电活动。
	<ol>
		<li>设置一个多电极阵列（MEA）系统，配备温度控制的前置放大器。创建一个软件程序，设置高通滤波器为5 Hz，低通滤波器为200 Hz，动作电位检测阈值为5倍标准差（SD）。</li>
		<li>将多电极阵列（MEA）放置在前置放大器上，记录自发性电活动（图3B、B’）。保存原始数据，包括动作电位频率和振幅，用于统计分析。 
		注意：可结合灌流系统使用多电极阵列（MEA），以便添加药理学试剂或在长期记录期间增加新鲜培养基的流动。可根据需要对动作电位进行进一步的后处理36，37。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 使用免疫细胞化学法测量突触密度
<ol>
	<li>准备试剂。
	<ol>
		<li>配制 500 mL 的 4% 多聚甲醛（PFA）储备液：在通风橱内的玻璃烧杯或搅拌板上加入 400 mL 的 1× PBS，放入搅拌子，加热至 60 °C 并持续搅拌，切勿煮沸。将 20 g PFA 粉末加入加热的 PBS 溶液中，并逐滴缓慢加入 1 N NaOH，调节 pH 至 6.9。 
		注意：4% PFA 溶液可分装后于 4 °C 保存，最长可保存一个月。</li>
		<li>向 100 mL PBS 中分别加入 20 g 或 30 g 蔗糖，配制成 20% 和 30% 的蔗糖溶液。</li>
		<li>向 10 mL PBS 中加入 1 mL 去垢剂，配制 10% 储备液，反复倒置数次以混匀。</li>
		<li>向 10 mL PBS 中加入 250 µL 10% 去垢剂储备液（终浓度为 0.25%），以及山羊和驴血清各 500 µL（终浓度均为 5%），配制一抗封闭缓冲液。</li>
		<li>向 10 mL PBS 中加入山羊和驴血清各 100 µL（终浓度均为 1%），配制二抗封闭缓冲液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>准备样品。
	<ol>
		<li>将类球体转移至 15 mL 圆锥管中，静置使其沉降至管底，吸除旧培养基。用 500 µL PBS 清洗类球体一次，静置沉降后吸除 PBS。加入 500 µL 4% PFA（或足量以完全覆盖类球体），于 4 °C 孵育 30 分钟。</li>
		<li>吸除 PFA 溶液，用 PBS 轻柔洗涤两次。加入 20% 蔗糖溶液，于 4 °C 孵育数小时或过夜。小心吸除溶液后，加入 30% 蔗糖溶液，于 4 °C 继续孵育数小时或过夜。 
		注意：样品可在 PBS 或蔗糖溶液中于 4 °C 保存最多一周后再进行下一步操作。若不进行切片，可将类球体保持为三维结构（图 4A-C），置于 1.5 mL 管中，直接进入步骤 5.3。</li>
		<li>若需切片，将类球体小心转移至置于干冰上的冷冻包埋模具中。吸除 30% 蔗糖溶液，缓慢加入组织包埋液直至完全覆盖样品，避免产生气泡。待溶液完全冻结后，于 -80 °C 保存，直至进行冷冻切片。</li>
		<li>使用 -20 °C 的冷冻切片机将包埋块切成 30 µm 厚的切片（或按需调整厚度），转移至载玻片上。切片可于 -80 °C 保存，直至染色使用。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>对类球体进行免疫染色。
	<ol>
		<li>使用疏水性 PAP 笔在载玻片边缘划线，防止液体溢出。根据材料表配制一抗和二抗封闭溶液。每张载玻片或管中加入 500 µL 一抗封闭缓冲液，室温孵育 30 分钟。</li>
		<li>吸除液体，每张载玻片或管中加入含稀释后一抗的 500 µL 新鲜一抗封闭缓冲液，于 4 °C 过夜孵育。移除一抗溶液，用 PBS 洗涤 3 次，每次 10 分钟。</li>
		<li>每张载玻片或管中加入含稀释后二抗的 500 µL 二抗封闭缓冲液，于 4 °C 孵育 1 小时。移除二抗溶液，用 PBS 洗涤 3 次，每次 10 分钟。 
		注意：材料表中列出了推荐使用的抗体，也可根据需要选用其他抗体或染料。自步骤 5.3.3 起，避免荧光样品暴露于光照下。</li>
		<li>滴加 50 µL 封片液覆盖样品表面，小心盖上盖玻片，避免产生气泡。室温干燥 24 小时后，于 4 °C 保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>成像分析载玻片。
	<ol>
		<li>使用配备 63X 油镜的共聚焦或双光子荧光显微镜对类球体切片中的突触前和突触后蛋白丰度及其共定位进行成像（图 4D）。使用 20X 或 40X 物镜观察 hAstros 的形态学特征。</li>
		<li>使用 ImageJ 软件打开荧光图像文件。使用 Cell Counter 插件手动计数突触前和突触后斑点，采用无偏倚计数方法（如先前文献38所述），或使用其他替代方法进行分析。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

在本实验方案中，我们描述了一种系统性方法，用于生成神经共培养的三维球体。这些球体由星形胶质细胞和神经元组成，二者均独立来源于人多能干细胞（hPSCs）。尽管本方案的重点不在于此，但从hPSCs中获得高纯度星形胶质细胞群体28是其中关键且技术上具有挑战性的步骤，若缺乏前期经验，操作难度较大。在构建这些突触微环路的过程中，第一步必须严格把握时间并注重操作细节。使用hPSC来源的星形胶质细胞的一个局限性在于其分化周期较长；然而，通过预先大量制备细胞并冻存以备后续实验时解冻使用（见步骤2.1.5），可避免每次均从初始的hPSC阶段重新开始。尽管由转基因hPSCs生成的诱导神经元（iNeurons）本身具有突触形成能力，并能表现出自发性突触后电活动，但这些特性在胶质细胞存在时显著增强12,35——包括本方案中详述的hAstros。因此需注意，细胞类型、数量以及发育阶段或成熟度的选择是本方案中的关键因素，任何调整均可能导致电活动特征或突触可视化结果的差异。然而，本方案也允许研究者根据自...

星形胶质细胞是中枢神经系统（CNS）中数量极为丰富的胶质细胞类型，其功能远不止提供结构支持。通过分泌可溶性突触生成因子和细胞外基质（ECM）成分，星形胶质细胞在发育过程中促进成熟突触的形成与聚集1。它们还通过细胞外信号传导在维持突触健康和可塑性方面发挥关键作用2,3,4,5，并通过调节细胞外钾离子和谷氨酸水平，以及分泌能量底物和ATP，参与内环境稳态的长期稳定6,7,8。此外，星形胶质细胞可通过影响突触外电流参与神经传递9，并可通过影响其他细胞类型（如促进髓鞘形成10）间接调控神经活动。重要的是，由于星形胶质细胞的异常或功能障碍可导致多种神经发育综合征及成年期神经病理改变，因此为了更真实地模拟内源性脑环境，有必要在构建的神经网络中将星形胶质细胞与神经元共同纳入。星形胶质细胞的一个重要特征是其能够与神经元突触形成动态相互作用1,11,12。在缺乏胶质细胞的情况下，神经元形成的突触数量有限，且这些突触通常缺乏功能上的成熟性13。
人类星形胶质细胞表现出形态学、转录组学和功能上的特征——例如体积增大、分支更为复杂，以及具有物种特异性的基因——这些特征在啮齿类动物中并未重现12,14,15因此，利用人多能干细胞（hPSC）衍生的神经细胞开展研究已被广泛接受为研究中枢神经系统相关疾病的一种手段。 体外 在开发新疗法、损伤模型和培养范式的同时16,17此外，人多能干细胞（hPSCs）使得无需使用原代组织即可研究人类突触的形成与功能18,19.
目前对各类细胞类型和信号如何影响突触环路功能的理解存在障碍，其主要原因在于缺乏与人类大脑相关联的模型。迫切需要一个合适的平台，以高保真度和可重复性重现大脑的突触网络。近年来，人们开始关注三维（3D）培养系统（通常称为“类器官”、“球状体”或“迷你大脑”）20的构建，用于在细胞和宏观层面模拟复杂的三维结构。三维培养系统能够保留细胞外基质（ECM）以及细胞间的相互作用，而这些在传统的二维共培养模式中通常缺失或受限21,22。目前已有多种技术可用于培养三维神经球状体23,24,25；然而，许多方法需要漫长的培养周期（数月到数年），以实现自发发育和分层结构的维持，且实验者对最终结果的控制能力非常有限。
本文介绍了一种系统性方法，通过将人多能干细胞（hPSCs）来源的多种细胞类型（预先分化的神经元和星形胶质细胞）组装成球形共培养体系（“asteroids”）26，从而在三维环境中快速且稳定地构建神经相互作用，重现人类特有的形态复杂性。该高密度神经体系可生成均匀分布的神经亚型，随时间推移逐渐获得成熟特性，并可用于高通量筛选或检测。我们首次证明，在此类三维共培养体系中，人源星形胶质细胞可诱导突触网络簇状放电活动。此外，本实验方案易于调整，可用于生成不同大小的细胞球，适用于具有不同中枢神经系统区域特征的细胞，并可根据需要研究多种其他细胞类型之间的相互作用。

<table><tbody><tr><td>6 孔板</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772-1B</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 圆锥形离心管</td><td>Olympus Plastics</td><td>28-101</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Sigma</td><td>A6964-100ML</td><td>细胞解离溶液</td></tr><tr><td>AggreWell 板</td><td>Stemcell Technologies</td><td>34850</td><td></td></tr><tr><td>防粘附冲洗液</td><td>Stemcell Technologies</td><td>7010</td><td>防止细胞粘附至微孔板</td></tr><tr><td>Anti/anti</td><td>Thermofisher</td><td>15240062</td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>Thermofisher</td><td>17504044</td><td>培养基添加剂</td></tr><tr><td>BrainPhys 神经元培养基</td><td>Stemcell Technologies</td><td>5790</td><td>神经生理学基础培养基替代品</td></tr><tr><td>圆形玻璃盖玻片</td><td>Neuvitro</td><td>GG-12-oz</td><td></td></tr><tr><td>Cryostor CS10</td><td>Stemcell Technologies</td><td>7930</td><td>含 10% DMSO 的冷冻保存培养基</td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Thermofisher</td><td>10565-042</td><td>含 GlutaMAX 添加剂</td></tr><tr><td>DMH-1</td><td>Stemcell Technologies</td><td>73634</td><td>危险：吞咽有毒。工作浓度：2 &amp;mu;M</td></tr><tr><td>驴血清</td><td>Lampire Biological Laboratories</td><td>7332100</td><td>工作浓度：一抗封闭缓冲液中为 5%，二抗封闭缓冲液中为 1%</td></tr><tr><td>盐酸多西环素（Dox）</td><td>Sigma</td><td>D3072-1ml</td><td>危险：对孕妇有毒。工作浓度：2 &amp;mu;g/mL</td></tr><tr><td>表皮生长因子（EGF）</td><td>Peprotech</td><td>AF-100-15</td><td>工作浓度：10 ng/mL</td></tr><tr><td>成纤维细胞生长因子-2（FGF）</td><td>Peprotech</td><td>100-18B</td><td>工作浓度：10 ng/mL</td></tr><tr><td>Fluoromount-G 封片液</td><td>Southern Biotech</td><td>0100-01</td><td></td></tr><tr><td>载玻片</td><td>Fisherbrand</td><td>22-037-246</td><td></td></tr><tr><td>山羊血清</td><td>Lampire Biological Laboratories</td><td>7332500</td><td>工作浓度：一抗封闭缓冲液中为 5%，二抗封闭缓冲液中为 1%</td></tr><tr><td>血细胞计数板或自动细胞计数仪</td><td>Life Technologies</td><td>AMQAX1000</td><td></td></tr><tr><td>肝素</td><td>Sigma</td><td>H3149-50KU</td><td>工作浓度：2 mg/mL</td></tr><tr><td>磁力板</td><td>DLAB</td><td>8030170200</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel 基质膜</td><td>Corning</td><td>354230</td><td>ECM 包被溶液。工作浓度：80 &amp;mu;g/mL。需在冰上配制，并确保移液器、离心管和培养基预先冷却。</td></tr><tr><td>MEA 2100 系统</td><td>Multichannel Systems</td><td>MEA2100</td><td></td></tr><tr><td>封片液</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>N2</td><td>Thermofisher</td><td>17502048</td><td>培养基添加剂</td></tr><tr><td>OCT</td><td>Tissue-Tek</td><td>4583</td><td>冷冻切片组织包埋液</td></tr><tr><td>疏水笔（Aqua Hold）</td><td>Scientific Device Laboratory</td><td>9804-02</td><td></td></tr><tr><td>多聚甲醛（PFA）</td><td>Acros Organics</td><td>169650025</td><td>危险：吸入有毒。工作浓度：4% PBS 溶液</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>Stemcell Technologies</td><td>CA008-300</td><td></td></tr><tr><td>多聚-L-鸟氨酸（PLO）</td><td>Sigma</td><td>P3655-100MG</td><td>工作浓度：0.5 mg/mL</td></tr><tr><td>矩形玻璃盖玻片</td><td>Fisherfinest Premium Superslip</td><td>12-545-88</td><td></td></tr><tr><td>ReLeSR</td><td>Stemcell Technologies</td><td>5872</td><td>细胞解离与传代试剂</td></tr><tr><td>Rho 激酶抑制剂 Y27632-（Y）</td><td>Tocris</td><td>1254</td><td>工作浓度：10 uM</td></tr><tr><td>SB431542</td><td>Stemcell Technologies</td><td>72234</td><td>工作浓度：2 &amp;mu;M</td></tr><tr><td>旋转培养瓶</td><td>Fisher Scientific</td><td>4500-125</td><td></td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>Fisher Chemical</td><td>S5-3</td><td>工作浓度：20% 或 30% PBS 溶液</td></tr><tr><td>T25 培养瓶</td><td>Olympus Plastics</td><td>25-207</td><td>带透气盖</td></tr><tr><td>T75 培养瓶</td><td>Olympus Plastics</td><td>25-209</td><td>带透气盖</td></tr><tr><td>Terg-A-zyme</td><td>Sigma</td><td>Z273287-1EA</td><td>洗涤剂。工作浓度：1%</td></tr><tr><td>TeSR-E8 基础培养基</td><td>Stemcell Technologies</td><td>5940</td><td>人多能干细胞（hPSC）培养基</td></tr><tr><td>TeSR-E8 添加剂</td><td>Stemcell Technologies</td><td>5940</td><td>人多能干细胞培养基添加剂</td></tr><tr><td>TritonX-100</td><td>Sigma</td><td>X100-500ML</td><td>用于细胞通透的洗涤剂。工作浓度：封闭缓冲液中为 0.25%</td></tr><tr><td>台盼蓝</td><td>Invitrogen</td><td>T10282</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;抗体&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>AlexaFluor 488</td><td>Thermofisher</td><td>A-11029</td><td>二抗</td></tr><tr><td>AlexaFluor 594</td><td>Thermofisher</td><td>A-11037</td><td>二抗</td></tr><tr><td>Ezrin</td><td>Thermofisher</td><td>MA5-13862</td><td>一抗；星形胶质细胞突触周围标记</td></tr><tr><td>GFAP</td><td>Chemicon</td><td>MAB360</td><td>一抗；星形胶质细胞</td></tr><tr><td>GFP</td><td>Aves</td><td>GFP-1020</td><td>一抗；星形胶质细胞</td></tr><tr><td>Glt1</td><td>Jeffrey Rothstein 博士惠赠</td><td>n/a</td><td>一抗；星形胶质细胞</td></tr><tr><td>Homer</td><td>Synaptic Systems</td><td>160 011</td><td>一抗；神经元，突触后</td></tr><tr><td>MAP2</td><td>Synaptic Systems</td><td>188 004</td><td>一抗；神经元</td></tr><tr><td>PSD95</td><td>Abcam</td><td>ab2723</td><td>一抗；神经元，突触后</td></tr><tr><td>S100</td><td>Abcam</td><td>ab868</td><td>一抗；星形胶质细胞</td></tr><tr><td>Synapsin 1</td><td>Synaptic Systems</td><td>106 103</td><td>一抗；神经元，突触前</td></tr><tr><td>TuJ1/&amp;beta;3-微管蛋白（TUBB3）</td><td>Covance</td><td>MMS-435P</td><td>一抗；神经元</td></tr></tbody></table>

利用人多能干细胞来源的星形胶质细胞与神经元三维共培养构建突触微环路模型

Synaptic Microcircuit Modeling with 3D Cocultures of Astrocytes and Neurons from Human Pluripotent Stem Cells

目前，研究各种细胞类型和信号如何参与突触环路功能的主要障碍之一，是缺乏可用于研究人脑的合适模型。为解决这一问题，一种新兴技术是采用三维（3D）神经细胞培养系统，即所谓的“类器官”或“球状体”，以长期维持包括细胞外黏附分子在内的细胞间相互作用。然而，这些培养体系耗时较长，且难以实现系统性制备。本文详细介绍了一种利用人多能干细胞快速且稳定地生成神经元与星形胶质细胞三维共培养体系的方法。首先，将预先分化好的星形胶质细胞和神经前体细胞进行解离并计数。随后，将细胞以特定比例混合，并加入Rho激酶抑制剂，接种于成球培养皿中，以形成大小可重复的细胞球。经过数周悬浮培养后，共培养物（“星状体”，asteroids）可被切片用于免疫染色，或接种至多电极阵列上，以检测突触密度和突触强度。总体而言，本方案预期可获得表达成熟细胞类型特异性标志物、形成功能性突触并表现出自发性突触网络簇状放电活性的三维神经球。该体系相较于单层培养模型，更适用于药物筛选以及疾病机制的研究。

若操作得当，本方案将产生由人多能干细胞（hPSCs）分化而来的功能明确的星形胶质细胞28,33,34与神经元35共培养体系（图1A-1C），具体方法如前文所述26，并在本方案的2.1–2.2步骤中详细描述。该分步操作结合微孔板的使用，预期可生成大小和形状均一的三维神经球（步骤3.3；图1D），细胞分布均匀，且无明显细胞死亡迹象。在不同起始细胞密度和目标细胞类型比例下，可形成尺寸各异的神经球。若未使用微孔板，细胞将聚集成显著更大且不均一的团块，其直径（> 2 mm）超出扩散极限（图2A...

在本实验方案中，我们旨在描述一种可重复的方法，用于将解离的人多能干细胞来源的神经元与星形胶质细胞共同组合形成三维球状共培养体系，在悬浮条件下维持这些细胞球的生长，并随后通过免疫分析和多电极阵列记录来检测细胞球中突触环路的活性。

阻碍我们理解不同类型细胞和信号如何参与突触环路功能的一个因素是缺乏用于研究的相关模型……

该方法有助于解答神经科学领域的关键问题，即多种人类神经细胞类型之间的细胞间通讯如何参与突触环路的形成与功能。该技术可从人类多能干细胞快速、系统地生成包含功能成熟星形胶质细胞和神经元的三维共培养球体，可用于严格的实验研究。该方案具有可重复性和可扩展性，是新兴类器官技术的一种明确替代方法。这些技术在新型药物开发和促进损伤或疾病后神经再生的细胞移植治疗方面展现出广阔前景。首先，将人多能干细胞（HPSC）细胞簇接种于已包被细胞外基质（ECM）的六孔板中，每孔加入含有ROCK抑制剂Y-27632的2 mL HPSC培养基。将干细胞培养至约50%融合度，然后更换为含有SB431542和DMH1的神经诱导培养基，以促进神经诱导。当细胞融合度达到约95%时，将每孔按1:6比例传代至新的ECM包被的孔中。第14天使用解离溶液消化细胞，并将每孔细胞悬液转移至未包被的T25培养瓶中，培养基中加入Y-27632，以促进细胞聚集体的形成。为了在自发形成的三维聚集体中生成星形胶质细胞前体细胞和星形胶质细胞，需更换为含有EGF和FGF2的神经培养基，并每三至四天换液一次，直至四到六个月时确认星形胶质细胞身份。默认情况下，本方案产生的是背侧皮层星形胶质细胞。然而，如需要，可通过添加模式形成因子（patterning morphogens）对星形胶质细胞亚型进行区域特异性诱导。每周一次，当出现深色中心时，通过离心收集球体，然后用解离液轻柔解离H-astro聚集体。仅重新接种那些不会自发贴壁的球体，以避免传代非中枢神经系统和非神经细胞。在扩增培养四到六个月后，按照制造商说明书，使用冻存或冷冻保存培养基确认细胞身份，或立即用于实验。为了生成非转基因神经元前体细胞以获得神经元（H-神经元），将第14天由人多能干细胞（HPSC）衍生的神经前体细胞接种至包被细胞外基质（ECM）的六孔板中，每孔加入2毫升神经培养基和Y-27632。若使用多西环素诱导型iNeuron细胞系，当细胞融合度约为35%时，加入含多西环素的神经培养基以诱导分化并激活基因表达。两天后，每天为转基因和非转基因细胞系更换培养基，每孔加入2毫升神经培养基。继续培养直至细胞在70%融合度时准备脱落。对于共培养，首先用解离液轻轻解离3D聚集体中的H-astro，然后继续从2D单层中解离H-神经元或i神经元。首先，从六孔板中移除培养基，向每孔单层培养物中加入 500 微升解离液。在 37 摄氏度下孵育 5 分钟。孵育结束后，轻轻加入 2 至 3 毫升 DMEM-F12 培养基以去除贴壁细胞。然后，将含有细胞的培养基收集到15毫升的锥形离心管中，在300 × g条件下离心1分钟。吸除上清液，加入1毫升新鲜培养基，用1,000微升移液器轻轻吹打数次，以获得单细胞悬液。使用血细胞计数板或自动细胞计数仪对每种细胞进行计数。将解离后的H-星形胶质细胞和H-神经元或iNeurons按所需比例加入至微孔板的每个孔中，总体积为2毫升。以100 × g离心3分钟，然后放回培养箱中培养2天。1天后，微孔板中应已形成致密的微球体。使用1,000微升微量移液器轻轻从微孔中移出球状体。用培养基轻轻施加压力于微孔底部，以去除任何额外附着的球状体。收集所有球状体至15毫升锥形管后，静置使其沉降。随后通过先吸除旧培养基，再加入至少两毫升新鲜培养基来洗涤细胞球。将细胞球加入含有50至60毫升培养基的旋转培养瓶中。将培养瓶置于培养箱内的磁力搅拌器上，转速设为60 RPM。 培养至少三周后才能形成突触。首先，在每个多电极阵列（MEA）表面涂覆一毫升多聚鸟氨酸，使表面具有亲水性，并在37摄氏度下孵育至少四小时。孵育结束后，移除多聚鸟氨酸，并用去离子水清洗每个MEA的表面。然后加入一毫升细胞外基质，放回培养箱中孵育至少四小时。准备就绪后，移除细胞外基质，将球体以1.5毫升培养基接种到MEA表面，确保球体位于电极阵列上方。静置使其贴附两天。为了测量神经球的电活动，将MEA放置在温度可控的记录台阶段。使用5赫兹高通滤波器和200赫兹低通滤波器，并将尖峰阈值设为标准差的5倍，以记录自发性电活动。保存原始数据，包括用于统计分析的尖峰频率和振幅。神经细胞类型特异性的蛋白标志物，例如神经元的MAP2和星形胶质细胞的GFAP，可直观显示在三维球体中星形胶质细胞在神经元内均匀分布及其成熟状态。代表性三维球体展示了星形胶质细胞形态与分支的最大投影图像，其中H-星形胶质细胞稀疏地标记了膜结合型GFP。成熟的H-星形胶质细胞表达包括GFAP在内的多种标志物。尽管iNeurons表达突触前和突触后蛋白（如左侧图像所示），但H-astros的存在以及共培养显著增强了突触密度。在记录过程中，放置于MEA上的健康iNeurons球状体可自发产生幅度超过40微伏（µV）的电压尖峰，并具有稳定的放电频率。共培养的球状体在H-astros存在下表现出更强的神经网络连接性，导致同步性网络簇状放电增加。采用此方法后，还可进行钙成像等其他实验，以检测星形胶质细胞对突触活动的生理反应。此外，可通过将细胞移植至动物模型中，研究其与已有突触回路的连接性。通过遵循这一生物工程方法，可将细胞外生物材料以及少突胶质细胞、小胶质细胞和内皮细胞等其他细胞类型以特定比例整合，从而模拟大脑中复杂的信号传导过程。

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科研

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发育生物学

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构建耦合微电极阵列的三维神经元网络

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本视频演示了一种共培养星形胶质细胞与神经元以形成三维球体的方法。这些三维球体为研究突触形成和神经网络整合提供了独特的平台，因而可作为发育神经科学、神经退行性疾病以及神经药理学干预研究的潜在模型。...

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本视频展示了建立神经元-星形胶质细胞共培养体系以记录神经元网络活动的方法。将运动神经元与星形胶质细胞共培养于多电极阵列（MEA）培养板上后，利用MEA对外记录神经元网络的同步节律性电活动。...

记录神经元-星形胶质细胞共培养体系中神经网络的电生理活动

本文描述了一种建立共培养体系的方案，该体系包含由诱导性多能干细胞（iPSCs）衍生的神经元、原代皮层神经元以及星形胶质细胞。该共培养系统可用于检测新生成的、由iPSCs衍生的神经元与已存在的表达光敏通道蛋白-2（channelrhodopsin-2）的皮层神经元之间突触连接和神经回路的形成。...

一种用于评估共培养系统中神经元连接形成的光遗传学方法

本研究介绍了一种新颖的实验模型，该模型将三维神经元培养物与平面微电极阵列（MEAs）相结合。三维神经网络通过在由玻璃微珠构成的支架上接种神经元而构建，神经元在支架上生长并形成相互连接的三维结构。...

将三维工程化神经元培养物与微电极阵列连接：一种创新方法 体外 实验模型

我们修改并实施了一项先前发表的方案，该方案描述了将人 诱导 多能干细胞（hiPSCs）快速、可重复且高效地分化为兴奋性皮层神经元的方法12。具体而言，我们的改进可实现对神经元细胞密度的控制，并可在微电极阵列上应用，以在神经网络水平上检测其电生理特性。...

利用微电极阵列测量网络活性的诱导多能干细胞快速神经元分化

我们描述了一种用于诱导人源多能干细胞分化为脊髓星形胶质细胞和神经元，并将其共培养以进行电生理记录的方法。...

建立用于模拟肌萎缩侧索硬化症的电生理平台：采用区域特异性人多能干细胞来源的星形胶质细胞与神经元

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利用人iPSC来源的神经元-星形胶质细胞共培养体系进行三维生物打印以用于筛选应用

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