荧光标记蛋白 ImageJ 的无偏分析在果蝇变性定量细胞生物学中的应用

我们开发了一个简单且适应性强的工作流, 从荧光成像的细胞生物学研究中提取定量数据自噬性果蝇模型中中枢神经系统蛋白质聚集和通量变性.

我们开发了这种方法，从基于荧光的成像研究中提取定量数据，以提取神经变性果蝇模型中复杂和动态的细胞生物过程。该技术的主要优点是其适应性强的半自动图像分析工作流程，可最大限度地减少选择偏差，最大限度地提高采样能力，并在整个场内实现可重复性。这种方法可以扩展到分析与神经退行性变有关的其他蛋白质点和膜结合区室，最终将增强我们对神经退行性疾病的机制理解。

为了在立体显微镜下解剖时保持椎板完整，将两个镊子滑到视网膜下方，轻轻撕开眼睛中间以去除视网膜。保持镊子与椎板表面平行，拉出附着在椎板上的任何剩余视网膜组织。每组解剖 3 到 5 个大脑，并将大脑转移到含有适当固定剂的微量离心管中，在室温下轻轻摇动 15 分钟。

用 PBS 加 Triton X-100 或 PBTx 洗涤 3 次 15 分钟后，用用含 5% 正常山羊血清的 PBTx 稀释的目标一抗代替最后一次洗涤，在 4 摄氏度的等分混合器中孵育过夜。第二天早上，在 PBTx 中洗涤 3 次 15 分钟，去除多余的抗体，并在室温下将大脑与用 PBTx 和 5% 正常山羊血清稀释的适当二抗中孵育 1 小时。在孵育结束时，如图所示清洗大脑 3 次，并将一滴安装介质滴在每个组织样本一张显微镜载玻片中心的两条透明胶带之间。

将大脑放入封固剂中 1 到 2 分钟。当组织变得透明时，使用移液器小心地从每一侧去除封固剂。为了对染色的组织进行成像，将一滴新鲜的封固剂滴在大脑上，并小心地用盖玻片覆盖样品。

用橡胶胶粘剂密封盖玻片边缘，并在室温下风干玻片 20 分钟。接下来，在显微镜上观察标本，并在荧光显微镜上调整图像检测器控件，以在标本的最高动态范围内捕获最高的信噪比。优化设置后，查看另一组的样品，以确认这些设置在整个实验中都是合适的。

然后可以对第一个标本进行成像，注意将图像保存为可以保留元数据（如采集参数和空间校准）的文件类型。要分析图像，请在斐济中打开图像，从"生物格式导入选项"对话框中选择"使用 Hyperstack 查看堆栈"，然后将颜色模式设置为"灰度"。使用 C 滚动条查看通道，使用 Z 滚动条在焦平面中移动，根据标记通道确定可用作标本标准化感兴趣区域的区域。

要简化图像分析，请生成包含通道和焦平面的新图像，然后选择 Image 和 Duplicate。设置所需的通道和切片，并更改文件名以反映所选内容。使用选择工具根据先前确定的选择标准手动选择标准化的感兴趣区域。

单击 Analyze、Tools 和 Region of Interest Manager 和 Add，将感兴趣区域添加到 Region of Interest Manager。然后点击 更多 和 优惠 并命名文件以反映感兴趣的区域。要对图像进行预处理，请单击 Process in Filters 并选择适当的过滤器。

在这里，选择减少噪声同时保留边缘的滤波器设置，以帮助在分割过程中检测感兴趣的结构。在斐济激活预处理图像后，单击 SCF、标签和交互式H_Watershed。从控制面板中，调整 种子动态、强度阈值和 峰值洪水 以优化分割。

优化分割结果后，选择 Export Regions（导出区域）、Mask（掩码）和 Export（导出）以生成流域结果的二进制图像。打开保存的标准化感兴趣区域。从 Region of Interest Manager 中选择感兴趣区域标识符，以将特征提取限制为图像中的标准化感兴趣区域。

在二元分水岭掩码上激活感兴趣区域的情况下，选择 Analyze、Analyze Particles 和 Add to Manager 以提取特征，以将分割期间描绘的每个结构的粒子标识符添加到感兴趣区域管理器中。然后保存添加的粒子，注意取消选择标识符，并将所有粒子保存在 zip 文件中。现在打开预处理的原始图像并滚动到用于捕获感兴趣结构的通道。

打开从特征提取中获得的粒子，然后在 Region of Interest Manager 中选择 Show All 以将每个粒子的轮廓叠加到图像上。单击 Analyze and Set Measurements 并设置适当的实验测量值。然后从 Region of Interest Manager 中选择 Measure，并将结果复制并粘贴到适当的电子表格程序中，以便进行编译和进一步计算。

标准化焦平面到果蝇视叶的半自动分割的RFP亨廷顿聚集体的数量定量显示，致病的亨廷顿Q138扩增在蛋白质聚集体积累中非致病性亨廷顿Q15扩增的弥漫性表达。来自表达亨廷顿 Q138 的 5 个不同视叶的标准化焦平面上的所有聚集体的大小和强度分布说明了该工作流程的稳健性和可重复性。当聚集体在图像采集过程中过度曝光时，聚集体的大小和数量的量化与使用理想曝光捕获的聚集体相当。

但是，过度曝光的聚集体的强度会成为大小的函数，因为饱和像素表现出最大强度值。在几个自噬相关或 Atg8 阳性结构中可视化 mCherry 和 GFP 强度揭示了报告基因的差异，其中两个荧光团的高强度表明自噬体。高 mCherry 和低 GFP 表明与溶酶体融合，因为 GFP 在这个酸性区室中被淬灭。

最后，低 mCherry 反映了溶酶体内的降解。由每个半自动分割的 mCherry Atg8 阳性颗粒的平均荧光团强度生成的散点图说明了通过自噬溶酶体途径的通量，该通量可以通过象限分析分离为离散步骤。在尝试此过程时，请务必记住，图像分析步骤中的用户定义参数高度依赖于应用程序。

因此，请仔细记录工作流程，以确保样本之间的一致性和可比性。