Name: 荧光标记蛋白 ImageJ 的无偏分析在果蝇变性定量细胞生物学中的应用 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 44 s
Description: 学习使用ImageJ对果蝇神经退行性疾病模型中的荧光标记蛋白进行无偏定量分析。该半自动化工作流程可最大限度减少选择偏差，提高采样能力，实现蛋白质聚集体和自噬通量的可重复定量测量。

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本研究工作得到了Sheila和David Fuente神经性疼痛研究项目研究生奖学金（授予J.M.B.）、Lois Pope LIFE研究员项目（授予C.L.、Y.Z.和J.M.B.）、Snyder-Robinson基金会博士前奖学金（授予C.L.）、Dr. John T. Macdonald基金会（授予C.L.）、美国国立卫生研究院（NIH）合同与基金HHSN268201300038C、R21GM119018和R56NS095893（授予R.G.Z.），以及中国山东省泰山学者工程（授予R.G.Z.）的支持。

1. 图像分析实验设计的考虑因素与准备工作
<ol>
	<li>预先确定合适的解剖学、细胞或亚细胞标记物，作为在不同样本间标准化感兴趣区域（ROI）的参照标志，例如4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）、膜标记物、定位性荧光蛋白 等等。</li>
	<li>选择一种荧光标记物，该标记物能够将目标结构的离散点状信号与背景水平清晰区分开来。 
	注意：本方案已针对蛋白质类结构进行优化（例如，错误折叠的蛋白质聚集体）和膜结合细胞器（例如，自噬报告基因）。为观察蛋白质聚集，使用了带有138个重复的致病性多聚谷氨酰胺（polyQ）序列的人源Htt蛋白N端片段，并用RFP标记（RFP-hHttQ138）5突变型Htt蛋白在神经元特异性启动子驱动表达时会在细胞质中形成聚集体 elav-GAL45,6为了可视化自噬小体-溶酶体流 actin-GAL4 用于广泛驱动串联mCherry-GFP-Atg8a报告基因的表达。mCherry和GFP阳性点状结构指示自噬小体，自噬流通过溶酶体酸性环境中GFP荧光的淬灭来监测，而耐酸的mCherry信号则持续存在，直至蛋白质被降解7对于比率分析，可使用单一通道作为结构的稳定标记物进行分割；或者，根据情况也可使用两个或更多通道的投影来界定结构，尽管本方案中未明确描述此方法。在本示例中，使用 mCherry 对 Atg8 阳性颗粒进行分割，因为 mCherry 对酸稳定，可在通路的整个流量过程中持续保留在区室内。</li>
	<li>下载并安装开源图像分析平台 ImageJ 或其首选发行版 Fiji（已集成常用插件）2,3.</li>
	<li>安装用于 h-极大值交互式分水岭的插件。 
	注意：本实验方案使用 Fiji 软件；ImageJ 可能需要额外插件。由 Benoit Lombardot 为 SCF-MPI-CBG 开发的插件可在线获取（https://imagej.net/Interactive_Watershed）。</li>
	<li>导航至 &#34;帮助 | 更新&#34;，选择 &#34;管理更新站点&#34; 来自 &#34;ImageJ 更新器&#34;，从列表中选择 SCF-MPI-CBG 更新站点，然后关闭并重新启动 Fiji。</li>
</ol>
2. 大脑解剖与免疫荧光染色
<ol>
	<li>制备硅胶弹性体衬里的解剖皿。
	<ol>
		<li>按照制造商说明，将硅胶弹性体组分倒入烧杯中，并充分搅拌至完全混合。</li>
		<li>使用移液器将5 cm组织培养皿填充至三分之一到一半（约10 mL弹性体混合物）。让气泡上升至表面，并用纸巾轻轻去除。盖上培养皿，置于水平台面上，在室温（RT）下固化48–72小时。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>解剖 Drosophila 脑，如需要可同时解剖视觉系统。
	<ol>
		<li>按照先前描述的方法进行 Drosophila 脑解剖8,9。在硅胶弹性体衬里的解剖皿中进行操作，利用弹性体底部固定脑组织，以避免损伤组织或镊子滑动。</li>
		<li>为在解剖过程中保持视网膜下区（lamina）完整，将两把镊子从视网膜下方滑入，并轻轻撕开眼球中部以去除视网膜。用与视网膜下区表面平行持握的镊子，小心移除附着在视网膜下区上的任何视网膜组织。 
		注意：残留的色素将在后续步骤中被洗去，通常不会干扰抗体染色和成像。</li>
		<li>在500 µL微量离心管中，将37%甲醛用磷酸盐缓冲液（PBS）稀释，配制成使用前新鲜的3.7%终浓度溶液。将解剖好的脑组织转移至含固定液的微量离心管中，在室温下轻轻振荡孵育15分钟。 
		注意：甲醛易自然氧化生成甲酸。因此建议将37%甲醛分装保存，并在每次使用前新鲜稀释至3.7%。过度或不足固定均会影响组织完整性及荧光信号10。</li>
		<li>用PBTx（含0.4% Triton X-100的PBS）洗涤3次，每次15分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>进行免疫组织化学染色并封片。
	<ol>
		<li>如需进行抗体染色，吸除PBTx，加入用含5%正常山羊血清的PBTx稀释的一抗，在4 °C下于分装混合仪上孵育过夜。</li>
		<li>吸除一抗，用PBTx洗涤3次，每次15分钟。加入用含5%正常山羊血清的PBTx稀释的二抗，在室温下孵育1小时或4 °C下孵育过夜。再用PBTx洗涤3次，每次15分钟。</li>
		<li>如需DAPI染色，吸除PBTx，加入DAPI溶液（储备液：5 mg/mL，工作浓度为15 µg/mL，用PBTx稀释），在室温下孵育10分钟。随后用PBTx洗涤3次，每次15分钟。</li>
		<li>为透明化组织，取一张载玻片，在其两侧各贴一层透明胶带作为垫片，在中央滴加一滴封片介质。将脑组织转移至封片介质液滴中，静置1–2分钟，直至脑组织变得透明。然后用移液器小心吸除多余封片介质。</li>
		<li>进行封片时，在载玻片上的脑组织上滴加一滴新鲜封片介质。小心覆盖盖玻片，避免产生气泡。用橡胶胶水密封边缘，在室温下空气干燥20分钟。建议立即进行图像采集以获得最佳结果。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 图像采集
<ol>
	<li>优化显微镜采集参数，包括空间分辨率、物镜、缩放倍数、扫描速度和步长，以最大限度提高目标结构的分辨率，便于在图像分析过程中进行半自动分割。 
	注意：在对所有实验样本成像之前，可先采集一幅示例图像并测试半自动分割效果（见本方案第5步），这可能有助于优化成像。通过这种方式，用户可调整成像设置，使分析工具能够清晰识别目标生物学结构。</li>
	<li>调整图像检测器控制参数，以获得样品最高的信噪比和最宽的动态范围。
	<ol>
		<li>在调整设置时，使用查找表（LUT）来指示像素饱和（曝光过高）或未饱和（偏移过低）的情况（图3B，红色表示Hi/Low LUT指示的像素饱和）。</li>
		<li>验证增益和偏移设置是否适用于所有实验组，因为实验处理可能会改变目标结构。 
		注意：为进行定量比较，所有实验组必须使用相同的设置。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>对组织进行完整成像，以获取全部数据。 
	注意：建议在一次成像过程中采集所有可用数据；如有需要，可在第4步进行感兴趣区域（ROI）选择时再定义更精确的区域。</li>
	<li>将图像保存为成像软件支持的文件类型，以保留采集参数和空间校准等元数据。文件命名应包含实验日期、遗传背景以及对应各通道的荧光报告分子、抗体或染料，例如：[实验组名称]_[样本名称]_[实验日期]_Ch1.[荧光团-靶标/染料]_Ch2.[荧光团-靶标/染料]，依此类推。</li>
</ol>
4. Fiji/ImageJ 图像导入与 ROI 选择
<ol>
	<li>在 Fiji 中打开图像。使用 &#34;Bio-Formats 导入选项&#34; 对话框中，选择 &#34;使用超堆栈查看&#34; 并设置 &#34;颜色模式：灰度&#34;. 
	注意：建议打开显微镜文件类型，以便Fiji读取空间校准等元数据。</li>
	<li>根据标记通道，在单个 z 平面或投影中确定一个可作为标准化 ROI 在不同样本间使用的区域图1，ROI 选择）
	<ol>
		<li>使用 &#34;C&#34; 滚动滚动条以查看在步骤1.1中指定用于捕获标记物的通道。</li>
		<li>使用 &#34;Z&#34; 通过滚动条浏览不同焦平面。通过点击选择单个切片，或创建多个切片的投影 &#34;图像 | 图像序列 | Z轴投影&#34; 并设置 &#34;开始切片&#34; 和 &#34;停止切片&#34; 以涵盖感兴趣区域。 
		注意：设置 &#34;投影类型&#34; 到 &#34;最大强度&#34; 在 &#34;Z轴投影&#34; 对话框通常最适合在第5节中突出显示用于分割的结构，但此方法可能并不适用于所有应用场景。如果分析需要其他类型的投影，请务必将其保存并记录为相应的文件，以便在第6节和/或第7节中进行特征提取。</li>
		<li>生成包含感兴趣通道和焦平面的新图像，以简化图像分析流程中的后续步骤。选择 &#34;图像 | 复制&#34;，设置所需的 &#34;通道&#34; (c) 和 &#34;切片&#34; (z)，并将文件名更改为反映该选择的名称（例如，[实验组名称]_[样本名称]_[实验日期]_[通道]_[z平面]）</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用以下其中之一 &#34;选择工具&#34; 在 Fiji 工具栏上手动选择一个基于步骤 4.2 确定的选择标准的标准化 ROI。</li>
	<li>通过点击将 ROI 添加到 ROI 管理器中 &#34;分析 | 工具 | 感兴趣区域管理器&#34; 并单击 &#34;添加&#34; 在“感兴趣区域（ROI）管理器”菜单中，通过点击“ROI管理器”菜单保存该感兴趣区域。 &#34;更多 | 保存&#34;，然后将文件命名以反映该 ROI（感兴趣区域）例如，[实验组名称]_[样本名称]_[实验日期]_[通道]_[z平面]_[ROI描述]） 
	注意：此操作可在Fiji中重新打开以进行后续分析，或如第5.3节所述应用于其他通道或图像。</li>
</ol>
5. 使用 h-maxima 水文分割法进行预处理与分割
<ol>
	<li>对用于捕获目标结构的通道进行预处理。
	<ol>
		<li>如果图像文件包含多个通道，请通过点击 &#34;Image | Color | Split channels&#34; 将通道分离，以分离出目标通道。</li>
		<li>通过点击 &#34;Process | Filters | Filter type&#34; 应用滤波器（例如中值滤波器以减少噪声，或高斯模糊以实现平滑）（例如，&#34;Median Filter&#34; 或 &#34;Gaussian Blur&#34;）。
		<ol>
			<li>在来自各实验组的图像上测试不同的滤波器及滤波参数。从每组中选取一个代表性样本继续执行步骤 6.2，以检查分割效果。选择有助于目标结构分割的滤波器及设置。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>记录所用滤波器及参数设置，并在所有实验组中应用相同的参数。</li>
		<li>将图像另存为包含所应用滤波器的 tiff 文件以供参考。使用详细命名格式，例如 [实验组名称]_[样本名称]_[实验日期]_[通道]_[z平面(s)]_[带参数的滤波器]。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在步骤 5.1 生成并保存的预处理图像上，使用交互式 h-maxima 分水岭工具对目标结构进行分割。
	<ol>
		<li>在 Fiji 中打开预处理后的图像，通过点击 &#34;SCF | Labeling | Interactive H_Watershed&#34; 启动 h-maxima 交互式分水岭工具。 
		注：该插件首先计算分水岭，然后允许用户通过实时更新的输出图像，探索局部极大值和阈值选项对分割结果的影响。</li>
		<li>在控制面板中调整种子动态（h）、强度阈值（T）和峰值淹没（%），以优化分割效果。 
		注：始终参考第 4.2 节中预处理前的原始图像，手动检查目标结构的分割性能。</li>
		<li>当对分割结果满意后，选择 &#34;Export regions mask&#34;，然后选择 &#34;Export&#34;。这将生成分水岭结果的二值图像（图 1，分割）。</li>
		<li>记录分割参数；为进行定量比较，这些参数需在所有实验组中保持一致。如需保留参考，可将二值结果掩膜保存，文件名中应详细包含分割参数，例如 [实验组名称]_[样本名称]_[实验日期]_[通道]_[z平面(s)]_[带参数的滤波器]_[H_Watershed 参数]。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>从分水岭结果中提取目标结构。
	<ol>
		<li>在 ROI 管理器中打开第 4.4 步保存的 ROI。将第 5.2.4 步生成的二值区域掩膜设为活动图像后，在 ROI 管理器中选择该 ROI 并应用到图像上，以将特征提取限制在标准化的 ROI 范围内。</li>
		<li>在二值分水岭掩膜上激活 ROI 后，在对话框中选择 &#34;Analyze | Analyze particles&#34; 并勾选 &#34;Add to Manager&#34;，以提取特征。 
		注：这将为分割过程中划定的每个结构添加一个粒子标识符至 ROI 管理器。该菜单提供选项，可根据大小或圆形度排除某些特征，以优化纳入分析的结构。</li>
		<li>在 ROI 管理器菜单中点击 &#34;More | Save&#34; 保存粒子。确保取消选择标识符，所有粒子将被保存为一个 zip 文件。使用详细命名格式，例如 [实验组名称]_[样本名称]_[实验日期]_[通道]_[z平面(s)]_[带参数的滤波器]_[H_Watershed 参数]_[结构]。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. 数量、面积与强度的定量与分析
<ol>
	<li>打开在步骤 4.2 中生成并保存的原始图像。滚动至用于捕获目标结构的通道。 
	注意：必须从原始图像（预处理前）中获取强度测量值，因为在步骤 5.1 中应用滤波器会改变像素值。</li>
	<li>打开在步骤 5.3 中通过特征提取获得的粒子，并从 ROI 管理器中选择 &#34;显示全部&#34;。 
	注意：此操作会将每个粒子的轮廓叠加显示在图像上，这些轮廓来自 &#34;ROI 管理器&#34;，应与目标结构的边缘一致（图 1，特征提取）。</li>
	<li>点击 &#34;分析 | 设置测量项&#34; 以设定所需的测量参数。 
	注意：通过选择 &#34;面积&#34; 和 &#34;积分密度&#34;，可测量粒子的面积、强度和密度。当选中积分密度时，Fiji 将生成两个值：“积分密度”，其计算方式为面积与平均灰度值的乘积；以及“原始积分密度”，其为像素值的总和。粒子中荧光蛋白的密度计算公式为像素值总和除以面积。步骤 5.3 生成的粒子数量表示在步骤 4.4 中定义的组织 ROI 内的粒子总数。</li>
	<li>从 ROI 管理器菜单中选择 &#34;测量&#34;。只要测量数据来源于由成像软件导出并在 Fiji 中处理的文件，结果将以校准后的单位表示。将结果窗口中的数据复制并粘贴至电子表格软件中，用于汇总和进一步计算。</li>
</ol>
7. 比值定量与数据分析
<ol>
	<li>按照步骤 6.1 和 6.2 打开感兴趣的第一个原始通道中的粒子标识。</li>
	<li>单击 &#34;分析 | 设置测量值&#34;，设置所需的测量参数。 
	注意：通过选择 &#34;平均灰度值&#34;，可测量每个粒子的平均强度。</li>
	<li>在 ROI 管理器中选择 &#34;测量&#34;。从结果窗口复制数据，并粘贴至电子表格软件中。</li>
	<li>将 &#34;C&#34; 滚动条移至第二个感兴趣的原始通道，在本示例中为 GFP 通道（图 4A），然后重复步骤 7.2 和 7.3。 
	注意：步骤 5.3 中保存的粒子默认关联其生成时所在的通道和切片。请确保将粒子应用于正确的感兴趣通道。</li>
	<li>在电子表格软件中，计算每个粒子在两个通道之间的强度比值。</li>
	<li>使用散点图可视化并量化表现出反映潜在生物学过程个体变化的荧光团的比率数据。
	<ol>
		<li>在绘图软件中生成散点图。 
		注意：每个数据点代表一个感兴趣结构，其中第一个感兴趣荧光团的强度作为 &#34;x 值&#34;，第二个荧光团的强度作为 &#34;y 值&#34;，均来自同一粒子的测量结果。</li>
		<li>为每个荧光团设置门控阈值，以定义象限。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用线轮廓分析可视化感兴趣结构上荧光团强度的分布。
	<ol>
		<li>选择步骤 5.3 中生成的一个 ROI，并使用工具栏上的直线工具在 ROI 中绘制一条直线。将该直线 ROI 添加到 ROI 管理器中。</li>
		<li>对于每个感兴趣通道，在激活直线 ROI 的情况下，选择 &#34;分析 | 绘制轮廓图&#34;。 
		注意：轮廓图功能将生成沿直线的强度值直方图及对应数据表。复制各通道测得的结果并粘贴至电子表格软件中，以生成显示两个通道沿直线强度分布的图表。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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<li>Shiber, A., Breuer, W., Ravid, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+quantification+and+characterization+of+intracellular+protein+aggregates+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Prion%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric quantification and characterization of intracellular protein aggregates in yeast.</a> Prion. 8 (3), 276-284 (2014).</li>
<li>Mizushima, N., Yoshimori, T., Levine, B. <a target="_blank" href="https://www.cell.com/cell/fulltext/S0092-8674(10)00063-2">Methods in mammalian autophagy research.</a> Cell. 140 (3), 313-326 (2010).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本文所述方案可用于对基于荧光成像所观察到的细胞生物学过程进行稳健且可重复的定量分析。在指导实验设计时，必须仔细考虑生物学背景和技术局限性。对于目的亚细胞结构的荧光标记物，无论其为免疫组织化学标记、染料标记或基因表达产物，均需在形态和强度上能够与背景清晰区分。UAS/GAL4 系统被广泛用于在 Drosophila 中驱动靶向基因表达。本文所展示的示例使用携带 GAL4 驱动元件的转基因品系，通过 UAS 增强子调控荧光标记蛋白的转录，以研究神经系统中的蛋白质聚集和自噬现象。若实验需要同时表达一个实验性 UAS 转基因和一个荧光报告转基因，则对照组也应共表达一个无显著生物学效应的转基因，以平衡 GAL4 的剂量效应，例如 UAS-GFP 或 UAS-lacZ。标准化的样品制备流程——如本文所述针对 Drosophila 中枢神经系统和视觉系统的解剖、固定、抗体染色至封片等步骤——对于实现最佳成像与定量分析至关重要。
为实现半自动化分析，并确保实验组之间的准确比较，必须采用良好的成像实践，以最大化...

每年有数百万人受到神经退行性疾病的影响，且随着人口老龄化，其发病率正在上升1。尽管每种神经退行性疾病的病因各不相同，但错误折叠蛋白的聚集以及蛋白质稳态网络的破坏是许多此类疾病的共同病理特征。阐明这些基本且相互关联的过程如何失调并导致神经元功能障碍和细胞死亡，对于理解神经退行性疾病以及指导治疗干预至关重要。基于荧光的成像技术可用于研究神经元中这些复杂而动态的过程，并极大地促进了我们对神经元细胞生物学的理解。对荧光标记蛋白的分析具有挑战性，尤其是在体内（in vivo）进行实验时，由于组织高度致密、细胞类型多样以及形态异质性显著，分析难度更大。人工辅助的定量方法成本较低且操作直接，但通常耗时较长且易受人为偏差影响。因此，亟需发展一种无偏倚、可重复且易于获取的方法，以从成像研究中提取可量化的数据。
我们概述了一种使用 Fiji/ImageJ 的简单且可灵活调整的工作流程。Fiji/ImageJ 是一款功能强大且可免费获取的图像处理软件2,3，可用于从以 Drosophila 为模型的神经退行性疾病荧光成像研究中提取定量数据。通过遵循本方案对蛋白质聚集和自噬流——这两个与神经退行性疾病病理高度相关的细胞生物学特征——进行定量分析，我们验证了该方法的灵敏性和可重复性。在 Drosophila 视叶中对荧光标记的突变亨廷顿蛋白（Htt）进行分析，可获得蛋白聚集体的数量、大小和荧光强度。我们在 Drosophila 视觉系统中可视化了一种串联荧光自噬流报告系统，该系统可根据所处区室环境的不同发出不同的发射信号4。基于比值的串联报告系统分析，能够对自噬-溶酶体流进行定量且全面的观察，涵盖自噬体的形成、成熟、运输直至在溶酶体中降解的全过程，并进一步揭示在神经退行性条件下易受破坏的敏感区室。重要的是，在上述两种分析中，我们在方案中引入了半自动化的阈值设定和图像分割步骤，以最大限度减少无意识偏差、提高取样能力，并为同类研究之间的比较提供标准化依据。这一简洁明了的工作流程旨在使神经生物学家及更广泛的生命科学领域研究者能够更便捷地使用由计算机科学家基于数学算法开发的强大 Fiji/ImageJ 插件。

<table><tbody><tr><td>SYLGARD(R) 184 硅酮弹性体试剂盒</td><td>Dow Corning Corporation</td><td>PF184250</td><td>解剖皿</td></tr><tr><td>Falcon 35 mm 未经组织培养处理的易握型细菌培养皿</td><td>Corning</td><td>351008</td><td>解剖皿</td></tr><tr><td>Dumont #5 镊子</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-20</td><td>解剖工具</td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Sigma</td><td>S3014</td><td>PBS 溶液</td></tr><tr><td>磷酸氢二钠&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>S5136</td><td>PBS 溶液</td></tr><tr><td>磷酸二氢钾</td><td>Sigma</td><td>P5655</td><td>PBS 溶液</td></tr><tr><td>Triton&amp;nbsp;X-100</td><td>Sigma</td><td>T9284</td><td>洗涤和抗体孵育溶液。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>37% 甲醛</td><td>VWR</td><td>10790-710</td><td>固定</td></tr><tr><td>一次性微量离心管（0.5 mL，蓝色）</td><td>VWR</td><td>89000-022</td><td>固定、洗涤和抗体孵育。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>普通和磨砂载玻片（25&amp;times;75 mm）</td><td>VWR</td><td>48312-004</td><td>共聚焦成像用载玻片</td></tr><tr><td>矩形显微盖玻片（22&amp;times;40 mm）</td><td>VWR</td><td>48393-172</td><td>共聚焦成像用载玻片</td></tr><tr><td>橡胶胶水</td><td>Slime</td><td>1051-A</td><td>封片</td></tr><tr><td>VECTASHIELD 抗荧光淬灭封片剂</td><td>Vector Laboratories, Inc.</td><td>H-1000</td><td>封片</td></tr><tr><td>Scotch Magic 810 透明胶带（19 mm&amp;times;25.4 m）</td><td>3M Company</td><td>810</td><td>封片</td></tr><tr><td>正常山羊血清</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>PCN5000</td><td>抗体孵育</td></tr><tr><td>DAPI（4',6-二脒基-2-苯基吲哚，二盐酸盐）&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D1306</td><td>核酸染色。用去离子水溶解配制成 5 mg/mL 储存液，于 -80&amp;deg;C 保存。使用时用 PBTx 稀释至工作浓度 10–20 &amp;mu;g/mL。</td></tr><tr><td>3.5X–90X 立体变倍工业检测显微镜</td><td>AmScope</td><td>SM-1BNZ</td><td>解剖显微镜。配备 6 W LED 双蛇形管照明器</td></tr><tr><td>ImageJ/Fiji</td><td>NIH</td><td>v1.51u</td><td>含 SCF_MPI_CBG 插件（版本 1.1.2）</td></tr><tr><td>FV1000-IX81 共聚焦激光扫描显微镜</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>重组构建体</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>BL37749</td><td></td></tr></tbody></table>

神经退行性变的定量细胞生物学研究 果蝇 使用 imagej 对荧光标记蛋白进行无偏分析

Quantitative Cell Biology of Neurodegeneration in Drosophila Through Unbiased Analysis of Fluorescently Tagged Proteins Using ImageJ

随着神经退行性疾病发病率的不断上升，深入理解导致神经元功能障碍和丢失的潜在病理生理机制变得愈发重要。基于荧光的成像工具和技术能够实现对亚细胞水平神经生物学过程的前所未有的分析，但仍亟需一种无偏倚、可重复且易于获取的方法，以从成像研究中提取可量化的数据。我们开发了一种简单且可灵活调整的工作流程，用于从基于荧光的成像研究中提取定量数据，该方法利用神经退行性疾病的 Drosophila 模型实现。具体而言，我们描述了一种易于操作的半自动化方法，使用 Fiji/ImageJ 分析两个细胞过程：首先，通过荧光标记的突变型亨廷顿蛋白，定量分析 Drosophila 视叶中的蛋白聚集体含量及其分布特征；其次，利用自噬双荧光报告系统进行比率化定量，评估 Drosophila 视觉系统中的自噬-溶酶体通量。尤为重要的是，本文所述方案包含一个半自动化的分割步骤，以确保所有荧光结构均被分析，从而最大限度地减少选择偏差，并提高细微差异比较的分辨率。该方法可拓展应用于分析神经退行性疾病中其他相关的细胞结构与过程，例如蛋白聚集点（应激颗粒和突触复合物）以及膜结合区室（线粒体和膜运输囊泡）。本方法为图像分析与定量提供了标准化且可灵活调整的参考基准，有助于提升该领域内研究的可靠性与可重复性，最终促进对神经退行性疾病机制的深入理解。

荧光标记的突变型Htt聚集体的数量、面积和强度的定量分析 果蝇 视叶
研究中枢神经系统中错误折叠蛋白的聚集 果蝇 亨廷顿病模型，带有RFP标签的突变型人类Htt，具有非致病性（UAS-RFP-hHttQ15）或病理性扩张（UAS-RFP-hHttQ138）以及膜结合型GFP（UAS-mCD8::GFP)11 在泛神经元驱动子下共表达 elav-GAL4雌性果蝇羽化后2天（DAE）的脑组织按照方案第2节所述进行解剖、固定和DAPI染色。使用40倍油镜（数值孔径NA为1.30）对视叶区域进行共聚焦激光扫描显微成像，扫描速度为 8.0 µs 每像素12位，空间分辨率为1024×1024像素。成像软件确定的最佳步长为 1.08 µm 每张切片使用以下激发/发射波长组合的物镜进行成像：通道1）GFP为488/510...

我们开发了一种简单且可适应的工作流程，用于从基于荧光成像的细胞生物学研究中提取定量数据，以分析神经退行性 Drosophila 模型中枢神经系统中的蛋白质聚集和自噬流。

神经退行性变的定量细胞生物学研究 果蝇 使用 ImageJ 对荧光标记蛋白进行无偏分析

随着神经退行性疾病患病率的上升，深入了解导致神经元损伤的潜在病理生理机制变得愈发重要……

我们开发了此方法，旨在从基于荧光成像的研究中提取定量数据，以解析神经退行性疾病果蝇模型中复杂的动态细胞生物学过程。该技术的主要优势在于其具有可适应性的半自动化图像分析流程，可最大限度减少选择偏倚，提高取样能力，并实现领域内的可重复性。该方法可进一步拓展用于分析其他与神经退行性疾病相关的蛋白质聚集点及膜结合区室，最终将加深我们对神经退行性疾病机制的理解。在体视显微镜下进行解剖时，将两把镊子滑入视网膜下方，轻轻从眼球中部撕开以去除视网膜，从而保持视网膜下层（lamina）的完整性。使镊子始终与视网膜下层表面平行，撕去任何仍附着在视网膜下层上的残留视网膜组织。每组解剖3至5个脑组织，随后将脑组织转移至含有适当固定剂的微量离心管中，在室温下轻轻振荡固定15分钟。在 PBS 加入 Triton X-100 或 PBTx 中进行三次每次 15 分钟的洗涤后，将最后一次洗涤液更换为用含 5% 正常山羊血清的 PBTx 稀释的一抗溶液，在 4 摄氏度下于分装混合仪中避光孵育过夜。次日早晨，用 PBTx 洗涤三次，每次 15 分钟，去除多余一抗，然后将脑组织置于含 5% 正常山羊血清的 PBTx 中稀释的适当二抗溶液内，在室温下孵育 1 小时。孵育结束后，按上述方法将脑组织洗涤三次，每个组织样本取一张显微镜载玻片，在其中心位置的两段透明胶带之间滴加一滴封片介质。将脑组织置于封片剂中1至2分钟。当组织变得透明后，用移液器小心地从两侧去除封片剂。为成像染色组织，向脑组织上滴加一滴新鲜封片剂，并小心地加盖盖玻片。用橡胶胶水密封盖玻片边缘，并将载玻片在室温下空气干燥 20 分钟。随后在显微镜下观察样本，并调节荧光显微镜上的图像检测器控制参数，以在样本的最大动态范围内获得最高的信噪比。一旦参数优化完成，再观察另一组的样本，以确认该设置在整个实验中均适用。随后可对第一个样本进行成像，并注意将图像保存为能够保留元数据（如采集参数和空间校准）的文件类型。为分析图像，可在Fiji中打开图像，从“Bio-formats导入选项”对话框中选择“以超堆栈形式查看堆栈”，并将颜色模式设置为灰度。通过C滚动条查看各通道，Z滚动条切换不同焦平面，根据标记通道确定一个可用于所有样本的标准化感兴趣区域。为简化图像分析，生成一个包含通道和焦平面的新图像，然后选择“图像”和“复制”。设置所需的通道和切片，并更改文件名以反映所选内容。根据先前确定的选择标准，使用选区工具手动选择一个标准化的兴趣区域。单击“分析”、“工具”、“感兴趣区域管理器”，然后单击“添加”以将感兴趣区域添加到感兴趣区域管理器中。接着单击“更多”并选择“保存”，并为文件命名以反映该感兴趣区域。对于图像的预处理，单击“滤镜”中的“处理”，然后选择适当的滤镜。在此选择滤波设置，以在保留边缘的同时减少噪声，从而有助于在分割过程中检测目标结构。在 Fiji 中激活预处理后的图像后，点击 SCF、Labeling 和 Interactive H_Watershed。在控制面板中调节 Seed dynamics、Intensity threshold 和 Peak flooding 参数，以优化分割效果。当分割结果优化完成后，选择“导出区域掩膜”和“导出”，以生成分水岭分割结果的二值图像。打开已保存的标准感兴趣区域。在“感兴趣区域管理器”中选择感兴趣区域标识符，以将特征提取范围限制在图像中的标准化感兴趣区域内。在二值化分水岭掩膜的兴趣区域处于激活状态时，选择“分析”、“分析颗粒”和“添加到管理器”，以提取特征，并为分割过程中界定的每个结构在“兴趣区域管理器”中添加颗粒标识符。然后保存所添加的颗粒，注意取消选中标识符，确保所有颗粒均保存为一个压缩文件。现在打开预处理的原始图像，并滚动至用于捕获目标结构的通道。打开通过特征提取获得的颗粒，在“感兴趣区域管理器”中选择“显示全部”，以将每个颗粒的轮廓叠加到图像上。点击“分析”并选择“设置测量值”，设定适当的实验测量参数。然后在“感兴趣区域管理器”中选择“测量”，并将结果复制粘贴到合适的电子表格程序中，用于数据汇总和进一步计算。通过对果蝇视叶标准化焦平面中半自动分割的RFP亨廷顿蛋白聚集体数量进行定量分析，揭示了非致病性亨廷顿Q15扩增与致病性亨廷顿Q138扩增在蛋白聚集体累积方面的差异表达。来自五个表达亨廷顿Q138的不同视叶标准化焦平面中所有聚集体的大小和强度分布图，展示了该工作流程的稳健性与可重复性。在图像采集过程中，即使聚集体曝光过度，其大小和数量的定量结果仍与理想曝光条件下捕获的聚集体相当。然而，过曝光聚集体的强度会随其尺寸变化，因为饱和像素表现出最大强度值。通过多个自噬相关结构或Atg8阳性结构观察mCherry和GFP的强度分布，可发现报告分子的差异：两种荧光蛋白均呈现高强度时，指示自噬小体；mCherry高强度而GFP低强度则指示与溶酶体融合，因为GFP在此酸性区室中被淬灭。最后，低 mCherry 信号反映了溶酶体内的降解过程。通过对每个半自动分割的 mCherry-Atg8 阳性颗粒的平均荧光强度生成的散点图，可以展示自噬-溶酶体通路中的通量，并可通过象限分析将其分解为离散的步骤。在进行该操作时，需注意图像分析步骤中的用户自定义参数高度依赖于具体应用。因此，务必仔细记录工作流程，以确保不同样本之间的一致性和可比性。

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科研

JoVE Journal

Neuroscience

神经科学

荧光标记蛋白 ImageJ 的无偏分析在果蝇变性定量细胞生物学中的应用

单个Drosophila小眼的解剖与成像

本视频展示了在基因改造的 Drosophila...

成像与定量分析基因修饰细胞中的蛋白质聚集体 果蝇 大脑

果蝇（Drosophila）被广泛用作研究神经变性的模式系统。本方案描述了一种通过检测大脑中空泡形成来量化神经变性的方法。此外，通过将对照组和实验组果蝇作为同一样本进行处理和切片，该方法还能最大限度地减少实验操作带来的影响。...

大规模组织学定量分析神经退行性变 果蝇

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分析长期光照后黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）感光细胞的突触调节

本方案描述了成年个体的解剖与免疫染色方法 黑腹果蝇 脑组织。具体而言，本方案重点介绍了使用 果蝇...

成年黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）大脑中蘑菇体与光感受器神经元的解剖及免疫荧光染色

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监测朊病毒样蛋白聚集体的细胞间传播 黑腹果蝇

本方案重点介绍果蝇（Drosophila）神经元树突分支复杂性（NDAC）的定量分析，可用于树突形态发生相关研究。...

神经元树突分支复杂性的定量分析 果蝇

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在与神经退行性变相关的成年 Drosophila 中可视化突触退化

本文介绍了利用eGFP荧光在黑腹果蝇（Drosophila）复眼中对光感受器膜蛋白进行定位以及评估视网膜变性的非侵入性方法。...

使用 eGFP 标记蛋白在 Drosophila 感光细胞中研究膜蛋白转运

本研究介绍了一种简化的组织处理流程，包括断头、固定、冷冻切片、荧光染色、免疫染色和成像，该方法可进一步扩展至共聚焦和多光子成像。该技术具有与复杂解剖方法相当的效率，且无需依赖高超的手术操作技能。定量图像分析为其提供了广泛的研究潜力。...

直接冷冻切片 果蝇 用于增强脑组织荧光染色与免疫染色的头部装置

学习使用ImageJ对果蝇神经退行性疾病模型中的荧光标记蛋白进行无偏定量分析。该半自动化工作流程可最大限度减少选择偏差，提高采样能力，实现蛋白质聚集体和自噬通量的可重复定量测量。

神经退行性变的定量细胞生物学研究果蝇使用 ImageJ 对荧光标记蛋白进行无偏分析

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