Name: 单液滴数字聚合酶链反应对热点地区突变的综合和同步检测 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 23 s
Description: 学习使用单液滴数字PCR技术检测循环肿瘤DNA中的多重基因突变。该方法可在单次反应中同步筛查KRAS和EGFR等热点区域的多种突变类型，实现绝对定量分析并节省珍贵样本。

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本工作由居里研究所SiRIC（资助号INCa-DGOS-4654）资助。&#160;作者还感谢Caroline Hego对本视频制作的贡献。

本方案遵循居里研究所的伦理准则。所有人体样本均来自在居里研究所机构审查委员会批准的研究项目中，经知情同意后入组的患者。
1. 血液采集、血浆储存及游离DNA提取
注意：可使用从任何类型“组织”中提取的 DNA（例如， 新鲜或甲醛固定石蜡包埋（FFPE）组织、培养细胞或血液样本。本文提供了血液采集、血浆分离与保存以及游离DNA（cfDNA）提取的详细操作步骤。
<ol>
	<li>血液采集与血浆储存图2B) 
	<ol>
		<li>使用7 mL EDTA管采集血样。建议采集两管，以获得约4 mL血浆。</li>
		<li>将离心管以820 x g离心10分钟 g 采血后3小时内分离红细胞（RBC）、白细胞（WBC）和血浆。采样至离心的时间间隔对于获得高质量的游离DNA（cfDNA）至关重要。即， cfDNA未被白细胞释放的DNA污染。</li>
		<li>使用1 mL移液器小心吸取上清液（血浆），避免接触白细胞层；通常每根EDTA管可回收约2 mL血浆。</li>
		<li>将血浆转移至2 mL离心管中，将等分试样在16,000 x g 在15 °C下离心10分钟以去除细胞碎片。</li>
		<li>小心吸取上清液（血浆），避免扰动沉淀物。将血浆分装至2 mL冻存管中，于-80 °C保存，直至使用。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>cfDNA 提取 (图2B) 
	注意：此处介绍的是使用手动提取试剂盒的操作流程。也可根据制造商说明书采用自动化方法进行cfDNA的提取。
	<ol>
		<li>将400 µL蛋白酶K加入50 mL离心管中。加入4 mL血浆（常规使用体积）和3.2 mL裂解缓冲液ACL（含1.0 µg载体RNA），均来自试剂盒。盖紧管盖，涡旋振荡30 s以获得均一溶液。在60 °C孵育30 min。</li>
		<li>向裂解液中加入7.2 mL缓冲液ACB（来自试剂盒），以优化循环核酸与硅胶膜的结合，涡旋混匀15–30秒。将离心管置于冰上孵育5分钟。</li>
		<li>将层析柱和20 mL洗脱液放入真空泵中。封闭未使用的孔位，以实现真空抽吸。</li>
		<li>小心地将裂解液-缓冲液ACB混合物加入到管状延伸器中（短暂离心以收集尽可能多的裂解液-缓冲液ACB混合物），开启真空泵，使裂解液完全通过柱子。移除并弃去管状延伸器。</li>
		<li>向柱中加入600 µL ACW1缓冲液。待ACW1缓冲液完全流经柱体后，加入750 µL ACW2缓冲液，最后加入750 µL乙醇（96–100%）。随后，将柱置于干净的2 mL收集管中，以最大速度（20,000 x g）3分钟，以去除乙醇。</li>
		<li>将柱子放入一个新的2 mL收集管中。打开管盖，在56 °C下孵育10 min，以彻底干燥膜。</li>
		<li>将柱子放入一个洁净的1.5 mL低吸附DNA管中。小心加入含0.04%叠氮化钠的36 µL无RN酶水（缓冲液AVE）。盖紧管盖，在室温下孵育3分钟。</li>
		<li>以最大速度（20,000 x g孵育1分钟以洗脱核酸，然后于-20 °C保存备用。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>cfDNA 定量 
	注意：在提取后或使用前于室温（RT）解冻样本后，应立即按照制造商的说明书，使用荧光计进行cfDNA定量。避免多次冻融循环。
	<ol>
		<li>根据预期的cfDNA含量选择高灵敏度检测方法，通常cfDNA含量低于100 ng/mL血浆。健康供体的cfDNA浓度范围为2–10 ng/mL，而在转移性疾病患者中可高达100 ng/mL。</li>
		<li>确保所有试剂均处于室温，每反应取199 µL荧光计稀释缓冲液与1 µL染料（200倍）混合（样本数N + 2个用于校准荧光计的标准品），配制成工作液。</li>
		<li>涡旋混匀cfDNA溶液以确保均匀性，并短暂离心以收集管底液体。</li>
		<li>将每份cfDNA样本各取5 µL与195 µL工作液混合。</li>
		<li>将每种标准品各10 µL与190 µL工作液混合。</li>
		<li>将所有试管充分涡旋振荡2–3秒以确保均匀，然后短暂离心，使管内液体全部收集至管底。</li>
		<li>室温避光孵育 2 分钟。</li>
		<li>使用荧光计的“ng/µL”输出模式读取各管样品</li>
		<li>按如下公式计算血浆中最终浓度（ng/mL）：ng/µL × 36（cfDNA 洗脱液体积）/ 4（提取血浆体积）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. ddPCR 探针和引物设计（图 2A）
注意：在drop-off ddPCR检测中，靶分子的扩增遵循与qPCR相似的原理。每个引物和探针均使用常规专用软件Primer37（http://primer3.ut.ee/）进行设计。
<ol>
	<li>引物设计
	<ol>
		<li>在常规设置窗口中，将“二价阳离子浓度”改为 3.8，“dNTP 浓度”改为 0.8，并将“错配/重复序列数据库”设置为正确的生物体。</li>
		<li>在高级设置窗口中，将“热力学参数表”和“盐浓度计算公式”均设为 Santa Lucia 1998。</li>
		<li>选择 Tm 在 55 至 70 °C 之间的引物（盐浓度设为 50 mM，寡核苷酸浓度设为 300 nM）。</li>
		<li>使用 PrimerBlast 等工具检查引物的特异性。</li>
		<li>避免选择具有二级结构的区域。</li>
		<li>选择 GC 含量为 50–60% 的序列。</li>
		<li>避免长度超过 3 个碱基的 G 或 C 重复序列。</li>
		<li>尽可能在引物的 3’ 端包含 G 或 C。</li>
		<li>确保成对引物的 3’ 端无显著互补性，以避免引物二聚体的形成。扩增子长度应小于 150 bp，以便高效扩增常发生断裂的 cfDNA（平均大小为 170 bp8）和从 FFPE 样本中提取的 DNA。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>探针设计 
	注意：水解探针在 5’ 端标记荧光报告基团，在 3’ 端标记淬灭基团。此类探针具有高特异性、高信噪比，并可根据需要实现多重检测。双通道液滴读取仪兼容 FAM 和 HEX 或 VIC 染料，也可用于分析 FAM/HEX 或 FAM/VIC 耦合的探针。
	<ol>
		<li>设计与目标区域的野生型（WT）序列及其相邻非变异区域互补的水解探针。</li>
		<li>选择的探针应完全位于先前设计的引物对所定义的扩增子区域内。探针序列不得与引物序列重叠，但可紧邻排列。</li>
		<li>选择 C 含量多于 G 的模板链。探针的 GC 含量应在 30–80% 之间。</li>
		<li>选择长度在 13 至 30 个核苷酸之间的探针。较长的探针往往背景荧光较高，因为荧光基团与淬灭基团之间的距离会影响荧光信号的淬灭效率。</li>
		<li>探针的 Tm 应比引物的 Tm 高 3 至 10 °C，以确保在引物退火和延伸过程中发生探针水解。建议使用 Tm 增强剂，在保持探针较短的同时达到所需的 Tm，因为较短的探针对单核苷酸变异的区分能力更强。探针的 5’ 端不应含有 G，因为即使在水解后，G 仍会淬灭荧光信号。</li>
		<li>按如下方式设计“下降型”探针：5’-(VIC)-突变区域的野生型互补序列-(MGB NFQ)-3’，参考探针设计为：5’-(6-FAM)-非变异区域的互补序列-(MGB NFQ)-3’。也可使用其他报告基团/淬灭基团组合。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 数字PCR反应的优化（图2A）
注意：本步骤中使用的野生型和突变型DNA对照可来源于细胞系、肿瘤样本或市售的DNA参考标准等。
<ol>
	<li>使用具有温度梯度功能的PCR仪进行常规PCR，以验证所设计引物扩增产物的特异性。
	<ol>
		<li>按照下文步骤4.1所述，为野生型DNA对照模板配制独特的PCR反应混合液（不含探针），至少进行8个反应，确保每个温度条件下至少有一个反应。</li>
		<li>使用步骤4.3.2中描述的程序，并在引物理论退火温度附近设置一系列退火温度进行扩增反应。</li>
		<li>将PCR产物上样至3%琼脂糖凝胶，以筛选可产生特异性产物的退火温度。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用上述参数进行一系列终点ddPCR，但此次同时包含两种探针。
	<ol>
		<li>使用100%野生型DNA、100%突变型DNA以及野生型与突变型DNA的混合物（例如， 50% 突变型/50% 野生型）以确定野生型与突变型液滴云清晰分离的最佳条件。</li>
		<li>选择一系列高于步骤4.1中选定温度的退火温度。</li>
		<li>选择退火温度时，应确保使用100% WT DNA或100% MUT DNA时能够特异性检测到WT或MUT信号，并实现WT与MUT液滴群的最佳分离。</li>
		<li>退火时间以及引物/探针浓度也可进行调整，以改善液滴群的分离效果，并减少具有中等荧光强度的液滴数量（雨滴效应）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>评估该检测方法的背景值或空白限（LOB）。
	<ol>
		<li>使用在3.2中选定的退火参数以及引物/探针浓度，对野生型对照DNA进行至少48个独立的液滴数字PCR（ddPCR）反应。</li>
		<li>对于每个反应，按如下方法计算突变等位基因频率（MAF）： （突变液滴数 / 已填充液滴数）× 100. 
		注意：LOB 定义为假阳性 MAF 的均值及其相应的标准差（SD），并据此计算 95% 置信区间（95% CI）。LOB =（假阳性 MAF 的均值）+ 95% CI。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>评估该检测方法的检出限（LOD）。
	<ol>
		<li>使用 MUT DNA 在 WT DNA 中进行系列稀释，进行降落式 ddPCR 反应，突变等位基因频率（MAF）范围为 5% 至 0.01%（每种条件至少 8 个重复）。采用 3.2 步骤中选定的退火参数以及引物/探针浓度。 
		注意：LOD 定义为重复样本的平均值和标准差均高于 LOB 的最小 MAF 值（参见 Decraene 等6 有关更多详细信息）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 数字滴落式PCR方案（图2B）
注意：与传统的数字滴定PCR（ddPCR）类似，drop-off ddPCR方案包含4个步骤：(i) PCR反应体系配制，(ii) 微滴生成，(iii) PCR扩增，以及(iv) 数据采集。
<ol>
	<li>PCR反应体系配制
	<ol>
		<li>遵循标准预防措施，例如佩戴手套、使用洁净的PCR操作台、洁净的移液器以及无RNase和DNase的蒸馏水，以避免污染。</li>
		<li>解冻反应组分并在室温下平衡。</li>
		<li>在蒸馏水中配制20倍引物/探针混合液，每种引物终浓度为18 µM，每种探针终浓度为5 µM。</li>
		<li>对于每个独立的PCR反应，通过混合2x ddPCR超级混合液（10 μL）、20x引物/探针混合液1 µL以及最多10 ng的DNA样本，制备样品混合液。 qsp 20 µL 蒸馏水。</li>
		<li>充分涡旋振荡反应混合物以确保均一性，分装前短暂离心使管内液体全部沉降至管底。每次使用反应混合物前，如有需要，可重复此步骤。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>液滴生成
	<ol>
		<li>将ddPCR芯片插入支架中，并向芯片中部的孔（芯片上的绿色位置）加入20 μL含有样品的反应混合液，用于生成液滴。 图2B使用8通道移液器。</li>
		<li>向底部孔（黄色位置）加入 70 μL 微滴发生油。</li>
		<li>将带有垫圈的 cartridge 插入液滴生成仪中；液滴将在 cartridge 的上部孔位（蓝色位置）中生成。</li>
		<li>从试剂盒中缓慢轻柔地吸取并分配40 μL液滴至96孔PCR板中（避免剪切）。使用多通道移液器以优化液滴转移。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>PCR扩增
	<ol>
		<li>使用铝箔立即密封最终的PCR板，以防止液滴转移后蒸发。短暂离心板子，使孔底聚集液体。</li>
		<li>使用以下程序在热循环仪上进行常规PCR扩增：95 °C 10 min，40个循环 [94 °C 30 s，经验证的退火温度 T° 60 s]，98 °C 10 min（升温速率2.5°C/s）。每次反应需设置无模板DNA的阴性对照和野生型DNA对照（≥3个重复）。</li>
		<li>运行结束后，短暂离心反应板，使孔内液体全部沉降至孔底。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>数据采集
	<ol>
		<li>PCR扩增后，按照制造商说明书使用液滴读取仪对PCR阳性与PCR阴性液滴进行计数。 
		注意：液滴读取仪通常配备双色光学检测系统，可兼容FAM、VIC或HEX荧光染料。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 数据分析（图2C 和 图3）
注意：通过计数PCR阳性与PCR阴性液滴，可对目标区域的突变型（MUT）和野生型（WT）等位基因进行绝对定量。利用已分类的液滴可计算每个孔中的突变等位基因频率（MAF）。液滴的定量及脱靶检测分析可使用Attali及其同事开发的ddPCR R软件包（https://github.com/daattali/ddpcr）进行9,10。该R软件包可自动将液滴分类为空液滴、“雨滴”（由扩增效率低下导致）或含有真实阳性信号的液滴（图3）。下文所述的分析步骤为该算法作者所撰写的说明性示例的简要版本（详见 https://github.com/daattali/ddpcr/blob/master/vignettes/algorithm.Rmd 以获取更多细节）。数据将以逗号分隔值文件（FileName_Amplitude.csv）导出，并上传至ddPCR软件包，可在R环境中或通过专用的网页界面直接进行分析。
<ol>
	<li>参数调整 
	注意：每次落点实验设计会产生特定的最终液滴分布，雾化形态、分离情况或位置出现差异属正常现象。为确保自动分析的高效性，需调整一组参数。若某孔的分布形态异常，可能导致整块板的分析失败，并出现错误提示。此时需识别出有问题的孔，并将其从自动分析中排除。
	<ol>
		<li>使用（REMOVE_FAILURES）识别失败的孔。通过 TOTAL_DROPS_T（默认值为 5,000）调整每个孔中液滴的最小数量。通过 EMPTY_LAMBDA_LOW_T（默认值为 0.3）和 EMPTY_LAMBDA_HIGH_T（默认值为 0.99）调整用于评估预期液滴云（空载、MUT、WT）及其质量的指标。 
		注意：空液滴过多表明反应中可扩增的模板量不足。</li>
		<li>使用（REMOVE_OUTLIERS）识别异常液滴。通过 TOP_PERCENT 参数（默认值为 p = 1%）调整整块板中每个信号维度（FAM、VIC/HEX）下信号值最高的前 p 百分比的液滴。通过 CUTOFF_IQR 参数（默认值为 5）调整该前 p 百分比最高信号液滴的异常值判定阈值。</li>
		<li>使用（REMOVE_EMPTY）识别空液滴。通过调整CUTOFF_SD参数（默认值为7），设定探针1信号值中较低端（空液滴）高斯分布的标准差。</li>
		<li>使用 (CLASSIFY) 对液滴进行门控。通过 CLUSTERS_BORDERS_NUM_SD（默认值为 3）调整 Probe 1 值中较高（填充液滴）高斯分布的标准差。通过 ADJUST_BW_MIN（默认值为 4）和 ADJUST_BW_MAX（默认值为 20）调整 k_min 和 k_max 参数，以估计 Probe 2 值的核密度，并区分突变型（MUT）和野生型（WT）液滴群。
		<ol>
			<li>使用 SIGNIFICANT_NEGATIVE_FREQ（默认值为 p=1%）和 SIGNIFICANT_P_VALUE（默认值为显著性水平 s=0.01%）将孔分类为突变型或野生型。 
			注：在本算法中，突变孔定义为具有统计学上显著高于 p% 的 MAF 的孔。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>自动化分析 
	注意：对于本节中列出的每个参数，ddPCR R 软件包的作者已根据其专业知识和数据提出了默认值。然而，所有参数均可进行调整，以提高分析质量图3).
	<ol>
		<li>识别失败的孔
		<ol>
			<li>使用四项质量控制指标（设置：REMOVE_FAILURES）来识别失败的孔；第一项指标为每个孔应包含的最低液滴数量。其余三项指标则用于识别空液滴、可能的FAM+液滴以及HEX+/VIC+液滴的有效候选群体。将未满足这些标准的孔从后续分析中剔除。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>识别异常液滴。
		<ol>
			<li>为避免液滴门控出现偏差，需去除异常值（即， 通过设置上限阈值（设置：REMOVE_OUTLIERS），将具有异常高 HEX/VIC 或 FAM 值的液滴排除在进一步分析之外。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>识别空液滴。
		<ol>
			<li>识别空液滴以降低数据维度（在典型的反应孔中，空液滴将占据大多数液滴），并消除由于大量无用信息存在而引起的统计偏差，仅保留含有模板的液滴（设置：REMOVE_EMPTY）。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>进行液滴分选。
		<ol>
			<li>将剩余液滴分类为突变型、野生型或无效液滴（设置：CLASSIFY）。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>识别雨滴。
		<ol>
			<li>由于雨滴状信号源于扩增效率低下，应将其从FAM+或HEX+/VIC+云团中排除。使用其Probe 1值确定其簇群边界（设置：CLUSTERS_BORDERS_NUM_SD）。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>区分突变型与野生型液滴。
		<ol>
			<li>由于分析的重点在于区分突变型与野生型模板，因此在此阶段将所有剩余的液滴识别为其中一种类型。由于它们的探针1值应相似，故应利用探针2的值来最优预测其各自类型（设置：ADJUST_BW_MIN 和 ADJUST_BW_MAX）。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>将孔分为突变型与野生型。
		<ol>
			<li>在确定哪些液滴为突变型（MUT）和野生型（WT）后，计算突变等位基因频率（MAF）。根据每个孔的突变频率及其对应的p值，可对各孔进行分类（设置：SIGNIFICANT_NEGATIVE_FREQ，SIGNIFICANT_P_VALUE），将其判定为野生型孔（主要含有WT液滴）或突变型孔（含有统计学上显著数量的MUT液滴）。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>探索并导出数据
	<ol>
		<li>以液滴数量、离群值、空液滴、浓度或图表等形式探索并导出数据，图表可进一步自定义以实现最佳呈现效果。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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<li>Forbes, S. A., Beare, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((COSMIC%3A+somatic+cancer+genetics+at+high-resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">COSMIC: somatic cancer genetics at high-resolution.</a> Nucleic Acids Research. 45 (D1), D777-D783 (2017).</li>
</ol>

多名作者是两项与ctDNA检测相关的专利申请（EP17305920.5，EP18305277.8）的发明人。

为了设计高效的drop-off数字PCR（ddPCR）检测方法，优化至关重要，且必须严格遵循实验方案。每一对引物和探针组合都具有独特的PCR反应效率，因此在将检测方法应用于珍贵的测试样本之前，必须先在对照样本上对其进行仔细验证。优化和验证对于确保达到最佳信号检测、评估特异性和灵敏度非常重要。如实验方案所述，位于&#34;probe 2&#34;覆盖的目标区域内的所有突变均有可能被检测。然而，对于位于&#34;probe 2&#34; 5'端或3'端的突变，建议进行额外验证，因为这些位置的突变可能会影响drop-off检测的效率。
本文所述方法可用于从任何类型的&#34;组织&#34;中提取的DNA，包括FFPE组织、培养细胞或血液样本。然而，核酸提取的质量会显著影响ddPCR结果。在采样和纯化步骤中，必须尽可能去除肝素、蛋白质、血红素、苯酚、蛋白酶、胶原蛋白、黑色素、去垢剂或盐类等PCR抑制物。尽管可通过稀释DNA样本以降低PCR抑制物对ddPCR的影响，但稀释会降低检测灵敏度，因为每个反应中检测的目标拷贝数将减少。当需要达到特定灵敏度水平时，应考虑这一点，因为必须检测最低数量的拷...

已报道了数千种与癌症发展相关的体细胞突变1其中，少数是靶向治疗疗效的预测性标志物 2,3 这些突变的基因检测现已成为常规临床实践。微滴数字PCR（ddPCR）技术可用于高精度检测突变的存在或缺失，且与无创液体活检具有高度兼容性。4,5然而，目前的数字滴液聚合酶链式反应（ddPCR）检测主要设计用于检测已知突变 先验的这严重限制了在突变未知时将ddPCR用作发现工具的应用。事实上，在传统的ddPCR设计中，识别野生型等位基因的水解探针（WT探针）与识别突变型等位基因的特异性探针（MUT探针）相互竞争。图1A）。亲和力较高的探针与模板杂交并释放其荧光团，从而指示相应等位基因的性质。每个液滴获得的荧光数据可在散点图中可视化，分别以不同维度表示野生型（WT）和突变型（MUT）探针发出的荧光。图中展示了常规数字液滴PCR（ddPCR）检测的典型结果示意图。 图1A在此示例中，蓝色云团对应于由野生型（WT）探针识别出的含有野生型等位基因的液滴，而红色云团对应于由突变型（MUT）探针扩增并识别出的含有突变型等位基因的液滴。根据反应中加入的DNA量，可能同时出现含有野生型和突变型扩增子的双阳性液滴（绿色云团）。浅灰色云团对应于空液滴。
由于大多数平台仅能检测有限数量的荧光染料（通常为2种，最多5种），常规数字滴式PCR（ddPCR）的通量受到限制。因此，针对含有多个相邻突变区域的检测需要设计技术上较复杂的多重ddPCR实验，或采用多个平行反应分别靶向各个突变。drop-off ddPCR策略克服了这一局限性，其可通过一对独特的野生型（WT）水解探针，潜在地检测目标区域内任何类型的遗传变异。其中，第一探针（Probe 1）覆盖紧邻目标区域的非变异序列，第二探针（Probe 2）则与目标区域的野生型序列互补，该区域为预期发生突变的位置图1B）。第一个探针用于定量反应中可扩增分子的总量，第二个探针则通过与突变序列的次优杂交来区分野生型（WT）和突变型（MUT）等位基因。探针2可识别目标区域内的多种突变类型（单个或多个核苷酸替换、缺失、 等等。)6与传统的数字滴定PCR（ddPCR）一样，浅灰色云团代表不含DNA分子的液滴。需要牢记的是，在此类检测中，野生型（WT）和突变型（MUT）云团的理想分离程度取决于反应体系中加入的DNA量，因为同时含有WT和MUT靶标等位基因的液滴无法与仅含WT形式的液滴区分开来。因此，该检测要求大多数液滴中所含的目标基因拷贝数不超过一个。

<table><tbody><tr><td>K2EDTA 管（颜色编码：淡紫色）</td><td>BD</td><td>367863</td><td>EDTA 管用于获取全血或 EDTA 血浆样本</td></tr><tr><td>QIAamp 循环核酸提取试剂盒（手动操作方案）</td><td>Qiagen</td><td>55114</td><td>用于从人血浆中分离游离循环 DNA</td></tr><tr><td>QIAsymphony DSP 循环 DNA 试剂盒（自动化操作方案）</td><td>Qiagen</td><td>937556</td><td>用于从人血浆中分离游离循环 DNA</td></tr><tr><td>QIAsymphony SP 系统</td><td>Qiagen</td><td>9001297</td><td>用于 cfDNA、DNA 或 RNA 纯化的完全集成化和自动化系统</td></tr><tr><td>QIAvac 24 Plus</td><td>Qiagen</td><td>19413</td><td>可同时纯化多达 24 个 cfDNA 样本</td></tr><tr><td>Qubit 荧光仪</td><td>Invitrogen</td><td>Q33226</td><td>Qubit 荧光仪是一种台式荧光仪，用于 DNA 定量</td></tr><tr><td>QX100 或 QX200 读取仪</td><td>Bio-Rad</td><td>186-3003 或 186-4003，分别对应</td><td>读取仪在液滴通过检测器时测量每个液滴的荧光强度，并检测其大小和形状</td></tr><tr><td>QX100 或 QX200 液滴生成仪</td><td>Bio-Rad</td><td>186-3002 或 186-4002，分别对应</td><td>用于生成液滴的仪器</td></tr><tr><td>C1000 梯度 PCR 仪</td><td>Bio-Rad</td><td>1851196</td><td>模块化热循环仪平台，包含 C1000 Touch 热循环仪主机和 96 孔快速反应模块</td></tr><tr><td>PCR 板封膜机</td><td>Bio-Rad</td><td>181-4000</td><td>PX1&amp;trade; PCR 板封膜机</td></tr><tr><td>DG8 卡盒支架</td><td>Bio-Rad</td><td>186-3051</td><td>用于在仪器中定位并固定 DG8 卡盒以进行液滴生成</td></tr><tr><td>液滴生成卡盒及垫圈</td><td>Bio-Rad</td><td>186-4007</td><td>微流控 DG8 卡盒用于混合样本与油相以生成液滴；DG8 垫圈用于密封卡盒，防止蒸发并施加液滴形成所需的压力</td></tr><tr><td>PCR 超混合液</td><td>Bio-Rad</td><td>186-3010</td><td>适用于探针的 ddPCR 超混合液（不含 dUTP）</td></tr><tr><td>96 孔 PCR 板</td><td>Eppendorf</td><td>951020362</td><td>96 孔半裙边板</td></tr><tr><td>铝箔封膜</td><td>Bio-Rad</td><td>181-4040</td><td>可穿刺热封铝箔膜</td></tr><tr><td>ddPCR 液滴读取油</td><td>Bio-Rad</td><td>186-3004</td><td>读取过程中使用的油</td></tr><tr><td>探针用液滴生成油</td><td>Bio-Rad</td><td>186-3005</td><td>用于液滴生成的油</td></tr><tr><td>DNA LoBind 管 1.5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>0030 108.051</td><td>Eppendorf LoBind 管通过显著减少样本与管壁的结合，最大化样本回收率</td></tr><tr><td>多重 I 型 cfDNA 参考标准品套装</td><td>HORIZON</td><td>HD780</td><td>多重 I 型 cfDNA 参考标准品是经过高度表征、具有生物学相关性的参考材料，用于评估检测体细胞突变的 cfDNA 检测方法的性能</td></tr><tr><td>QUBIT DSDNA HS 检测试剂盒，500</td><td>Life Technologies</td><td>Q32854</td><td>HS 检测法对双链 DNA（dsDNA）具有高度选择性，优于 RNA，并设计用于初始样本浓度在 10 pg/&amp;micro;L 至 100 ng/&amp;micro;L 范围内的准确检测</td></tr><tr><td>Qubit 检测管</td><td>Life Technologies</td><td>Q32856</td><td>Qubit 检测管为 500 &amp;micro;L 薄壁聚丙烯管，专用于 Qubit 荧光仪</td></tr></tbody></table>

单液滴数字聚合酶链式反应用于热点区域突变的全面同步检测

Single Droplet Digital Polymerase Chain Reaction for Comprehensive and Simultaneous Detection of Mutations in Hotspot Regions

微滴数字聚合酶链式反应（ddPCR）是一种高灵敏度的定量聚合酶链式反应（PCR）技术，其原理是将样本分割成数千个纳米级的油包水独立反应单元。近年来，ddPCR 已成为循环肿瘤 DNA（ctDNA）检测中最准确且最敏感的工具之一。标准 ddPCR 技术的主要局限性在于每反应所能筛查的突变数量有限，因为需要针对每种可能的等位基因版本设计特异性的水解探针。一种替代方法——drop-off ddPCR 技术可提高检测通量，因其仅需一对探针即可检测和定量目标区域内可能存在的全部遗传变异。drop-off ddPCR 的灵敏度与传统 ddPCR 相当，且具有在单次反应中检测更多突变的优势。该方法成本效益高，节省珍贵的样本材料，且在突变位点未知时亦可作为发现工具使用 先验的.

在一项概念验证研究中，采用降落式数字PCR（drop-off ddPCR）策略，对癌症患者的福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织和血浆样本中的KRAS外显子2突变（密码子12和13）以及EGFR外显子19缺失进行了检测6。
KRAS 降落探针检测了 KRAS 基因第2号外显子中一个包含多个突变的16 bp区域，该区域涵盖了人类癌症中95%以上的已知 KRAS 突变11。参考探针长度为20 bp，位于下游3 bp处。为了优化我们的检测方法，我们使用了来自含有两种最常见的 KRAS 突变氨基酸的细胞系中提取的DNA：G12V（c.35GT，SW480）和 G13D（c.38GA，HCT 116）。
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本文介绍一种利用液滴式数字PCR（drop-off ddPCR）和一对独特的水解探针，在单次反应中精确定量目标区域多种基因改变的实验方案。

微滴数字聚合酶链式反应（ddPCR）是一种基于样本分液的高灵敏度定量聚合酶链式反应（PCR）方法……

该方法可作为癌症诊断工具，用于分析循环肿瘤DNA。该技术可在单次反应中检测多个基因区域的聚集性突变。这有助于节省宝贵的患者样本。该方法可提供关于肿瘤负荷及其突变谱的信息。现在还可将其应用于分子分析，作为qPCR的替代方法，以实现对核酸靶序列的绝对定量。使用七毫升EDTA管采集血液样本。建议使用两支试管采集约四毫升血浆。采血后三小时内，以820 × g离心10分钟，分离红细胞、白细胞和血浆。采样与离心之间的时间至关重要，以获得高质量且无白细胞DNA污染的无T细胞DNA。离心后，使用刻度移液管收集上清液，注意不要触碰白细胞层。通常每根EDTA管可回收约2毫升血浆。将血浆转移至2毫升离心管后，在15°C条件下以16,000 × g离心10分钟，以去除细胞碎片。小心收集血浆，避免扰动沉淀物，并转移至2毫升冻存管中。于-80摄氏度保存，直至使用。首先，向50毫升离心管中加入400微升蛋白酶K。然后，加入 4 毫升血浆和 3.2 毫升含有提取试剂盒中 1 微克载体 RNA 的 ACL 裂解缓冲液。盖紧管盖，涡旋振荡 30 秒以获得均一溶液。随后，在 60 摄氏度下孵育 30 分钟。孵育后，向裂解液中加入 7.2 毫升 ACB 缓冲液，以优化循环核酸与硅胶膜的结合。涡旋振荡 15 至 30 秒进行混匀。然后将离心管置于冰上孵育 5 分钟。将层析柱和20毫升扩展管连接到真空泵上。封闭未使用的部分以实现真空抽吸。短暂离心试管后，小心地将混合物加入到管扩展管中。然后打开真空泵，使裂解液完全通过柱子。取下并弃去管延长器。接着，向柱子中加入600微升ACW1缓冲液。当缓冲液 ACW1 完全流过柱子后，加入 750 微升 ACW2 缓冲液，最后加入 750 微升 96% 至 100% 的乙醇。然后将柱子放入一个干净的 2 毫升收集管中，以最大速度离心 3 分钟，以彻底去除乙醇。将柱子转移至一个新的 2 毫升收集管后，打开管盖，并在 56 摄氏度下孵育 10 分钟，以完全干燥膜。 孵育结束后，将柱子放入一个干净的1.5毫升低吸附离心管中。小心加入含有0.04%叠氮化钠的36微升无RN酶水。然后盖上管盖，在室温下孵育3分钟。再次以最高速度离心一分钟，以洗脱核酸。然后在需要前于负20摄氏度保存。首先，在洁净的PCR操作台中将反应组分解冻并平衡至室温。然后，用无RNase和DNase的去离子水配制引物和探针的20倍混合液，每种引物终浓度为18微摩尔，每种探针终浓度为5微摩尔。对于每个单独的PCR反应，通过混合10微升2倍ddPCR Supermix、1微升20倍引物和探针混合液，以及最多10纳克的DNA样本至20微升去离子水中，来配制样品混合液。充分涡旋振荡反应混合物，以确保均匀。短暂离心以将管内液体收集至管底，再进行分装。将ddPCR芯片插入支架中，并向芯片的中间孔加入20微升样品反应混合液以生成液滴。向底部孔中加入70微升液滴生成油。将带有垫圈的 cartridge 插入液滴生成仪中。液滴将在 cartridge 的上部孔中生成。缓慢而轻柔地从 cartridge 中吸取 40 微升液滴，并转移至 96 孔 PCR 板中。将液滴转移至最终的PCR板后，立即使用铝箔和板封仪密封，以防止蒸发。短暂离心PCR板，使孔内液体沉降至孔底。在热循环仪上进行常规PCR扩增。当运行结束后，短暂离心反应板，使各孔中的内容物沉降至孔底。PCR扩增后，按照制造商说明书使用液滴读取仪对PCR阳性液滴和PCR阴性液滴进行计数。以下是液滴式数字PCR（drop-off ddPCR）检测方法优化过程中获得的代表性结果。该图像显示了在含有100%突变型DNA、5%突变型DNA和100%野生型DNA的反应中对突变型DNA和野生型DNA的检测结果。该图像展示了使用KRAS和EGFR drop-off ddPCR检测方法分析血浆样本的实例，结果显示了KRAS第二外显子中单核苷酸及多个碱基替换的检出，以及EGFR第19外显子缺失的检出。在进行该实验操作时，需在每一步骤中谨慎操作，尤其需特别注意液滴生成步骤，因为这是该方法的关键环节。该技术问世后，为癌症研究领域的科研人员和临床医生利用液体活检优化肿瘤突变分析开辟了道路。

single-droplet-digital-polymerase-chain-reaction-for-comprehensive

Research

科研

JoVE Journal

Genetics

遗传学

单液滴数字聚合酶链反应对热点地区突变的综合和同步检测

在本视频中，我们介绍了一种逐步生成乳化纳米液滴的实验方法，用于通过数字聚合酶链式反应（dPCR）检测目标核酸。...

微滴数字聚合酶链式反应：一种生成纳米微滴PCR反应以检测稀有肿瘤突变的方法

本视频展示了数字滴液聚合酶链式反应在鉴定DNA样本中插入缺失突变（indel突变）中的作用。ddPCR具有高精度和高灵敏度，能够准确且一致地检测样本中罕见的突变，即使其含量极低也能识别。该技术可鉴定并定量基因组不同区域中的插入缺失突变，为突变机制及其功能影响提供重要见解。...

用于靶基因中插入缺失突变检测的数字滴定聚合酶链式反应

在本视频中，我们演示双通道数字PCR（ddPCR）技术——这是传统PCR技术的一种改进方法，可用于同时检测两种不同的遗传标志物。单个PCR反应被分割成纳升级大小的乳化液滴，每个液滴独立进行扩增，通过检测部分液滴中不同颜色的荧光扩增信号，计算出目标序列的初始浓度。...

双重数字PCR同时定量双基因标志物

本视频展示了多重液滴式聚合酶链式反应技术，用于同时定量不同白细胞群体中的甲基化DNA区域，作为临床诊断和预后的早期生物标志物。...

多重液滴聚合酶链式反应检测白细胞DNA甲基化

本视频展示了采用管中芯片形式的数字PCR在检测DNA样本中单核苷酸变异方面的应用价值。单个PCR反应被分配至多个反应腔室中，每个腔室相当于独立的PCR反应单元，通过检测目标扩增后在各腔室中产生的荧光信号，可计算出样本中变异等位基因的频率。...

基于管中芯片的数字PCR用于单核苷酸变异的定量分析

野生型阻断PCR结合直接测序法是一种高灵敏度的检测方法，可用于多种样本类型中低频体细胞突变的检测。...

野生型阻断PCR联合直接测序作为一种高灵敏度检测低频体细胞突变的方法

数字聚合酶链式反应（PCR）是一种用于高灵敏度检测单核苷酸变异和DNA拷贝数变异的有效工具。本文以管中芯片格式的数字PCR为例，展示利用该技术检测人类基因组中稀有变异时需考虑的关键因素。...

采用管中芯片格式对散发性家族性腺瘤性息肉病患者进行遗传变异数字聚合酶链式反应检测

本文介绍了一种检测患者生物流体（生物液体）中循环DNA内肿瘤体细胞突变的实验方案。我们基于微滴数字聚合酶链式反应（dPCR）的方法可定量检测肿瘤突变的等位基因频率（MAF），为肿瘤的诊断以及对肿瘤治疗反应的时序性监测提供一种微创的补充手段。...

患者生物流体中肿瘤相关循环DNA的检测与监测

本文介绍了基于Sanger测序的低频突变检测方法在血管免疫母细胞性淋巴瘤中的应用，为将该方法应用于其他疾病提供了依据。...

野生型阻断PCR联合Sanger测序法检测低频体细胞突变

本文描述了一种通过液相色谱/质谱法改进的聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性方法，用于河豚物种的基因分型。该方法采用反相硅胶整体柱分离经酶切后的扩增产物。此技术可解析寡核苷酸的单一同位素质量，有助于碱基组成的鉴定。...

通过液相色谱/质谱法改进河豚毒素鱼类的聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性基因分型

学习使用单液滴数字PCR技术检测循环肿瘤DNA中的多重基因突变。该方法可在单次反应中同步筛查KRAS和EGFR等热点区域的多种突变类型，实现绝对定量分析并节省珍贵样本。

单液滴数字聚合酶链式反应用于热点区域突变的全面同步检测

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