测量细胞核与骨架间机械一体化的直接力探针
July 29th, 2018
在本协议中, 我们描述了一种微方法, 直接将受控力应用于活细胞中的细胞核。这项化验允许审讯活体, 黏附细胞的核机械性质。
这种方法可以帮助回答核力学领域的关键问题。例如，使细胞核变形所需的力是多少？细胞和核成分对核抗变形能力有什么贡献？
或者，与细胞结构的核偶联是否随细胞类型而变化？这项技术的主要优点是，它允许我们施加探测力，使活贴壁细胞中的整合核细胞骨架变形。虽然这种方法已被用于深入了解 NIH-3T3 细胞中的核力学特性，但它也可以应用于任何贴壁细胞类型，例如探测 Hutchinson-Gilford 早衰细胞中的核力学特性。
要开始此程序，请在 35 毫米玻璃底培养皿中涂上每毫升 5 微克的纤连蛋白。然后，在 37 摄氏度的涂层培养皿上，在补充有 10% 供体牛血清和 1% 青霉素-链霉素的 DMEM 中培养 NIH 3T3 成纤维细胞，直至所需的汇合。在实验之前，用 PBS 洗涤细胞两次，然后用完全生长培养基洗涤一次。
然后，将 3 毫升完全生长培养基加入玻璃底培养皿中。在此过程中，打开显微注射器。使用浸油滴管，在物镜上滴一滴浸油。
然后，将培养皿紧紧地夹在培养皿架上，并将培养皿架装载到载物台上。请注意，在整个实验过程中，细胞应保持在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳。接下来，调整物镜的高度以使单元格聚焦。
移动显微镜载物台以查找感兴趣的细胞。使用显微作器，将移液器支架移动到最高位置。随后，将带有 0.5 微米直径吸头的微量移液器加载到移液器支架上。
然后通过调整微调控制，将物镜焦平面升高到平面 A 和单元顶部到平面 B。接下来，将显微纵器设置到粗略的控制位置。通过观察微量移液器的轮廓，慢慢将微量移液器降低到平面 B，直到微量移液器完全聚焦。
一旦微量移液器吸头聚焦，将显微作器设置为精细控制。随后，将物镜降低到细胞的赤道平面，并将微量移液器降低到高于该水平约 15 微米。将显微注射器上的补偿压力设置为所需压力。
等待几秒钟，让压力稳定下来。检查移液器吸头是否破损或堵塞非常重要，否则力测量将不准确。使用显微作器面板上的清洁设置确保微量移液器不会堵塞，并确保气泡从微量移液器吸头中冒出。
然后，将微量移液器吸头插入细胞中，直到它轻轻接触细胞核表面。通过断开与显微注射系统的压力供应管，在微量移液器吸头和核膜之间形成密封，从而将微量移液器的末端打开到大气中。此步骤在核表面产生等于补偿压力的负压。
接下来，打开图像采集软件。在图像采集软件中设置视频的 AVI 采集或设置图像的 ND 采集。然后，切换到相应的荧光成像通道并开始成像。
将微量移液器吸头从细胞体上移开，直到细胞核与微量移液器分离。该图显示了 NIH 3T3 小鼠成纤维细胞核的强迫。当微量移液器吸头向右移动时，细胞核会变形并最终从微量移液器吸头上分离。
可以看到细胞核的长度应变随着吸力的增加而增加。细胞核的前缘形成核突起，后缘从其原始位置移位。突起的长度远大于后缘位移，表明细胞核和周围细胞质之间紧密结合。
核前缘和核后缘松弛的时间尺度很短。直接力探针用于确定核内和细胞骨架结构对细胞核抗变形能力的贡献。荧光图像显示了在指定条件下前后的细胞核叠加。
虽然在 F-肌动蛋白破坏或微管破坏后未发现核变形或翻译的显著差异，但通过基于 siRNA 的敲低降低 menten 表达导致核翻译和变形显著增加。这表明成纤维细胞中的 menten 中间丝是帮助细胞核抵抗局部力的主要细胞骨架元件。观看此视频后，您应该对如何对活贴壁细胞中的细胞核施加受控且已知的力有一个很好的了解。
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概述
本协议描述了一种微移液管方法，用于对活细胞中的细胞核施加受控力，从而能够探查粘附细胞中的细胞核机械性质。
关键研究组成部分
科学领域
- 细胞力学
- 细胞核力学
- 生物物理学
背景
- 了解细胞核力学对于各种生物过程至关重要。
- 使细胞核变形所需的力可以提供有关细胞行为的洞察。
- 不同细胞类型可能对变形表现出不同的细胞核反应。
- 此方法已经被应用于NIH-3T3细胞。
研究目的
- 确定活细胞中变形细胞核所需的力。
- 探索细胞和细胞核组分对细胞核阻力的贡献。
- 评估细胞核与细胞结构的耦合在不同细胞类型中的变化。
使用的方法
- 用于施加力于细胞核的微移液管技术。
- 活细胞成像以观察细胞核变形。
- 分析各种粘附细胞类型中细胞核的机械性质。
- 对不同细胞系的比较研究，包括Hutchinson-Gilford progeria细胞。
主要结果
- 该方法成功测量了活细胞中的细胞核变形。
- 获得了有关细胞核机械性质的见解。
- 展示了不同细胞类型中细胞核反应的变异性。
- 为未来的细胞核力学研究提供了框架。
结论
- 这种微移液管方法是研究细胞核力学的有价值工具。
- 它可以应用于NIH-3T3之外的各种粘附细胞类型。
- 未来的研究可以利用这种技术探索疾病背景下的细胞核行为。
常见问题
Executive Industry Relevance
Understanding nuclear mechanical properties is critical for assessing cellular responses to mechanical stress in disease models and drug screening. The direct force probe enables quantitative measurement of nucleo-cytoskeletal integration, providing mechanistic insights that support target validation in fibrosis, cancer, and laminopathies. This approach enhances predictive confidence by linking subcellular mechanics to phenotypic outcomes in adherent cell systems.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Measures force required to deform the nucleus, enabling interrogation of cytoskeletal contributions to nuclear resistance.
- Operational Value: Identifies specific cytoskeletal elements, such as menten intermediate filaments, that modulate nuclear mechanical stability.
- Predictive Value: Supports hypothesis testing on nuclear-cytoskeletal coupling in disease-relevant systems like Hutchinson-Gilford progerial cells.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates quantitative length strain and displacement readouts correlated with applied suction force.
- Reproducibility: Uses precisely controlled micropipette pressure to ensure consistent force application across experiments.
- Scalability: Compatible with live-cell imaging and adaptable to high-content analysis of nuclear deformation.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Applicable to progerial and other laminopathy models to assess nuclear fragility under mechanical load.
- Mechanistic De-risking: Dissects contributions of F-actin, microtubules, and intermediate filaments to nuclear resistance, clarifying pathway-specific effects.
- Translational Continuity: Enables comparison of nuclear mechanical phenotypes across cell types to inform preclinical target selection.
Pipeline & Workflow Integration
The direct force probe fits within early discovery workflows by providing biomechanical readouts that inform target validation and assay development prior to compound screening.
- Discovery Biology: Tests hypotheses about nucleo-cytoskeletal integration by quantifying nuclear deformation under known force.
- Screening: Produces standardized, quantitative nuclear strain measurements suitable for comparing genetic or pharmacological perturbations.
- Analytics: Delivers force-displacement data that enable statistical comparison of nuclear mechanical phenotypes.
- Translational Research: Links nuclear mechanics to disease models, supporting biomarker alignment in mechanopathies.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for assessing nuclear mechanical properties across diverse adherent cell lines.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in nuclear mechanobiology by isolating cytoskeletal contributions to nuclear stiffness.
- Operational Value: Enables standardization of force application via micropipette suction pressure, improving inter-lab reproducibility.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by revealing cytoskeletal targets whose modulation alters nuclear mechanical resilience.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of targets involved in nuclear-cytoskeletal mechanotransduction.
Implementation Considerations
- Requires expertise in micropipette manipulation and live-cell imaging under controlled environmental conditions.
- Depends on calibrated microinjector systems and glass-bottom dishes coated with fibronectin for cell adhesion.
- Necessitates standardization of suction pressure settings and micropipette tip preparation to ensure force measurement accuracy.
- Involves adaptation considerations when transferring the method to different cell types with varying nuclear size and cytoskeletal composition.
- Limited by the need for direct visual monitoring of nuclear detachment to determine force equilibrium.
