Name: 利用数字图像分析系统测量草坪的茎和根状茎 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 2 s
Description: 学习利用数字图像分析系统测量草坪草茎和根状茎的形态特征。该方法适用于大生物量样本，可精确测定茎和根状茎的长度与直径，为植物生长动态研究提供可靠数据支持。

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1. 生物量样品的采集
<ol>
	<li>采集样品，包括地上生物量及适当深度的土壤层（根据物种而定，对于草坪草类物种，通常15 cm深度已足够），以确保同时收集到匍匐茎和根状茎。 
	注意：在开始研究前必须考虑整体样地面积，因为将进行破坏性取样。一般而言，实验持续时间越长，所需的样地面积越大。</li>
	<li>在采样前检查土壤状况：如果土壤过于干燥，特别是在重质土壤中，可能难以采集样品。此时，应在采样前对样地进行灌溉，以软化采样土层。</li>
	<li>使用土壤钻取器（直径≥ 8 cm）或用取样框（≥ 10 cm × 10 cm）界定采样表面积，并用铲子采集样品。用实验室标签纸对每个样品进行标记。</li>
	<li>每块样地采集多个随机样品，以确保其能代表植物种群的整体情况。</li>
	<li>整个实验过程中使用相同的采样工具，并记录每个样品所代表的面积，用于计算匍匐茎和根状茎密度。 
	注意：此步骤可作为暂停点，样品可装入塑料袋中，并在低于 -18 °C 的条件下保存。</li>
</ol>
2. 生物质样品的清洗
<ol>
	<li>根据匍匐茎或根状茎的大小，将样品放入具有 0.5–1.5 mm 孔径的大型筛子中。筛孔应足够小，以保留所有匍匐茎和根状茎，同时足够大，使土壤颗粒能够被去除。对于沙质土壤，可将两个不同孔径的筛子上下叠放，以提高分离的精确性和效率。</li>
	<li>用具有一定压力的水流冲洗样品，以去除附着的土壤颗粒，同时避免损伤植物组织。</li>
	<li>取出清洗后的样品，放置于铺有纸巾的托盘中，并注意对托盘进行适当标记。 
	注意：本实验方案可在此暂停，样品可装入塑料袋中，并在低于 -18 °C 的条件下保存。</li>
	<li>使用剪刀进一步清理样品，去除根系和叶片组织。如有需要，可在此过程中将匍匐茎和根状茎分开，并记录其他相关信息，如植株数量、分蘖数以及每株的匍匐茎数量。 
	注意：彻底去除匍匐茎和根状茎上的根和叶组织可提高分析精度。细根较难完全去除，但通过数字图像分析，可使用特定软件工具排除直径小于设定阈值的器官（见步骤 5.1），该阈值可根据屏幕上重现图像的观察结果较为准确地确定。</li>
	<li>将匍匐茎和根状茎放入已标记的纸袋中。 
	注意：本实验方案可在此暂停，样品可装入塑料袋中，并在低于 -18 °C 的条件下保存。</li>
</ol>
3. 样品的扫描与图像分析
<ol>
	<li>将样品放置在 WinRHIZO 标准扫描设备的透明塑料托盘中。使用实验室镊子手动摆放匍匐茎和根状茎，以尽量减少重叠。较大的样品可能需要分割成子样品。</li>
	<li>不要向托盘中加水（与根系扫描推荐方法不同），因为匍匐茎和根状茎具有足够的刚性，可避免器官间过度靠近而引起读数误差，这种情况通常发生在细根中。</li>
	<li>将托盘放置在扫描仪表面。</li>
	<li>打开扫描仪并启动程序。</li>
	<li>在 Image 菜单下的Image acquisition parameter命令中检查图像 dpi，以便对保存的图像进行进一步控制。</li>
	<li>在 Analysis菜单下的Root &amp;#38; Background Distinction命令中检查阈值，以确保扫描器官的像素得到良好分类。</li>
	<li>在 Image 菜单下的Image acquisition parameter命令中，确认整个托盘表面将被扫描。</li>
	<li>在扫描图像上方的图形区域中，检查按直径分布的器官所显示的直径分级。通过点击图表的横轴，选择20个等宽分级，每级间隔0.1 mm。此功能可在匍匐茎或根状茎未完全清洁时，排除属于根系或小型器官的数据。文献报道，大多数草坪草种的根系直径小于0.2 mm。 
	注意：可根据分析样品的匍匐茎和根状茎平均直径及其变异程度，调整分级的宽度和数量。应通过对部分样品的对照分析，确定需排除的最小直径值。</li>
	<li>运行第一个样品的扫描，并检查编辑结果是否有利于后续分析。</li>
	<li>按照软件说明保存图像和分析结果。使用样品标签对图像和分析结果进行标注。</li>
	<li>继续扫描所有样品。 
	注意：本实验方案可在此暂停，样品可装入塑料袋中，并在低于 -18 °C 的条件下保存。</li>
</ol>
4. 干重的测定
<ol>
	<li>使用精密电子天平，将扫描后的样品放入已去皮的铝制托盘中。</li>
	<li>对所有扫描后的样品重复步骤 4.1。</li>
	<li>将所有样品放入设定为 105 °C 的烘箱中，干燥 24 h。</li>
	<li>取出样品，等待组织重量稳定。</li>
	<li>连同去皮托盘一起称量所有样品。</li>
	<li>从记录的重量中减去托盘重量，得到每个样品的净重。</li>
</ol>
5. 数据校正及长度与重量密度的计算
<ol>
	<li>长度和平均直径的校正
	<ol>
		<li>将 WinRHIZO 分析生成的 .txt 文件转换为 .csv 文件。</li>
		<li>利用按直径等级分类的结果，排除直径小于 0.2 mm 的器官数据（如根、叶片部分或托盘上的划痕）。</li>
		<li>对每次 WinRHIZO 测量结果（.txt 文件中的每一行），累加所有直径大于 0.2 mm 等级的长度记录。通过此校正计算得到的长度即为后续数据处理所用的有效长度。</li>
		<li>对每次 WinRHIZO 测量结果，累加所有直径大于 0.2 mm 等级的投影面积记录。长度与投影面积的比值即为排除直径小于 0.2 mm 器官后校正的平均直径。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>若样品被分为多个子样品，则最终长度为所有子样品长度之和，最终平均直径为所有子样品长度总和与所有子样品投影面积总和的比值。</li>
	<li>必要时，根据样品大小计算单位表面积的长度和重量密度。</li>
	<li>使用所获得的数据进行统计分析。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本文所述方案是为草坪草研究开发并评估的。然而，通过根据植物的形态特征、环境条件以及样品清洁精度进行必要的调整，该方案也可应用于其他多种匍匐茎或根状茎植物。
通过本方案估算的平均直径不能与使用游标卡尺测量的节间直径进行比较。数字图像分析在计算平均直径时包含了节和节间，该平均直径定义为总投影表面积与总长度的比值。Pornaro 等24指出，使用WinRHIZO系统测得的狗牙根匍匐茎平均直径比游标卡尺在节间处测得的实际直径值偏大。匍匐茎直径通常用于描述匍匐茎节间的直径，是植物形态描述中常用的一个参数18,25。因此，Pornaro 等24强调，通过WinRHIZO系统估算的平均直径与人工测量的节间直径反映的是两种不同的形态学特征。
完成本方案所需的时间仍是常规分析中的一个限制因素。最耗时的阶段是样品的清洗（步骤2.4）。根据我们的经验，清洗一份生物量较大的草皮样品即， 20 x 20 cm）的样本通常需要约三名人员工作2至4小时。如实验方案所述，无论使用数字分析系统，还是使用游标卡尺和直尺，清洁步骤都是必要的。当样本中匍匐茎或根状茎数量较少时，两种方法采集数据所需时间相近。然而，随着样本量增加，基于软件的方法不会显著增加所需时间，其唯一限制因素是扫描仪的扫描面积；相反，使用直尺和游标卡尺测量器官所需时间则随样本中匍匐茎或根状茎数量的增加而相应延长。
对成熟草坪草匍匐茎和根状茎性状的研究一直基于节间长度、直径以及干重的测量7,11,26,27。由于样品处理耗时较长，且随着样品数量增加，人工测量的准确性会下降，因此人工测量应仅限于少量匍匐茎或根状茎的测定11,20,25，可能仅适用于单株植物实验。与传统方法相比，图像分析系统的优势在于能够测量大量匍匐茎或根状茎样品的长度，并可同时计算长度密度和比重量（重量-长度比）。
本方案可用于测量具有较大生物量样品中的匍匐茎和根状茎长度，并计算其长度密度（对于此类样品，目前仅以匍匐茎或根状茎重量作为形态描述的参数）。在许多研究中，匍匐茎和/或根状茎的长度可能是一个重要参数，但现有技术无法对其进行准确估算。近期针对不同草坪草物种的研究6表明，匍匐茎的重量密度与长度密度并不总呈相关性，提示有必要测量多个参数以充分评估匍匐茎和根状茎系统。该方法特别适用于品种间或栽培管理措施的比较研究。
在实验方案中，有多个步骤对于准确估算匍匐茎和根状茎的长度及平均直径至关重要。由于植物在不同环境条件下的形态具有高度变异性，因此应仔细评估样本数量（样本量）以及采样地块的面积范围（采样尺度），使其尽可能代表整个种群，以降低数据的变异性。此外，在分析前需仔细清除匍匐茎上的根和叶片，此项工作较为精细，需特别注意以避免高估结果。最后，在处理图像之前，建议通过软件设置仔细选择直径分级的宽度以及最小直径，以排除所有非匍匐茎或根状茎的结构进入分析。由于直径大小随物种和环境条件（包括栽培措施）而变化，每个实验均需设定合适的最小直径阈值。

植物形态学的研究广泛涉及植物科学的各个学科，包括生态学、农学、生物学和生理学。植物根系因其在胁迫耐受性、土壤稳定性、植物生长和生产力方面的重要性而被广泛研究。匍匐茎和根状茎也因其在植物繁殖策略、恢复能力以及碳水化合物储存中的作用而受到广泛关注。匍匐茎和根状茎是横向生长的变态茎，分别生长在地表之上（匍匐茎）或地表之下（根状茎）。匍匐茎和根状茎上还具有规律排列的节和节间，以及具有分生能力的节，能够产生新的根和芽1。已有大量研究针对不同植物的根系、匍匐茎和根状茎开展了多方面的探讨2,3,4,5,6,7,8。草坪草的根系、匍匐茎和根状茎因其对草坪质量9、冬季休眠后的春季返青能力10以及耐磨性和恢复能力的重要影响而被深入研究11。此外，这些器官也在其他作物中被研究，例如水稻12、大豆4和玉米13等草坪草类作物，以及在牧草系统中，其中侧生茎在控制土壤侵蚀方面发挥关键作用5。
根长密度（单位土壤体积内的根长）和平均直径通常使用扫描软件进行测量3,4,5,9,14,15,16,17,18。相反，匍匐茎或根状茎的长度和直径通常使用直尺和游标卡尺进行测量3,19,20，且需要耗费大量时间和人力21,22,23,24。因此，这类测量通常仅限于少量匍匐茎或根状茎11,20,25，且往往仅用于孤立植株的形态学表征。对成熟冠层中匍匐茎和根状茎性状的研究需要采集大量生物量，因此通常仅测定匍匐茎和根状茎的干重密度（单位面积上的干重）7,11,26,27。事实上，通过将样品在烘箱中烘干，比测量长度和直径更容易获得匍匐茎干重。然而，匍匐茎长度是一个重要的物种和品种特征，与干重的相关性较差。最近一项关于匍匐型多年生黑麦草（Lolium perenne）的研究表明，具有高匍匐茎长度密度的样品不一定具有高的匍匐茎重量密度6。
图像分析系统相比传统的手工方法31,32,33，能够更快28,29、更准确地分析根系，且更不易受人为误差影响30,21。此外，这些系统提供了高度的灵活性和易于使用的工具，包括光源、光学设置和分辨率，通常针对每幅扫描图像进行校准34。Pornaro et al.24 证明，WinRHIZO 系统是一种专为清洗后根系测量设计的图像分析系统，可通过克服人为错误导致的测量偏差，更全面地分析匍匐茎和根状茎性状，从而提供一种替代现有方法的新途径。对于匍匐茎和根状茎生长的形态学描述及定量信息获取，图像分析系统能够快速分析大量样本，即使生物量较大时也能实现，从而提高统计精度。因此，根系分析软件为研究不同植物物种的匍匐茎和根状茎的生长与形态提供了一种可靠、快速的替代方法24。
本研究在意大利东北部开展，旨在探讨四种狗牙根（Cynodon spp.）品种的匍匐茎和根状茎发育情况。该研究旨在增进对种子繁殖型（&#34;LaPaloma&#34; 和 &#34;Yukon&#34;）与营养繁殖型（&#34;Patriot&#34; 和 &#34;Tifway&#34;）狗牙根匍匐茎和根状茎发育过程的理解。试验于2013年5月建立，自2013年秋季至2015年夏季，每年分三次取样（分别为3月（返青前）、7月（生长旺盛期）和10月（冬季休眠前））。在本方法的描述与说明中，我们采用了第二个生长季夏季（2014年7月）采集的样品，因为此时样品生物量较大，适合进行快速分析。采用WinRHIZO软件——一种专为清洗后根系测量设计的数字图像分析工具——测定匍匐茎长度密度和平均直径。

<table><tbody><tr><td>实验室胶带</td><td>任意</td><td>NA</td><td>可使用标签标记样品</td></tr><tr><td>塑料袋</td><td>任意</td><td>NA</td><td>可使用任意塑料袋在样品清洗前保存样品</td></tr><tr><td>纸袋</td><td>任意</td><td>NA</td><td>可使用任意纸袋存放已清洗的样品，以避免霉菌形成</td></tr><tr><td>纸巾</td><td>任意</td><td>NA</td><td>样品用水清洗后、在用剪刀清理前，将其放置于纸巾上以吸收水分会更方便</td></tr><tr><td>剪刀</td><td>任意</td><td>NA</td><td>任何具有细尖头的剪刀</td></tr><tr><td>铝盒</td><td>任意</td><td>NA</td><td>任何足够容纳样品的铝盒</td></tr><tr><td>托盘</td><td>任意</td><td>NA</td><td>在清洗过程中使用塑料托盘盛放样品较为方便</td></tr><tr><td>孔径为 0.5–1.5 mm 的筛子</td><td>任意</td><td>NA</td><td>任意筛子</td></tr><tr><td>土壤钻取采样器</td><td>任意</td><td>NA</td><td>我们使用直径至少为 8 cm 的土壤钻取采样器进行土壤采集</td></tr><tr><td>方形采样框</td><td>任意</td><td>NA</td><td>采集大样品时，我们使用方形采样框（10 × 10 cm、或 15 × 15 cm、或 20 × 20 cm）</td></tr><tr><td>铁铲</td><td>任意</td><td>NA</td><td>我们使用铁铲挖出由方形采样框划定的样品</td></tr><tr><td>精密电子天平</td><td>任意</td><td>NA</td><td>任意精密电子天平</td></tr><tr><td>实验室烘箱</td><td>任意</td><td>NA</td><td>任意实验室烘箱</td></tr><tr><td>冷冻柜</td><td>任意</td><td>NA</td><td>任意冷冻柜</td></tr><tr><td>WinRHIZO 软件</td><td>Regent Instruments Inc., Quebec</td><td>NA</td><td>不包括 &quot;basic&quot; 版本</td></tr><tr><td>WinRHIZO 扫描仪</td><td>Regent Instruments Inc., Quebec</td><td>NA</td><td>WinRHIZO 系统包含一台与软件校准匹配的扫描仪</td></tr><tr><td>WinRHIZO 扫描仪配件</td><td>Regent Instruments Inc., Quebec</td><td>NA</td><td>WinRHIZO 系统包含配件，如塑料托盘和定位器，用于配合扫描仪使用</td></tr></tbody></table>

利用数字图像分析系统测量草坪草的匍匐茎和根茎

Measuring Stolons and Rhizomes of Turfgrasses Using a Digital Image Analysis System

通常使用简单的直尺和卡尺测量匍匐茎或根状茎的长度和直径。该方法耗时且费力，因此通常仅用于有限数量的匍匐茎或根状茎。正因如此，这些性状在植物形态学表征中的应用受到限制。采用数字图像分析软件技术可克服因人为操作错误导致的测量误差，而此类误差往往随着样本数量和尺寸的增加而上升。该方案适用于各类作物，但尤其适用于植株较小且数量较多的牧草或禾本科植物。草坪样品包括地上生物量以及深度达到最大根状茎发育范围的表层土壤，具体深度取决于目标物种。在研究中，样品需从土壤中清洗出来，并在进行数字图像分析软件分析前人工清理匍匐茎/根状茎。随后将样品置于实验室烘箱中烘干以测定干重；因此，每个样品所得数据包括总长度、总干重和平均直径。在分析前，可通过排除扫描图像中可见的多余部分（如清洗过程中未完全去除的残留根系或叶片）对图像进行校正。事实上，这些碎片的直径通常远小于匍匐茎或根状茎，因此可通过设定最小直径阈值（低于该值的对象不纳入分析）轻松将其排除在分析之外。随后可根据样品面积计算单位面积内的匍匐茎或根状茎密度。该方法的优势在于能够快速高效地测量大量匍匐茎或根状茎样本的长度和平均直径。

于2013年秋季开展了一项田间试验，旨在比较四种狗牙根品种的匍匐茎和根状茎发育情况，包括两个种子繁殖类型（“LaPaloma”和“Yukon”）以及两个不育的营养型杂交种（“Patriot”和“Tifway”）。试验采用随机完全区组设计，设三个重复，共12个小区（每个小区2 m × 2 m）。
从每种草坪型品种以及野生狗牙根的试验小区内，随机采集14个匍匐茎和14个根状茎，同时从小区附近生长的野生狗牙根植株中也采集相应样本，共计获得70个匍匐茎和70个根状茎。所有匍匐茎和根状茎在进一步测量前均按照实验方案（步骤2）进行清洗。使用游标卡尺测量节间直径，使用直尺测量节间长度，并统计每个匍匐茎或根状茎的节数。同时记录使用直尺和游标卡尺清洗及测量匍匐茎和根状茎样本所需的时间。匍匐茎和根状茎的直径以所测所有节间直径的平均值计算。总匍匐茎长度和总根状茎长度为所有节间长度之和。此外，使用数字图像分析系统测量每个匍匐茎和根状茎的总扫描长度和扫描直径，具体操作如步骤3和步骤5所述。同时记录使用数字图像分析系统测量匍匐茎和根状茎性状所需的时间。随后用剪刀将每个匍匐茎和根状茎剪开，分离节间与节，节间部分用于估算扫描得到的节间直径，方法见步骤3和步骤5。针对匍匐茎和根状茎（n = 70个匍匐茎，n = 70个根状茎），计算以下指标之间的皮尔逊相关系数：实测长度与扫描长度、实测直径与扫描直径、节数与实测直径和扫描直径差值的绝对值、实测直径与扫描节间直径。使用直尺测量的长度对数字图像分析系统估算的长度进行校准。
回归分析表明，匍匐茎扫描长度与实测长度之间具有高度相关性（图1a），斜率为1.03，截距为-4.22；根状茎扫描长度与实测长度之间也具有高度相关性（图1b），斜率为1.03，截距为4.22。人工清理14条匍匐茎和14条根状茎的平均耗时分别为21分钟24秒和11分钟12秒。使用直尺和游标卡尺测量匍匐茎和根状茎的长度与直径，平均耗时分别为14分钟6秒和13分钟35秒。利用WinRHIZO软件对样品进行扫描及图像分析，平均耗时分别为匍匐茎11分钟，根状茎12分钟4秒。
匍匐茎和根状茎的实测直径与扫描直径也均呈显著相关。实测直径与扫描直径之间的关系接近1:1，表明数据拟合良好（图2a 和 2b）。然而，截距显示，数字图像分析系统对实测直径存在高估现象，尤其在较低数值时更为明显，而对根状茎较大直径值则存在低估。这种高估可能是由于软件在扫描时包含了匍匐茎的节，从而影响了用于计算直径的总投影面积（总投影面积与总长度的比值），而使用游标卡尺测量时则会排除节的干扰。节点数量与两种方法（实测与扫描）所得直径值差异之间的相关性仅在匍匐茎中达到显著水平（图3a）；此外，节点数量的变化仅能解释该差异变异的一小部分（R2 = 14%）。扫描所得节间直径与实测直径之间存在显著相关性（匍匐茎和根状茎的斜率分别为1.01和0.98，截距接近于零）（图4a 和 4b），表明只要去除节点，即可通过数字图像分析系统准确估算节间直径。因此，由多个匍匐茎或根状茎组成的样本的总长度和平均直径均可通过数字图像分析系统进行快速且准确的量化。
作为一项持续实验的一部分，从2013年秋季至2015年夏季，每个小区每季采集一个草坪样品（20 × 20 × 15 cm 深度），并按照本方案所述方法进行处理。2014年7月采集的样品中，单位面积内的匍匐茎和根状茎长度（长度密度）及其单位面积重量（重量密度）如图5所示。营养繁殖品种（“Patriot”和“Tifway”）与种子繁殖品种（“La Paloma”和“Yukon”）在匍匐茎长度密度上存在差异。“Patriot”的根状茎长度密度最高，其次为“Tifway”和种子繁殖品种。所有品种的匍匐茎重量密度均不同，其中“Patriot”最高，随后依次为“Tifway”、“La Paloma”和“Yukon”。营养繁殖品种的根状茎重量密度也高于种子繁殖品种。品种“Patriot”在整个研究期间单位面积内匍匐茎和根状茎的长度（长度密度）及重量（重量密度）变化如图6所示。匍匐茎长度密度从2014年3月到2014年7月有所增加，此后从2014年7月至2015年7月保持稳定。2013年10月和2014年3月采集的样品中仅发现少量根状茎。根状茎长度密度在2014年7月增加并达到峰值，但在2014年10月再次下降。匍匐茎重量密度从2014年3月至7月略有上升；然而，从2014年7月至10月上升更为迅速，随后在2015年3月有所下降。根状茎重量密度的变化趋势与根状茎长度密度相似，在2014年7月达到最高值。
软件在分析中包含扫描图像中的所有对象。图中展示了 WinRHIZO 软件生成的数字图像分析布局示例（图7），其中不同颜色的线条覆盖了不同直径的匍匐茎对象，以计算每个直径等级的总长度。我们可以观察到，该分析包含了根或叶的碎片。如步骤3.9所述，可以限制被分析的直径等级的宽度和数量。直方图显示了长度在所选直径等级中的分布情况（图7）。该直方图可用于评估应排除的最小直径等级。通过目视观察屏幕图像上部的该图可知，长度在平均直径等级周围呈正态分布，但前两个等级的数值明显高于符合正态分布的预期值。即使样品已仔细清洗，若包含这些较小的直径等级，数据分析仍可能影响结果，导致长度密度被高估，而平均直径被低估。我们的结果显示，在软件分析得出的总根状茎长度中，较小直径等级（直径 &lt; 0.2 mm）所占比例为13–32%（Table 1）。此外，平均直径被低估了2–17%（Table 1）。
<img alt="线性回归图比较扫描长度与测量长度；方程 y=1.03x±4.22，r²=0.99/0.98。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58042/58042fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图1"> 
图1：利用直尺测量的狗牙根匍匐茎长度值与数字图像分析系统估算值的回归分析24 （a）和）根茎（b）。 虚线代表1:1的比例。图A已根据Pornaro修改 等24. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58042/58042fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="散点图比较测量值与扫描得到的直径，显示线性回归和相关性。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58042/58042fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图2"> 
图2：百慕大草匍匐茎（a）和根状茎（b）的游标卡尺实测直径值与数字图像分析系统估算值的回归分析24。 虚线表示1:1比例关系。图A经Pornaro 等24修改。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58042/58042fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="比较狗牙根匍匐茎节点数量与直径差异的散点图；线性拟合，标注R²值。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58042/58042fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图3"> 
图3：狗牙根匍匐茎24（a）和根状茎（b）的节点数量与数字图像分析系统估算直径和游标卡尺实测直径之间差值绝对值的回归分析。 虚线表示1:1比例关系。图A经Pornaro et al.24修改。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58042/58042fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="散点图显示扫描与实测直径的线性回归，R²=0.80。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58042/58042fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图4"> 
图4：百慕大草匍匐茎24（a）和根状茎（b）节间直径的游标卡尺实测值与数字图像分析系统估算值之间的回归分析。 虚线表示1:1比例关系。图A经Pornaro et al.24修改。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58042/58042fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="四种草坪草狗牙根品种（Patriot、Tifway、La Paloma、Yukon）的匍匐茎和根状茎长度密度与重量密度比较柱状图；统计分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58042/58042fig5.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 5"> 
图5：田间试验中四种草坪草狗牙根品种（Patriot、Tifway、La Paloma、Yukon）匍匐茎和根状茎长度密度与重量密度的示例结果。 匍匐茎长度密度（a）、根状茎长度密度（b）、匍匐茎重量密度（c）和根状茎重量密度（d）。垂直条形表示六次重复的标准误。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58042/58042fig5large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="显示随时间变化的匍匐茎和根茎长度密度与重量密度的图表；2013-2015年，数据分析结果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58042/58042fig6.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 6"> 
图6：来自田间试验的匍匐茎和根茎长度密度与重量密度的示例结果，显示Patriot狗牙根品种的匍匐茎和根茎发育情况。 匍匐茎长度密度（a）、根茎长度密度（b）、匍匐茎重量密度（c）和根茎重量密度（d）。垂直条线表示六次重复的标准误差。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58042/58042fig6large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="藤蔓结构分析；图像处理软件界面；植物形态学研究；长度测量" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58042/58042fig7.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图7"> 
图7：WinRHIZO软件中数字图像分析的示例布局。 前景中的扫描图像以及屏幕上方的柱状图显示了选定直径等级中的长度分布情况。彩色线条表示图像分析结果，每种颜色对应柱状图中报告的直径等级的颜色。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58042/58042fig7large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td rowspan="2">品种</td>
			<td rowspan="2">区组</td>
			<td colspan="3">根茎长度 (cm/dm2)</td>
			<td colspan="3">平均直径 (mm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&lt; 0.2 mm</td>
			<td>总计</td>
			<td>比率a</td>
			<td>&lt; 0.2 mm</td>
			<td>总计</td>
			<td>比率b</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Patriot</td>
			<td>1</td>
			<td>231</td>
			<td>278</td>
			<td>16.9</td>
			<td>1.637846</td>
			<td>1.5994</td>
			<td>97.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Patriot</td>
			<td>2</td>
			<td>304</td>
			<td>349</td>
			<td>12.8</td>
			<td>1.620667</td>
			<td>1.588371</td>
			<td>98.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Patriot</td>
			<td>3</td>
			<td>304</td>
			<td>366</td>
			<td>16.8</td>
			<td>1.649918</td>
			<td>1.621367</td>
			<td>98.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tifway</td>
			<td>1</td>
			<td>184</td>
			<td>231</td>
			<td>20.6</td>
			<td>2.149745</td>
			<td>1.9951</td>
			<td>92.8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tifway</td>
			<td>2</td>
			<td>155</td>
			<td>193</td>
			<td>19.9</td>
			<td>1.866253</td>
			<td>1.76605</td>
			<td>94.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tifway</td>
			<td>3</td>
			<td>119</td>
			<td>150</td>
			<td>20.9</td>
			<td>1.877386</td>
			<td>1.75865</td>
			<td>93.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>La Paloma</td>
			<td>1</td>
			<td>17</td>
			<td>23</td>
			<td>24.4</td>
			<td>2.139019</td>
			<td>1.8904</td>
			<td>88.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>La Paloma</td>
			<td>2</td>
			<td>26</td>
			<td>38</td>
			<td>31.6</td>
			<td>2.101385</td>
			<td>1.7455</td>
			<td>83.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>La Paloma</td>
			<td>3</td>
			<td>34</td>
			<td>47</td>
			<td>27.5</td>
			<td>2.033729</td>
			<td>1.7354</td>
			<td>85.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yukon</td>
			<td>1</td>
			<td>32</td>
			<td>44</td>
			<td>28.0</td>
			<td>1.700155</td>
			<td>1.4945</td>
			<td>87.9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yukon</td>
			<td>2</td>
			<td>17</td>
			<td>25</td>
			<td>33.2</td>
			<td>1.68339</td>
			<td>1.4284</td>
			<td>84.9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yukon</td>
			<td>3</td>
			<td>67</td>
			<td>87</td>
			<td>23.6</td>
			<td>1.844721</td>
			<td>1.6774</td>
			<td>90.9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">a ≤0.2 mm 类别长度/总长度</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="5">b 总直径/≤0.2 mm 类别直径</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：包含与不包含较小直径等级的根茎长度密度及根茎平均直径。 包含与不包含直径小于0.2 mm等级时的长度密度及其比值（≤0.2 mm等级长度/总长度）；以及包含与不包含直径小于0.2 mm等级时的平均直径及其比值（包含<0.2 mm等级的直径/不包含<0.2 mm直径等级的直径）。

基于软件的图像分析系统为研究匍匐茎和根状茎物种的形态提供了一种替代方法。该方案可用于测量匍匐茎和根状茎的长度与直径，适用于生物量较大的样品，并可应用于多种不同物种。

匍匐茎或根状茎的长度和直径通常使用简单的直尺和卡尺进行测量。该方法耗时且费力，因此常常……

该方法可解答不同作物（如草坪草、草甸和牧场）匍匐茎和根状茎生长与形态方面的关键问题。该技术的主要优势在于，即使样品生物量较大、通常仅以重量作为参数的情况下，仍可测量匍匐茎和根状茎的长度。使用土壤钻取样器采集样品。采集地上生物量及适当深度的土壤层，具体深度取决于物种，以确保收集到匍匐茎和根状茎。或者，使用取样框确定采集的表面积，并用铁锹采集样品。用实验室标签纸标记每个样品。为了清洗生物量样品，将样品置于一个筛孔直径为0.5至1.5毫米的大筛子中，具体孔径取决于匍匐茎或根状茎的大小。筛孔应足够小，以保留所有匍匐茎和根状茎，同时足够大，以便去除土壤颗粒。用一股水流清洗样品，水流力度应足以去除土壤颗粒，但不会损伤植物。取出洁净的样品，将其放置在铺有纸巾的托盘中，并注意对托盘进行适当标记。使用剪刀进一步清理样品，去除根系和叶片。在此过程中，根据需要分离匍匐茎和根状茎，并记录额外信息，例如植株数量、分蘖数以及每株的匍匐茎数量。将匍匐茎和根状茎放入已标记的纸袋中。将样品置于WinRHIZO标准扫描设备的透明塑料托盘上。使用实验室镊子手动摆放匍匐茎和根状茎，以尽量减少重叠。较大的样本可能需要分割成子样本。将托盘放置在扫描仪表面，然后打开扫描仪并启动程序运行。若需对已保存的图像进行进一步控制，可通过选择“图像采集参数”命令，在“图像”菜单中检查图像的 dpi。为了准确分类属于扫描器官的像素，请选择“根部背景区分”命令，检查阈值和分析结果。在“图像”菜单中选择“图像采集参数”命令，确认整个托盘表面将被扫描。现在，查看扫描图像上方图形区域中显示的按直径分布的器官分级。通过点击图表的横轴，选择20个等宽的类别，每个类别的间隔为0.1毫米。此功能可在匍匐茎或根状茎未完全清理干净时，排除属于根系或小型器官的数据。文献报道指出，大多数草坪草种的根系直径小于0.2毫米。运行第一个样品的扫描，并检查编辑是否允许进行良好的分析。按照软件说明保存图像。最后，根据软件选项进行分析处理，并使用样品标签对图像和分析结果进行标注。继续扫描所有样品。为测量干重，将已扫描的样品置于已去皮的铝制托盘中，放在精密电子天平上，记录其去皮重量。对所有已扫描的样品重复此步骤。将所有样品放入设定为105摄氏度的烘箱中，干燥24小时。第二天，取出样品，等待组织重量稳定后，连同样品的皮重一起称量所有样品。从记录的重量中减去皮重，以获得每个样品的净重。图中展示了田间试验的示例结果，比较了四种草坪型狗牙根品种的匍匐茎和根茎长度密度。2014年7月采集的样品中，营养繁殖品种Patriot与Tifway之间，以及种子繁殖品种La Paloma与Yukon之间的匍匐茎长度密度存在显著差异。在根茎方面，Patriot 的长度密度最高，其次是 Tifway 和实生品种。Patriot 品种在整个研究期间的匍匐茎长度密度从 2014 年 3 月到 2014 年 7 月呈增加趋势，自 2014 年 7 月至 2015 年 7 月则未发生显著变化。在 2013 年 10 月和 2014 年 3 月采集的样品中仅发现少量根茎。2014年7月，根茎长度密度增加，并达到最高值；但在2014年10月再次下降。进行该操作时，需注意选择具有代表性的样品，分析前仔细清洗匍匐茎和根茎，并利用软件选项设置直径分级的宽度，确保分析中仅包含匍匐茎和根茎。

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