3D Cocultures 星形胶质细胞与人多潜能干细胞神经元的突触电路建模
2018年8月16日
在本协议中, 我们的目的是描述一种可重现的方法, 将分离的人类多能干细胞衍生神经元和星形胶质细胞组合成3D 球体 cocultures, 在自由漂浮条件下维持这些球体, 随后用 immunoanalysis 和多电极阵列记录测量球体的突触电路活动。
这种方法可以帮助回答神经科学中关于多种人类神经细胞类型之间的细胞间通讯如何促进突触回路形成和功能的关键问题。该技术从人类多能干细胞中快速、系统地生成功能成熟的星形胶质细胞和神经元的三维共培养球体。这些可用于严格的实验研究。
该协议的可重复性和可扩展性是新兴类器官技术的明确替代方案。这些显示出新药开发和细胞植入疗法的前景，以促进受伤或疾病后的神经再生。首先将 HPSCs 簇固定在含有 rho 激酶抑制剂 Y-27632 的两毫升 HPSC 培养基中，放入 ECM 包被的六孔板的每个孔中。
维持干细胞直到它们达到约 50% 汇合，然后将培养基更换为含有 SB431542 和 DMH1 的神经培养基以促进神经诱导。当细胞汇合度约为 95% 时，将每个孔分成 1 到 6 个新的 ECM 包被孔中。在第 14 天，用分离溶液解离细胞，并将每个孔的内容物转移到含有 Y-27632 的培养基的未包被的 T25 培养瓶中，以促进聚集体的形成。
要在自发形成的 3D 聚集体中生成星形胶质细胞祖细胞和星形胶质细胞，请改用含有 EGF 和 FGF2 的神经培养基，每 3 到 4 天喂食一次，直到在 4 到 6 个月时确认星形胶质细胞的身份。默认情况下，该协议产生背侧皮质星形胶质细胞。然而，如果需要，可以通过添加模式形态发生素在区域上指定星形胶质细胞亚型。
每周一次，当出现暗中心时，通过离心收集球体，然后用分离溶液轻轻解离 H-astro 聚集体。仅重新接种那些不会自发附着的球体，以避免传代非 CNS 和非神经细胞。扩增 4 到 6 个月后，按照制造商的说明在冷冻和冷冻保存培养基中确认细胞身份，或立即用于实验。
为了在神经元或 H 神经元中产生非转基因神经元祖细胞，将第 14 天 HPSC 衍生的神经祖细胞接种到 ECM 包被的六孔板中，每孔含有 2 毫升神经培养基和 Y-27632。如果使用多西环素诱导型 iNeurons，当细胞汇合度约为 35% 时添加含有多西环素的神经培养基，以诱导分化并激活基因表达。两天后，每天每孔用 2 毫升神经培养基喂养转基因和非转基因品系。
继续直到细胞准备好以 70% 汇合度提升。对于共培养，首先用分离溶液轻轻地将 H-astros 与 3D 聚集体解离。然后继续将 H 神经元或 iNeurons 从 2D 单层中解离。
首先，从六孔板中取出培养基，并向含有单层培养物的每个孔中加入 500 微升分离溶液。在 37 摄氏度下孵育 5 分钟。孵育后，轻轻加入 2 至 3 mL DMEM-F12 培养基以去除附着的细胞。
然后，将细胞收集在 15 mL 锥形管中的培养基中，并以 300 倍 G 离心 1 分钟。吸出上清液，加入 1 毫升新鲜培养基，然后用 1， 000 微升微量移液器轻轻上下移液，以获得单细胞悬液。使用血细胞计数器或自动细胞计数仪对每种细胞类型进行计数。
将所需比例的解离 H-astro 和 H 神经元或 iNeurons 加入到微孔板的每个孔中，总体积为 2 毫升。将板以 100 倍 G 离心 3 分钟，然后放回培养箱中 2 天。一天后，板中应该已经形成了致密的微球。
使用 1， 000 微升微量移液器轻轻地从微孔中取出球体。用介质轻轻地对微孔底部施加力，以去除任何其他粘附的球体。将所有球体收集到 15 毫升锥形管中后，静置。
然后通过先吸出旧培养基，然后加入至少 2 毫升新鲜培养基来洗涤球体。将球体添加到装有 50 至 60 mL 培养基的旋转瓶中。将培养瓶放入培养箱中，放在设置为 60 RPM 的磁力搅拌板上。
突触形成至少需要三周的培养时间。首先在每个多电极阵列 （MEA） 的表面涂上一毫升多鸟氨酸，以使表面亲水，并在 37 摄氏度下孵育至少四个小时。孵育后，去除多鸟氨酸，并用去离子水洗涤每个 MEA 的表面。
然后加入 1 毫升细胞外基质，放回培养箱中至少 4 小时。准备好后，去除细胞外基质，然后将 1.5 毫升培养基中的球体涂抹在 MEA 表面上，确保球体位于电极阵列的顶部。坚持两天。
要测量神经球的电活动，请将 MEA 放在温控头台上。使用 5 赫兹高通滤波器和 200 赫兹低通滤波器以及标准偏差 5 倍的尖峰阈值来记录自发性电活动。保存原始数据，包括尖峰频率和振幅，以便进行统计分析。
神经细胞型限制性蛋白标志物，例如神经元的 MAP2 和星形胶质细胞的 GFAP，直观地展示了 3D 球体内神经元中星形胶质细胞的均匀分散排列和成熟度。星形胶质细胞形态和分支的最大投影显示在具有代表性的 3D 球体中，其中 H-astros 稀疏地用膜结合的 GFP 标记。成熟的 H-astros 表达包括 GFAP 在内的标志物。
尽管 iNeurons 表达突触前和突触后蛋白，如左图所示，但 H-astros 和共培养的存在显着增强了突触密度。在记录过程中，放置在 MEA 上的健康 iNeurons 球体将自发引发大于 40 微伏的电压尖峰，并具有一致的发射频率。共培养球体在 H-astros 的存在下显示出更大的网络连接性，导致同步网络峰值突发的增加。
在此程序之后，可以进行其他方法，例如钙成像，以测量星形胶质细胞对突触活动的生理反应。此外，可以进行移植到动物模型中以研究与先前存在的突触回路的连接性。通过遵循这种生物工程方法，人们可以按特定比例结合细胞外生物材料和其他细胞类型，例如少突胶质细胞、微腺细胞和乙细胞，以模拟大脑中发生的复杂信号传导。
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概述
本协议描述了一种可重复的方法，用于创建人类多能干细胞衍生的神经元和星形胶质细胞的三维共培养。该方法允许使用免疫分析和多电极阵列记录来测量突触电路活动。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 细胞生物学
- 干细胞研究
背景
- 神经细胞类型之间的细胞间通讯对于突触电路形成至关重要。
- 人类多能干细胞可以分化为神经元和星形胶质细胞。
- 三维共培养系统为研究神经相互作用提供了更生理相关的环境。
- 该方法为类器官技术提供了一种可扩展的替代方案。
研究目的
- 研究人类神经细胞类型在突触电路活动中的作用。
- 开发一种可重复生成三维共培养的方法。
- 促进神经再生和药物开发的实验研究。
使用的方法
- 将人类多能干细胞的簇放置在ECM涂层的板中。
- 使用rho-激酶抑制剂Y-27632来增强细胞存活。
- 在自由悬浮条件下维持细胞以形成三维球体。
- 使用多电极阵列和免疫分析测量突触活动。
主要结果
- 成功生成功能成熟的星形胶质细胞和神经元的共培养。
- 在三维球体中展示了细胞间通讯和突触活动。
- 为未来的神经科学研究提供了一种可扩展的方法。
- 显示了在药物开发和神经再生疗法中的潜在应用。
结论
- 该方法是研究神经相互作用和电路形成的宝贵工具。
- 与传统方法相比，它提供了一种可重复和可扩展的方法。
- 未来的研究可以利用这种技术来推进神经科学的治疗进展。
常见问题
Executive Industry Relevance
Human pluripotent stem cell-derived 3D cocultures of neurons and astrocytes address the translational gap in modeling human synaptic microcircuits for early-stage neurotherapeutic discovery. This system enables reproducible, scalable interrogation of intercellular signaling and synaptic function, supporting predictive confidence in target validation and mechanistic de-risking. The approach positions R&D teams to evaluate disease-relevant neural interactions and screen compounds in physiologically relevant contexts.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of human-specific synaptic mechanisms and intercellular signaling.
- Supports functional target validation by measuring synaptic density and network activity.
- Facilitates mechanistic de-risking through controlled coculture ratios and cell-type specification.
- Provides a reproducible platform for hypothesis-driven pathway analysis.
Screening & Assay Development
- Delivers standardized 3D neural spheres for quantitative synaptic activity measurement.
- Enables high-content screening using multielectrode arrays for network burst analysis.
- Supports assay reproducibility and scalability for compound evaluation.
- Prepares validated biological systems for downstream screening workflows.
Translational & Preclinical Research
- Models disease-relevant neural microcircuits for translational biomarker alignment.
- Permits investigation of neuroregeneration and synaptic connectivity in preclinical settings.
- Enables continuity from discovery through preclinical validation using human-derived cells.
- Supports risk-adjusted advancement decisions based on functional synaptic outputs.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery continuum from early target validation through lead identification and preclinical research, providing a bridge between in vitro mechanistic studies and translational models.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing of synaptic function and intercellular communication in human neural systems.
- Screening: Provides reproducible, quantitative readouts of network activity for compound screening.
- Analytics: Enables statistical comparison of synaptic density, spike frequency, and network bursts across experimental conditions.
- Translational Research: Aligns with disease modeling and biomarker discovery using physiologically relevant 3D cultures.
- Enterprise Reuse: Offers a scalable, standardized platform adaptable to diverse neurobiological research and screening needs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation and reduces mechanistic ambiguity in neural circuit studies.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and scalability of neural coculture assays.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making and capital efficiency by providing robust functional data early in the pipeline.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of neurotherapeutic candidates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in stem cell differentiation and neural cell culture techniques.
- Needs access to multielectrode arrays and imaging infrastructure for quantitative analysis.
- Demands cross-team standardization of cell sourcing, differentiation protocols, and assay conditions.
- Adaptable to include additional neural cell types or extracellular biomaterials for expanded modeling.
- Time investment for cell maturation and validation is necessary for reproducible outputs.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
0:49
Generation and Maintenance of Astrocyte Progenitors (hAstros) from hPSCs
2:41
Generation and Maintenance of Neurons (hNeurons) and Inducible Neurons (iNeurons) from hPSCs
3:27
Preparation and Maintenance of 3D Sphere Co-cultures
5:42
Measurement of Live Synaptic Physiology with Multielectrode Arrays (MEAs)
6:56
Results: Morphological and Physiological Characteristics of Synaptic Microcircuits
8:07
Conclusion
