利用人多能干细胞来源的星形胶质细胞与神经元三维共培养构建突触微环路模型

该方法有助于解答神经科学领域的关键问题，即多种人类神经细胞类型之间的细胞间通讯如何参与突触环路的形成与功能。该技术可从人类多能干细胞快速、系统地生成包含功能成熟星形胶质细胞和神经元的三维共培养球体，可用于严格的实验研究。

该方案具有可重复性和可扩展性，是新兴类器官技术的一种明确替代方法。这些技术在新型药物开发和促进损伤或疾病后神经再生的细胞移植治疗方面展现出广阔前景。首先，将人多能干细胞（HPSC）细胞簇接种于已包被细胞外基质（ECM）的六孔板中，每孔加入含有ROCK抑制剂Y-27632的2 mL HPSC培养基。

将干细胞培养至约50%融合度，然后更换为含有SB431542和DMH1的神经诱导培养基，以促进神经诱导。当细胞融合度达到约95%时，将每孔按1:6比例传代至新的ECM包被的孔中。第14天使用解离溶液消化细胞，并将每孔细胞悬液转移至未包被的T25培养瓶中，培养基中加入Y-27632，以促进细胞聚集体的形成。

为了在自发形成的三维聚集体中生成星形胶质细胞前体细胞和星形胶质细胞，需更换为含有EGF和FGF2的神经培养基，并每三至四天换液一次，直至四到六个月时确认星形胶质细胞身份。默认情况下，本方案产生的是背侧皮层星形胶质细胞。然而，如需要，可通过添加模式形成因子（patterning morphogens）对星形胶质细胞亚型进行区域特异性诱导。

每周一次，当出现深色中心时，通过离心收集球体，然后用解离液轻柔解离H-astro聚集体。仅重新接种那些不会自发贴壁的球体，以避免传代非中枢神经系统和非神经细胞。在扩增培养四到六个月后，按照制造商说明书，使用冻存或冷冻保存培养基确认细胞身份，或立即用于实验。

为了生成非转基因神经元前体细胞以获得神经元（H-神经元），将第14天由人多能干细胞（HPSC）衍生的神经前体细胞接种至包被细胞外基质（ECM）的六孔板中，每孔加入2毫升神经培养基和Y-27632。若使用多西环素诱导型iNeuron细胞系，当细胞融合度约为35%时，加入含多西环素的神经培养基以诱导分化并激活基因表达。两天后，每天为转基因和非转基因细胞系更换培养基，每孔加入2毫升神经培养基。

继续培养直至细胞在70%融合度时准备脱落。对于共培养，首先用解离液轻轻解离3D聚集体中的H-astro，然后继续从2D单层中解离H-神经元或i神经元。

首先，从六孔板中移除培养基，向每孔单层培养物中加入 500 微升解离液。在 37 摄氏度下孵育 5 分钟。孵育结束后，轻轻加入 2 至 3 毫升 DMEM-F12 培养基以去除贴壁细胞。

然后，将含有细胞的培养基收集到15毫升的锥形离心管中，在300 × g条件下离心1分钟。吸除上清液，加入1毫升新鲜培养基，用1,000微升移液器轻轻吹打数次，以获得单细胞悬液。使用血细胞计数板或自动细胞计数仪对每种细胞进行计数。

将解离后的H-星形胶质细胞和H-神经元或iNeurons按所需比例加入至微孔板的每个孔中，总体积为2毫升。以100 × g离心3分钟，然后放回培养箱中培养2天。1天后，微孔板中应已形成致密的微球体。

使用1,000微升微量移液器轻轻从微孔中移出球状体。用培养基轻轻施加压力于微孔底部，以去除任何额外附着的球状体。收集所有球状体至15毫升锥形管后，静置使其沉降。

随后通过先吸除旧培养基，再加入至少两毫升新鲜培养基来洗涤细胞球。将细胞球加入含有50至60毫升培养基的旋转培养瓶中。将培养瓶置于培养箱内的磁力搅拌器上，转速设为60 RPM。

培养至少三周后才能形成突触。首先，在每个多电极阵列（MEA）表面涂覆一毫升多聚鸟氨酸，使表面具有亲水性，并在37摄氏度下孵育至少四小时。孵育结束后，移除多聚鸟氨酸，并用去离子水清洗每个MEA的表面。

然后加入一毫升细胞外基质，放回培养箱中孵育至少四小时。准备就绪后，移除细胞外基质，将球体以1.5毫升培养基接种到MEA表面，确保球体位于电极阵列上方。静置使其贴附两天。

为了测量神经球的电活动，将MEA放置在温度可控的记录台阶段。使用5赫兹高通滤波器和200赫兹低通滤波器，并将尖峰阈值设为标准差的5倍，以记录自发性电活动。保存原始数据，包括用于统计分析的尖峰频率和振幅。

神经细胞类型特异性的蛋白标志物，例如神经元的MAP2和星形胶质细胞的GFAP，可直观显示在三维球体中星形胶质细胞在神经元内均匀分布及其成熟状态。代表性三维球体展示了星形胶质细胞形态与分支的最大投影图像，其中H-星形胶质细胞稀疏地标记了膜结合型GFP。成熟的H-星形胶质细胞表达包括GFAP在内的多种标志物。

尽管iNeurons表达突触前和突触后蛋白（如左侧图像所示），但H-astros的存在以及共培养显著增强了突触密度。在记录过程中，放置于MEA上的健康iNeurons球状体可自发产生幅度超过40微伏（µV）的电压尖峰，并具有稳定的放电频率。共培养的球状体在H-astros存在下表现出更强的神经网络连接性，导致同步性网络簇状放电增加。

采用此方法后，还可进行钙成像等其他实验，以检测星形胶质细胞对突触活动的生理反应。此外，可通过将细胞移植至动物模型中，研究其与已有突触回路的连接性。通过遵循这一生物工程方法，可将细胞外生物材料以及少突胶质细胞、小胶质细胞和内皮细胞等其他细胞类型以特定比例整合，从而模拟大脑中复杂的信号传导过程。