维持 Aphis nerii 的生物培养及基因表达检测：植物-昆虫互作研究中的非模式系统

本方法描述了蚜虫培养的一般步骤以及蚜虫遗传分析的具体操作。这些方法可用于解答蚜虫进化与生态学领域中的关键问题，以及揭示蚜虫生物学背后的分子机制。该技术的主要优势在于其可广泛适用于大多数蚜虫物种，且实施成本相对较低。

首先，将育苗土装入标准育苗盘中，确保土壤填满每个育苗穴并达到其顶部。当所有育苗穴均填满后，在每个育苗穴的土壤中挖一个深约三厘米的孔，并在每个孔中放入一粒种子。浇水至覆盖种子的土壤完全饱和，然后将育苗盘置于温室中，每隔一天或每天浇水一次，以维持适中的土壤湿度。

当幼苗长出第一组完整的叶片后，用盆栽土填满直径四英寸的圆形花盆，土面距盆沿约五厘米。在土壤中挖一个足够深的洞，直至花盆底部，然后用手轻轻挖取成熟的幼苗，将其深栽入新花盆的洞中。接着，用土壤覆盖幼苗，并每天或隔天浇水一次，以保持土壤适度的湿度。

当植株长出至少三到四组完整的叶片且高度达到至少十厘米时，人工检查植株是否存在不需要的害虫，并使用口吸管小心地将一只野外采集的、正在繁殖的成年蚜虫转移到第一株植物的叶片上，以建立同克隆系。在所有蚜虫转移完成后，用定制的杯形罩牢固地覆盖植株，并将感染蚜虫的植株置于受控环境培养室中。为维持种群培养，每周使用口吸管安全地将一至三只二龄或三龄若虫以及一只成年蚜虫转移到新的植株上。

按照演示的方法，用新的杯子罩住每株植物进行培养。从单个成年蚜虫中提取DNA时，将蚜虫置于含有液氮的无菌1.5毫升微量离心管底部附近，用研杵研磨蚜虫。接着，向微量离心管中加入100微升裂解缓冲液，继续研磨破碎的蚜虫，直至样品明显分解。

用额外的100微升裂解缓冲液冲洗研杵，将研磨后的蚜虫在65摄氏度孵育30分钟。孵育结束后，向离心管中加入14微升醋酸钾溶液，倒置混匀。冰上放置30分钟后，通过离心收集细胞碎片，并将上清液转移至新的1.5毫升微量离心管中，注意不要扰动沉淀。

向上清液中加入 200 微升冰冷的 100% 分子级乙醇，倒置离心管以混匀。室温静置 15 分钟后，通过离心收集沉淀的 DNA，并用移液器吸除乙醇。用 200 微升冰冷的 70% 分子级乙醇重悬沉淀，轻轻弹动混匀，进行第二次离心洗涤。

将沉淀重悬于200微升新鲜、冰冷的100%分子生物学级乙醇中。第三次离心后，将离心管水平放置于一张纸巾上，空气干燥5至10分钟。然后将DNA沉淀重悬于80微升低TE缓冲液中。

然后，使用分光光度计对重悬的DNA进行定量，并将剩余样品在4°C下保存。按照示范方法，将多达五只成年蚜虫在液氮中研磨破碎后，将样品转移至通风橱中，并向样品管中加入800微升异硫氰酸胍-酚-氯仿提取试剂。用研杵充分匀浆样品，并将匀浆液在室温下孵育5分钟。

接下来，向样品中加入 160 µL 氯仿，用手剧烈振荡 15 秒。然后在室温下孵育样品 2 至 3 分钟，并进行离心以收集提取的 RNA。为沉淀 RNA，将水相转移至新的无 RNase 的微量离心管中，注意不要扰动中间相，然后向 RNA 中加入 400 µL 异丙醇。

在负20摄氏度孵育10分钟后，通过离心收集沉淀的RNA。然后，用1毫升75%乙醇（溶于焦碳酸二乙酯处理的水中）洗涤样品两次，每次加入乙醇后轻轻涡旋混匀并离心，以去除任何苯酚污染物。第二次洗涤后，在无菌操作台中将沉淀物风干5至10分钟，随后用移液枪轻轻吹打，将RNA沉淀溶解于30 µL超纯水中，并在55至60摄氏度孵育10至15分钟。

种子生长到可以移栽的大小大约需要两到四周，具体时间取决于季节。移栽后的幼苗还需要再经过两到四周生长至适合进行蚜虫培养的最佳大小。成年 aye-near-ee-eye 个体可通过其深色的尾片（cauda）加以区分，其形态可能为无翅型或有翅型。

当若虫进入三龄阶段时，翅芽开始变得可见。单个成虫可提取约每微升100至200纳克的DNA和每微升150至300纳克的RNA。随后可计算候选基因在不同处理条件下的相对表达量。

在进行此操作时，重要的是不要污染您的同源克隆品系。同时，请记住蚜虫的质量在很大程度上取决于您所用植物的质量。完成本操作后，可进一步开展其他提取和测序技术，以探究蚜虫生物学背后分子机制的相关问题。