Name: 测量细胞核与骨架间机械一体化的直接力探针 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-29T13:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 47 s
Description: 了解如何使用微吸管技术对活细胞细胞核施加可控力，以研究细胞核力学特性。该方法适用于NIH-3T3等贴壁细胞，可揭示核骨架与细胞骨架的机械整合机制。

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本工作由美国国立卫生研究院（NIH）R01 EB014869 项目资助。

1. 准备受体成像的细胞
注意：直接力探针（DFP）可用于任何贴壁细胞类型。本方案中以 NIH 3T3 小鼠成纤维细胞作为模型细胞系。
<ol>
	<li>将 NIH 3T3 成纤维细胞接种于 35 mm 玻璃底培养皿中，使用添加了 10% 胎牛血清和 1% 青霉素-链霉素的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）进行培养，直至达到所需汇合度。细胞维持在 37 °C 和 5% CO2 条件下。
	<ol>
		<li>在接种 NIH 3T3 细胞用于成像前，务必用 5 µg/mL 纤连蛋白（或类似的细胞外基质蛋白）包被所有 35 mm 玻璃底培养皿。 
		注意：实验时细胞必须在培养皿上完全铺展并牢固贴壁。DFP 方法对细胞汇合度无特定限制。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>实验开始前，立即用 PBS 洗涤细胞两次，随后用完全生长培养基洗涤一次。</li>
	<li>向玻璃底培养皿中加入 3 mL 完全生长培养基。</li>
</ol>
2. 显微镜观察与图像采集
注意：根据制造商的建议，在侧臂安装有显微操作仪的倒置荧光显微镜（或同等设备）。显微镜应配备环境控制培养室，以维持温度在 37 °C，CO2 浓度为 5%。显微镜还需配备显微操作仪和显微注射仪。建议实验使用油浸物镜 40x/1.3 NA 或 60x/1.49 NA（或同等规格物镜）。显微镜应安装在防震台上。
<img alt="核变形分析；图示 A）形状变形，B）截面平面；生物力学研究" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58038/58038fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图1"> 
图1核变形与显微镜聚焦 
A. 细胞核最大形变及形变松弛。在计算细胞核最大形变之前，首先对细胞核形状的后缘进行对齐，以校正形变细胞核的平移。将微管尖端脱离时刻的细胞核形状与拉伸前的初始细胞核形状重叠，两者之间的面积差定义为 ΔA1最大核变形定义为 ΔA1 除以原始细胞核面积。类似地，第二个参数为 ΔA2，可通过将微移液管脱离后的最终稳态细胞核形态叠加到原始细胞核形态上来定义。B. 先在A平面聚焦细胞，然后将焦平面向上移动至B平面以找到微移液管尖端。成像过程中，微移液管向右移动（橙色箭头方向）。该图已根据Neelam修改 等.15. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58038/58038fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<ol>
	<li>根据制造商的说明书打开显微注射仪。</li>
	<li>使用浸油滴管，在物镜上方滴加一滴浸油。</li>
	<li>将培养皿牢固地夹紧在培养皿架中，并将培养皿架装入载物台。 
	注意：细胞必须保持在 37 °C 和5% CO2 在整个实验过程中。</li>
	<li>调整物镜高度，使细胞进入焦点平面A, 图1B).</li>
	<li>移动显微镜载物台以找到目标细胞。</li>
	<li>旋转显微操作仪上的操纵杆，将移液器 holder 移至顶部位置。加载 0.5 µm 将带有直径尖端的微量移液器安装到移液器架上。
	<ol>
		<li>为避免细胞黏附至微移液管，将微移液管尖端在室温下用 0.3 mg/mL PLL-g-PEG 溶液预处理 1 小时。通过在无负压条件下将微移液管接触细胞核，随后将其从细胞核移开，以检测是否存在黏附。若无黏附，则表现为细胞核完全无变形及无位移。 
		注意：请遵循制造商的建议打开包装。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过调节细调焦旋钮，将物镜焦平面从A平面上升至细胞顶部的B平面。图1B，参见步骤 2.4。</li>
	<li>将显微操作仪设置为 粗糙 对照。通过观察显微操作针的轮廓，缓慢将其降至平面B，直至显微操作针完全聚焦。</li>
	<li>当显微注射针尖处于焦点时，将显微操作仪设置为 精细 对照</li>
	<li>将物镜降至细胞的赤道平面（平面 A， 图1B）并将微量移液器降至约 15 µm 平面A上方图1B，虚线表示微量移液器。</li>
	<li>设定补偿压力（Pc将显微注射仪的压力调节至所需数值；等待数秒，直至压力稳定。 
	注意：最佳压力设定值取决于细胞类型及实验的具体目标。在大多数情况下，300 hPa 是一个合适的起始点。</li>
	<li>确保使用移液器时未发生堵塞 清洁 在显微操作仪面板上设置参数，并检查确认微量移液器尖端有气泡冒出。</li>
	<li>将移液管尖端缓慢下移，插入细胞，直至尖端轻轻接触细胞核表面。 
	注意：当降低微量移液器时，随着其逐渐聚焦，微量移液器尖端的轮廓将变得清晰。在微量移液器接触细胞核之前，应抬升物镜焦平面，使微量移液器尖端与细胞核对齐（相同的 x-y 坐标，更高的 z 平面）。随后将焦平面重新返回至细胞核的赤道平面（A 平面， 图1B）并逐渐降低微量移液器吸头。</li>
	<li>通过将压力供给管从显微注射系统上断开，使微移液管尖端与细胞核膜之间形成密封，从而将微移液管末端暴露于大气中。此步骤产生一个等于大气压差的负压 Pc 在核表面。</li>
	<li>使用显微镜的图像采集软件获取图像。在图像采集软件中设置 avi 采集（视频）或 nd 采集（图像）。 
	注意：对于任何成像采集软件，应设置实时视频成像或短时间间隔的时间序列图像采集。</li>
	<li>切换到相应的荧光成像通道（即， GFP，RFP 等等。）并开始成像。</li>
	<li>将微量移液器吸头从细胞本体移开（向右）， 图1B直至细胞核从微移液管上脱离。 
	注意：将尖端沿正x方向（在视野中向右）拉动。拉动速度可通过计算机编程控制，也可手动移动操纵杆进行控制。我们未发现拉动速度与核变形之间存在任何相关性。15 表明对力主要表现为弹性响应。</li>
</ol>
3. 数据分析
<ol>
	<li>使用任何可用的基础图像处理软件进行图像分析。核变形程度可通过长度应变（Ɛ）或面积应变进行量化（图1A）。使用公式1计算长度应变，其中L和L0分别表示细胞核在最大变形时和初始位置时的长度。 
	<img alt="线性应变公式 ε=(L/L₀)-1；变形计算公式；教学图表。" src="/files/ftp_upload/58038/58038eq1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="公式1"> （公式1）</li>
</ol>

<ol><li>Chow, K. H., Factor, R. E., Ullman, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nuclear+envelope+environment+and+its+cancer+connections%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">The nuclear envelope environment and its cancer connections.</a> Nature Reviews Cancer. 12 (3), 196-209 (2012).</li>
<li>Zink, D., Fischer, A. H., Nickerson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+structure+in+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Nuclear structure in cancer cells.</a> Nature Reviews Cancer. 4 (9), 677-687 (2004).</li>
<li>Bank, E. M., Gruenbaum, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nuclear+lamina+and+heterochromatin%3A+a+complex+relationship%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Society+Transactions%22%5BJournal%5D)">The nuclear lamina and heterochromatin: a complex relationship.</a> Biochemical Society Transactions. 39 (6), 1705-1709 (2011).</li>
<li>Lammerding, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lamins+A+and+C+but+not+lamin+B1+regulate+nuclear+mechanics%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Lamins A and C but not lamin B1 regulate nuclear mechanics.</a> Journal of Biological Chemistry. 281 (35), 25768-25780 (2006).</li>
<li>Dahl, K. N., Engler, A. J., Pajerowski, J. D., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Power-law+rheology+of+isolated+nuclei+with+deformation+mapping+of+nuclear+substructures%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Power-law rheology of isolated nuclei with deformation mapping of nuclear substructures.</a> Biophysical Journal. 89 (4), 2855-2864 (2005).</li>
<li>Crisp, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coupling+of+the+nucleus+and+cytoplasm%3A+role+of+the+LINC+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Coupling of the nucleus and cytoplasm: role of the LINC complex.</a> Journal of Cell Biology. 172 (1), 41-53 (2006).</li>
<li>Sosa, B. A., Rothballer, A., Kutay, U., Schwartz, T. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LINC+complexes+form+by+binding+of+three+KASH+peptides+to+domain+interfaces+of+trimeric+SUN+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">LINC complexes form by binding of three KASH peptides to domain interfaces of trimeric SUN proteins.</a> Cell. 149 (5), 1035-1047 (2012).</li>
<li>Tapley, E. C., Starr, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Connecting+the+nucleus+to+the+cytoskeleton+by+SUN-KASH+bridges+across+the+nuclear+envelope%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Connecting the nucleus to the cytoskeleton by SUN-KASH bridges across the nuclear envelope.</a> Current Opinion in Cell Biology. 25 (1), 57-62 (2013).</li>
<li>Arsenovic, P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nesprin-2G%2C+a+Component+of+the+Nuclear+LINC+Complex%2C+Is+Subject+to+Myosin-Dependent+Tension%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Nesprin-2G, a Component of the Nuclear LINC Complex, Is Subject to Myosin-Dependent Tension.</a> Biophysical Journal. 110 (1), 34-43 (2016).</li>
<li>Rowat, A. C., Lammerding, J., Ipsen, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+properties+of+the+cell+nucleus+and+the+effect+of+emerin+deficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Mechanical properties of the cell nucleus and the effect of emerin deficiency.</a> Biophysical Journal. 91 (12), 4649-4664 (2006).</li>
<li>Rowat, A. C., Foster, L. J., Nielsen, M. M., Weiss, M., Ipsen, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+elastic+properties+of+the+nuclear+envelope%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Royal+Society+Interface%22%5BJournal%5D)">Characterization of the elastic properties of the nuclear envelope.</a> Journal of the Royal Society Interface. 2 (2), 63-69 (2005).</li>
<li>Pagliara, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Auxetic+nuclei+in+embryonic+stem+cells+exiting+pluripotency%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Materials%22%5BJournal%5D)">Auxetic nuclei in embryonic stem cells exiting pluripotency.</a> Nature Materials. 13 (6), 638-644 (2014).</li>
<li>Liu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+mechanical+characterization+of+the+cell+nucleus+by+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">In situ mechanical characterization of the cell nucleus by atomic force microscopy.</a> ACS Nanotechnology. 8 (4), 3821-3828 (2014).</li>
<li>Krause, M., Te Riet, J., Wolf, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+the+compressibility+of+tumor+cell+nuclei+by+combined+atomic+force-confocal+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Biology%22%5BJournal%5D)">Probing the compressibility of tumor cell nuclei by combined atomic force-confocal microscopy.</a> Physical Biology. 10 (6), 065002(2013).</li>
<li>Neelam, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+force+probe+reveals+the+mechanics+of+nuclear+homeostasis+in+the+mammalian+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Direct force probe reveals the mechanics of nuclear homeostasis in the mammalian cell.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (18), 5720-5725 (2015).</li>
<li>Pajerowski, J. D., Dahl, K. N., Zhong, F. L., Sammak, P. J., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physical+plasticity+of+the+nucleus+in+stem+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Physical plasticity of the nucleus in stem cell differentiation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (40), 15619-15624 (2007).</li>
<li>Lammerding, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lamin+A%2FC+deficiency+causes+defective+nuclear+mechanics+and+mechanotransduction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Lamin A/C deficiency causes defective nuclear mechanics and mechanotransduction.</a> Journal of Clinical Investigation. 113 (3), 370-378 (2004).</li>
<li>Chancellor, T. J., Lee, J., Thodeti, C. K., Lele, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actomyosin+tension+exerted+on+the+nucleus+through+nesprin-1+connections+influences+endothelial+cell+adhesion%2C+migration%2C+and+cyclic+strain-induced+reorientation%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Actomyosin tension exerted on the nucleus through nesprin-1 connections influences endothelial cell adhesion, migration, and cyclic strain-induced reorientation.</a> Biophysical Journal. 99 (1), 115-123 (2010).</li>
<li>Neelam, S., Dickinson, R. B., Lele, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+approaches+for+understanding+the+nuclear+force+balance+in+living%2C+adherent+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">New approaches for understanding the nuclear force balance in living, adherent cells.</a> Methods. 94, 27-32 (2016).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

测量细胞核与细胞骨架之间的力学整合对大多数现有方法（如微吸管抽吸法16）而言是一项挑战，因为这些方法要么需要分离的细胞核（此时细胞核与细胞骨架已解耦），要么使用悬浮细胞中的细胞核（此时缺乏细胞外力，如牵引力）。已有研究通过在附着于膜上的细胞施加双轴应变来对细胞核施加力17,18；然而，该技术的局限性在于作用于细胞核的力无法确定。原子力显微镜（AFM）探针已被用于压入完整细胞中的细胞核，其优势在于可在细胞核与细胞骨架保持整合的状态下揭示其力学特性。为了补充现有的用于表征细胞核的体内技术12,13,14，我们开发了一种简单且稳健的方法，可在活体贴壁细胞中对细胞核进行力学探测，同时保持其与周围细胞骨架的整合。该技术的一个关键特征是作用于细胞核的力能够被精确地知晓和控制。...

癌症等病理过程涉及细胞核形态和结构的改变1,2，通常伴随细胞核的“软化”现象3,4。细胞核抵抗机械形变的能力通常通过向分离的细胞核施加外力来进行表征5。
细胞核通过核骨架与细胞骨架连接复合物（Linker of Nucleoskeleton and Cytoskeleton, LINC复合物）在分子水平上与细胞骨架相连6,7,8,9。因此，细胞核在力学上与细胞骨架相整合，并通过细胞-基质黏附与细胞外基质相连。对贴壁细胞内细胞核进行力学探测有助于揭示这种力学整合机制。在活细胞中操控细胞核的方法包括微管吸吮法10,11和原子力显微镜法12,13,14。我们近期描述了一种直接力探针（direct force probe, DFP），可在活体贴壁细胞中直接对细胞核施加机械力15。
本文概述了一种利用显微镜平台中常见的显微注射系统，向贴壁细胞的细胞核直接施加已知纳米级机械力的操作步骤。将飞秒针尖（直径为 0.5 µm 的微移液管尖端）安装并经由导管连接至显微注射系统。将针尖以相对于培养皿表面 45° 的角度定位，并缓慢下降至接近细胞核表面。随后断开导管并使其与大气相通，从而在细胞核表面产生负压抽吸力，使微移液管尖端紧密贴附于细胞核表面。通过移动微移液管尖端，可使细胞核发生形变，并最终（取决于所施加力的大小）从微移液管上脱离。当细胞核和细胞自身产生的恢复力（抵抗作用力）等于微移液管所施加的抽吸力时，即发生脱离。可通过测量细胞核的位移、长度应变（公式 1）或面积应变（图 1A）来进行分析。

<table><tbody><tr><td>FluoroDish</td><td>WPI</td><td>FD35</td><td></td></tr><tr><td>SYTO 59</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>S11341</td><td></td></tr><tr><td>Femtotips&amp;nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>930000043</td><td></td></tr><tr><td>InjectMan NI2</td><td>Eppendorf</td><td>NA</td><td>已停产，当前等效型号：InjectMan 4</td></tr><tr><td>FemtoJet</td><td>Eppendorf</td><td>NA</td><td>当前型号 FemtoJet 4i</td></tr><tr><td>Plan Fluor 油浸 40x</td><td>Nikon</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Apo TIRF 油浸 60x</td><td>Nikon</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>供体牛血清 (DBS)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>16030074</td><td>NIH 3T3 血清</td></tr><tr><td>杜尔贝科改良伊格尔培养基 (DMEM)</td><td>Mediatech cellgro</td><td>MT10013CVRF</td><td>NIH 3T3 培养基</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素&amp;nbsp;</td><td>Mediatech</td><td>MT30004CIRF</td><td>NIH 3T3 培养基添加剂</td></tr><tr><td>非荧光浸油 LDF 型</td><td>Nikon</td><td>77007</td><td>物镜用浸油&amp;nbsp;</td></tr></tbody></table>

用于测量细胞核与细胞骨架之间机械整合的直接力探针

A Direct Force Probe for Measuring Mechanical Integration Between the Nucleus and the Cytoskeleton

细胞核的力学特性决定了其对细胞内产生机械力的响应方式。由于细胞核在分子水平上与细胞骨架连续相连，因此需要相应方法来探测其在贴壁细胞中的力学行为。本文讨论了直接力探针（DFP）作为一种可在活体贴壁细胞中直接对细胞核施加作用力的工具。我们通过负压将一根细小微管吸附在细胞核表面，随后将微管从细胞核向外移动，从而引起细胞核变形并发生位移。当细胞核的回复力与负压产生的拉力相等时，细胞核脱离微管并发生弹性回缩。由于负压大小精确已知，因此作用于细胞核表面的力也可确定。该方法揭示了纳米尺度的力足以使贴壁细胞中的细胞核发生形变和位移，并鉴定了使细胞核能够抵抗外力的细胞骨架组分。DFP可用于解析活细胞中细胞和细胞核各组分对细胞核力学特性的贡献。

图2A展示了对NIH 3T3小鼠成纤维细胞核的施力过程。当微吸管尖端向右移动时，细胞核发生形变，并最终从微吸管尖端脱离。可见细胞核的长度应变随吸力增加而增大（图2B）。细胞核前缘（微吸管牵拉边缘）形成核突起，而后缘则从其原始位置发生位移（图2C）。突起长度远大于后缘位移，提示细胞核与周围细胞质之间存在紧密连接。细胞核前缘的松弛时间较短（&lt;1 s），后缘的松弛时间亦较短（&lt;2 s）（图2D）。
<img alt="受力下的细胞变形；包含细胞核轮廓、应变和松弛分析图的示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58038/58038fig2.jpg" data-a...

在本实验方案中，我们描述了一种使用微移液管的方法，可直接对活细胞中的细胞核施加可控的力。该检测方法可用于研究活体贴壁细胞中细胞核的力学特性。

细胞核的机械特性决定了其对细胞内产生的机械力的响应。由于细胞核在分子水平上是连续的……

该方法有助于解答核力学领域的关键问题。例如，使细胞核发生形变所需的力是多少？细胞和细胞核组分对细胞核抗形变能力的贡献分别是什么？或者，细胞核与细胞结构的耦合是否因细胞类型而异？该技术的主要优势在于，能够在活体贴壁细胞中施加探针力，以形变整合的细胞核-细胞骨架结构。尽管该方法已用于研究NIH-3T3细胞的细胞核力学特性，但也可应用于其他任何贴壁细胞类型，例如用于探测早老综合征细胞（Hutchinson-Gilford progeria cells）的细胞核力学特性。开始本实验步骤时，先用浓度为 5 微克/毫升的纤连蛋白包被一个 35 毫米的玻璃底培养皿。随后，将 NIH 3T3 成纤维细胞接种于经包被的培养皿中，在添加了 10% 胎牛血清和 1% 青霉素-链霉素的 DMEM 培养基中，于 37°C 培养至所需汇合度。在实验开始前，先用 PBS 洗涤细胞两次，再用完全生长培养基洗涤一次。随后，向玻璃底培养皿中加入三毫升完全培养基。在此步骤中，打开显微注射仪。使用浸油滴管，在物镜上滴加一滴浸油。然后，将培养皿牢固地夹紧在皿托上，并将皿托安装到载物台上。请注意，实验过程中应始终保持细胞处于 37 °C 和 5% 二氧化碳的环境中。接下来，调节物镜高度，使细胞进入焦点。移动显微镜载物台以找到目标细胞。使用显微操作器将移液管 holder 移至最高位置，随后将尖端直径为 0.5 微米的玻璃微电极装入移液管 holder 中。然后通过调节细调旋钮，将物镜焦平面从A平面上升至细胞顶部的B平面。接着，将显微操作仪切换至粗调模式。缓慢下移微吸管，同时观察其轮廓，直至微吸管完全聚焦于B平面。当显微注射针尖进入视野焦点后，将显微操作器调至精细控制模式。随后，将物镜降至细胞赤道平面位置，并将显微注射针降至该平面上方约 15 微米处。在显微注射仪上设定所需的补偿压力。等待数秒，使压力稳定。必须检查移液尖端是否破损或堵塞，否则力的测量结果将不准确。使用显微操作器面板上的“清洁”模式，确保微移液管未被堵塞，并观察是否有气泡从微移液管尖端冒出。然后，将微量移液器尖端插入细胞，直至轻轻接触核表面。通过将压力供应管从显微注射系统上断开，使微量移液器尖端末端暴露于大气中，从而在尖端与核膜之间形成密封。此步骤在核表面产生等于补偿压力的负压。接下来，打开图像采集软件。在图像采集软件中设置用于视频的 AVI 采集或用于图像的 ND 采集。然后切换至相应的荧光成像通道并开始成像。将移液管尖端从细胞本体移开，直至细胞核与移液管尖端分离。该图展示了对NIH 3T3小鼠成纤维细胞核施加外力的过程。随着移液管尖端向右移动，细胞核发生形变，最终从移液管尖端脱离。细胞核的拉伸长度随吸力增加而增大。细胞核前缘形成核突起，后缘则从其原始位置发生位移。突起长度远大于后缘位移，表明细胞核与周围细胞质之间存在紧密的整合。核前缘

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测量细胞核与骨架间机械一体化的直接力探针

我们介绍了两种独立的基于显微镜的技术，用于测量单个活体贴壁细胞在整体或局部应变作用下所诱导的细胞核和细胞骨架形变。这些技术可用于测定细胞核的刚度（即形变能力），并探究细胞核与细胞骨架之间的细胞内力传递。...

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近年来，已开发出多种基于FRET的力学生物传感器，能够实现对细胞内力的蛋白质特异性解析。在本方案中，我们演示了如何使用一种针对核骨架-细胞骨架（LINC）复合物蛋白Nesprin-2G的连接区设计的传感器，来测量作用于细胞核LINC复合物上的肌动球蛋白力。...

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本文介绍了一种利用光镊进行直接力测量，在三维受限条件下研究分离的斑马鱼胚胎细胞内机械特性的实验方案。...

使用光镊在受限环境中进行亚细胞力学的直接力测量

此处，我们介绍一种微管束的重建方案 体外...

直接测量重建的活性微管束内部作用力

本研究提出了一种新方案，通过将磁性微珠递送至细胞质，直接对细胞核施加机械力，同时进行活细胞荧光成像。...

结合三维磁力驱动装置与多功能荧光成像技术研究细胞核力学生物学

HCN通道与其辅助亚基之间的相互作用已被确定为重度抑郁症的治疗靶点。本文介绍了一种基于荧光偏振的方法，用于筛选该蛋白质-蛋白质相互作用的小分子抑制剂。...

识别HCN1与TRIP8b蛋白-蛋白相互作用的小分子抑制剂的方法

了解如何使用微吸管技术对活细胞细胞核施加可控力，以研究细胞核力学特性。该方法适用于NIH-3T3等贴壁细胞，可揭示核骨架与细胞骨架的机械整合机制。

用于测量细胞核与细胞骨架之间机械整合的直接力探针

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