用于测量细胞核与细胞骨架之间机械整合的直接力探针

该方法有助于解答核力学领域中的关键问题。例如，使细胞核发生形变所需的力是多少？细胞和细胞核组分对细胞核抵抗形变的贡献分别是什么？

或者，细胞核与细胞结构的耦合是否会因细胞类型不同而变化？该技术的主要优势在于，它使我们能够在活的贴壁细胞中施加探针力，以形变整合的核-细胞骨架结构。尽管该方法已用于研究NIH-3T3细胞中细胞核的力学特性，但它也可应用于任何其他贴壁细胞类型，例如用于探究Hutchinson-Gilford早衰症细胞中的细胞核力学特性。

开始此操作时，用浓度为每毫升5微克的纤连蛋白包被35毫米玻璃底培养皿。随后，将NIH 3T3成纤维细胞接种于已包被的培养皿中，在添加了10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素的DMEM培养基中，于37摄氏度培养至所需的汇合度。实验前立即用PBS洗涤细胞两次，再用完全生长培养基洗涤一次。

随后，向玻璃底培养皿中加入三毫升完全培养基。在此步骤中，打开显微注射仪。使用浸油滴管，在物镜上滴加一滴浸油。

然后，将培养皿牢固地夹紧在培养皿架上，并将培养皿架装入载物台。请注意，实验过程中应始终保持细胞处于37摄氏度和5%二氧化碳的环境中。接下来，调节物镜的高度，使细胞进入焦点。

移动显微镜载物台以找到感兴趣的细胞。使用显微操作器将移液管 holder 移至最高位置。随后，将尖端直径为 0.5 微米的微移液管安装到移液管 holder 上。

然后通过调节细调旋钮，将物镜焦平面从A平面上升至细胞顶部的B平面。接着，将显微操作仪切换至粗调模式。缓慢下移微量移液器，同时观察其轮廓，直至微量移液器在B平面完全聚焦。

当显微注射针尖进入焦点后，将显微操作仪切换至精细控制模式。随后，将物镜降至细胞赤道面位置，并将显微注射针降至该平面上方约15微米处。在显微注射仪上设定所需的补偿压力。

等待数秒，直至压力稳定。必须检查移液吸头是否破损或堵塞，否则力测量结果将不准确。使用显微操作器面板上的“清洁”模式，确保微移液管未被堵塞，并观察是否有气泡从微移液管尖端冒出。

然后，将微量移液器尖端插入细胞，直至轻轻接触细胞核表面。通过将压力供应管从显微注射系统上断开，使微量移液器尖端暴露于大气中，从而在微量移液器尖端与核膜之间形成密封。此步骤可在核表面产生等于补偿压力的负压。

接下来，打开图像采集软件。在图像采集软件中设置用于视频的 AVI 采集或用于图像的 ND 采集。然后切换至相应的荧光成像通道并开始成像。

将微量移液器吸头从细胞体移开，直至细胞核脱离微量移液器。该图显示了对 NIH 3T3 小鼠成纤维细胞核施加作用力的过程。随着微量移液器吸头向右移动，细胞核发生形变，并最终从微量移液器吸头脱离。

细胞核的拉伸长度随吸力的增加而增大。细胞核前缘形成核突起，而后缘则从其原始位置发生位移。突起的长度远大于后缘的位移，表明细胞核与周围细胞质之间存在紧密的整合。

细胞核前缘和后缘的松弛时间尺度较短。采用直接力学探针来确定核内结构和细胞骨架结构对细胞核抵抗形变能力的贡献。荧光图像显示了在指定条件下细胞核在形变前后的重叠情况。

尽管在破坏F-肌动蛋白或微管后未发现细胞核变形或位移存在显著差异，但通过siRNA介导的敲低降低menten表达后，细胞核的位移和变形显著增大。这表明成纤维细胞中的menten中间丝是帮助细胞核抵抗局部受力的主要细胞骨架成分。观看本视频后，您应能够充分理解如何在活的贴壁细胞中对细胞核施加可控且已知的力。