Name: 利用生物测定引导分馏法鉴定海洋鳗信息素 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 35 s
Description: 学习利用生物测定引导分馏法鉴定海洋鳗信息素，通过固相萃取和旋转蒸发分离化合物，结合电嗅觉图记录和行为分析表征其嗅觉效价。该方法将新型化合物与信息素功能联系起来，为化学生态学研究提供重要工具。

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感谢美国地质调查局哈蒙德湾生物站提供研究设施，以及美国鱼类和野生动物管理局和加拿大渔业与海洋部工作人员提供七鳃鳗。本研究由五大湖渔业委员会向 Weiming Li 和 Ke Li 提供的资助项目支持。

本文所述所有方法均已获得密歇根州立大学机构动物护理和使用委员会的批准（批准编号：AUF# 03/14-054-00 和 02/17-031-00）。
1. 七鳃鳗条件水的收集与提取
<ol>
	<li>将性成熟的雄性海七鳃鳗（15–30 条）置于装有 250 L 曝气的休伦湖水的水箱中，水温维持在 16– 18 °C.</li>
	<li>从6月到7月的每个夜晚收集雄性条件化水。 
	注意：七鳃鳗在产卵后会自然死亡。如果某条鱼已接近其生命终点，请更换为一条新鲜的性成熟雄鱼。</li>
	<li>通过固相萃取法提取条件培养基中的水样。
	<ol>
		<li>将树脂在甲醇中浸泡4小时，然后装入层析柱。将树脂装入层析柱后，用泵将10 L水通过层析柱，以去除有机溶剂。</li>
		<li>将饲养鱼类的水箱中的培养水进行过滤 通过 将泵送系统连接至柱的顶部。水样流经装有2 kg中等极性聚合物离子交换树脂的树脂床。例如.，Amberlite XAD-7 HP 树脂）装入一系列四个容量为 2.5 L 的玻璃柱中。保持上样速度在 400 至 600 mL/6 min 之间。先用 10 L 甲醇洗脱代谢物，紧接着用 5 L 丙酮洗脱。 
		警告：此步骤使用甲醇和丙酮。两者均易燃且有毒。 
		注意：混合后的残余物可保存在 -80 °C 直至进一步处理。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在富集1周后，用水（约10 L）冲洗柱子以重新激活。</li>
	<li>去除有机溶剂（甲醇与水的混合液），在减压（低于300 mbar）条件下，于旋转蒸发仪中蒸发5小时，收集提取物 40 °C. 用冷冻干燥机冻干浓缩水相残余物，-80 °C条件下持续48 h20 °C 直至干燥。</li>
</ol>
2. 通过色谱法分离组分馏分
<ol>
	<li>将硅胶（230 - 400 目）用初始流动相浸泡 30 分钟。将含溶剂的硅胶（悬浮液）转移至玻璃层析柱中。打开层析柱阀门，使流动相流过。待硅胶沉淀并形成硅胶床。</li>
	<li>将提取物与硅胶（70 - 230 目）充分混合，加样至液相色谱柱中硅胶床上方。用体积总量为 2.5 L 的洗脱梯度从 95% CHCl3（氯仿）/MeOH（甲醇）逐步过渡至 100% MeOH 进行洗脱。将洗脱液分别收集于各个小瓶中（每瓶 10 ml）。 
	注意：此步骤中使用的氯仿为有毒试剂。</li>
	<li>通过薄层色谱（TLC）分析指导将洗脱液合并为 20 个组分。
	<ol>
		<li>在预涂硅胶板上进行薄层色谱实验，将样品点于起始线处，并将板的起始线浸入展开剂中（在密闭玻璃缸内，通过调节 CHCl3 与甲醇的比例从 100% 至 0% 选择极性）。</li>
		<li>选择合适的展开剂比例，使所有 TLC 斑点的比移值（Rf）在 0.3 - 0.8 范围内。</li>
		<li>当展开剂迁移至终点线时，取出薄层板，静置 10 分钟使溶剂挥发。</li>
		<li>先在 254 nm 紫外光下观察斑点，然后使用色谱喷雾器喷洒含 5% 茴香醛（20 μL）的酸性甲醇溶液显色，并在 85 °C 加热 3 分钟。 
		注：TLC 板上出现的有色斑点表示该组分中的主要成分。</li>
		<li>根据主要成分的斑点颜色及其 Rf 值的相似性，将洗脱液合并为 20 个组分。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在减压条件下（根据溶剂性质设定为 300 mbar），于 40 °C 下旋转蒸发约 30 分钟，将组分浓缩至干。</li>
</ol>
3. 电嗅觉图（EOG）记录以鉴定有气味的组分/化合物
<ol>
	<li>使用拉管仪将硼硅酸盐玻璃毛细管（外径：1.5 mm；内径：0.86 mm；长度：100 mm）拉制成微电极，加热器设定水平为65。</li>
	<li>用金刚石尖玻璃切割器在毛细管尖端划痕并切割开口，随后用熔化的含0.9%氯化钠的0.4%琼脂填充。毛细管尖端的开口直径应约为 10 µm 直径。</li>
	<li>从步骤 3.1 - 3.2 制备的拉制毛细管电极以及预装有 Ag/AgCl 颗粒的固态电极支架中填充 材料表使用微量移液器用 3 M KCl 进行填充。 
	注意：清除毛细管或电极夹持器中的任何气泡。</li>
	<li>将拉制好的电极插入电极夹持器中。</li>
	<li>配制 100 mL 的 10-5 M L-精氨酸溶于经活性炭过滤的水中，来自10-2 M L-精氨酸储备液，溶于去离子水（储存于 4 °C) 于容量瓶中。移取 20 mL 的 10-5 将 M L-精氨酸加入玻璃小瓶中。</li>
	<li>为绘制浓度-反应曲线，用玻璃小瓶配制步骤2.3所得组分混合物的10倍系列稀释液，每种10 mL。实验前每日新鲜配制稀释液，并在当日内使用完毕。将L-arginine工作溶液和组分混合物稀释液的玻璃小瓶置于循环水浴中，使温度平衡至 8 °C.</li>
	<li>用3-氨基苯甲酸乙酯（MS222；100 mg/L）麻醉七鳃鳗，并使用无菌注射器通过肌肉注射给予三碘季胺酚（3 mg/kg体重，溶于0.9%生理盐水）以固定动物。 
	注意：足够的麻醉深度通过观察鳃部无运动、无法维持直立姿势，以及口盘无法吸附在容器壁上进行判断。为尽量减少手术前后及手术过程中的微生物污染，操作时应佩戴无菌手套，并将解剖器械在去离子水中配制的70%乙醇（v:v）中浸泡至少10分钟后再使用。</li>
	<li>将麻醉后的七鳃鳗置于V形支架中，并用湿润的纸巾包裹以防止干燥。 
	注意：不要堵塞鳃孔。</li>
	<li>将一根装有含50 mg/L MS222的循环曝气水的管子插入口腔腔内，调节流速，并确保有水流流出 通过 鳃孔持续灌注鳃部。</li>
	<li>使用无菌手术刀和镊子（在体视显微镜下以1.25倍放大倍数操作（参见 材料表)] 以移除 5 mm2 切开嗅囊表面的皮肤部分以暴露嗅上皮。</li>
	<li>用过滤水冲洗气味递送管路，并将其连接至安装在显微操作器上的阀门。使用显微操作器将气味递送毛细管插入嗅上皮腔内，向嗅上皮递送过滤水，以在不施加气味物质时防止组织干燥。</li>
	<li>将记录电极和参考电极安装在显微操作器上。将参考电极降至鼻孔附近体表皮肤处。在体视显微镜（1.25倍）下， lowering 记录电极至刚好接触嗅上皮表面。</li>
	<li>将气味物质递送管从背景过滤水中转移至10-5 M L-精氨酸溶液</li>
	<li>打开计算机、放大器（设置为直流模式）、滤波器和数字转换器。使用阀驱动软件，通过勾选 T1 框、将 T 设置为 4 s 并勾选 T2 框，编程设定程序以施加持续 4 秒的单一气味刺激脉冲。</li>
	<li>在数据采集软件中（参见 材料表），将采集模式设置为高速示波器模式，单击播放图标，然后单击 开始 在阀门驱动器中触发气味脉冲。 
	注意：数据采集软件会自动记录20秒内的差分EOG反应幅度（气味脉冲前3秒、脉冲期间4秒及脉冲后13秒）。使用显微操作器调整记录电极、参考电极或气味递送管的位置，以提高信噪比，使对L-精氨酸标准品的反应达到最大，而对空白对照（过滤水）的反应最小。在移动电极时，将交流-直流放大器开关切换至GND以接地放大器。</li>
	<li>开始记录空白对照、L-精氨酸，然后按步骤3.6配制的气味物质，从低浓度到高浓度依次进行，每次施加之间用过滤水冲洗2分钟。</li>
	<li>记录完所有待测气味物质的反应后，将放大器接地，并小心回撤电极和气味递送毛细管。根据机构动物护理与使用委员会（IACUC）批准的方法，在EOG实验结束时，使用过量MS222（1 g/L）处死已麻醉的七鳃鳗。 
	注意：通过观察至少5分钟无鳃部运动和心跳，确认安乐死后，再进行脑部毁髓。</li>
	<li>使用分析软件对数据进行分析和绘图。确定气味物质的检出阈值22 用于鉴定引起嗅觉反应超过空白水对照的有气味组分。随后，将引起与空白水对照不同的浓度依赖性嗅觉反应的组分混合物用于行为学实验（步骤4）。</li>
</ol>
4. 用于鉴定行为活性组分/化合物的双选择迷宫行为生物测定法
<ol>
	<li>将性成熟的雌性海七鳃鳗放入迷宫中的释放笼内进行适应（参见 补充图1）5 分钟。保持迷宫中河水的流速 
	注意：迷宫由涂有清漆的船用级木材制成，长6.5 m，宽1.2 m，在上游端设有长2.7 m的隔板，将迷宫分为两个通道。水流被临时导入迷宫中，水深应保持在0.19 m，流速应维持在0.07 m/s ± 0.01。</li>
	<li>释放七鳃鳗，并记录七鳃鳗在实验通道和对照通道中各自停留的累计时间，每个通道均含有河水，观察时间为10分钟。 
	注意：如果七鳃鳗在此10分钟期间未能进入实验通道和对照通道至少10秒，则终止该次试验，因为这表明其处于不活跃状态或存在强烈的侧向偏好。</li>
	<li>施加测试刺激（即，一种假定的信息素，浓度为10-12 将50%甲醇/去离子水溶液中的M（浓度为M）以200 mL/min的恒定流速，通过蠕动泵加入随机分配的实验通道，同时将溶剂对照（50%甲醇/去离子水）以相同流速加入对照通道，持续5分钟。 
	注意：行为学测试的初始浓度应采用电嗅觉图记录所确定的测试刺激物的检测阈值浓度。</li>
	<li>施加测试刺激和对照溶剂额外10分钟，记录七鳃鳗在实验通道和对照通道中停留的累计时间。</li>
	<li>每次试验开始前，用水冲洗迷宫10分钟。若有充足的测试刺激物，重复步骤4.1至4.4，至少使用7条七鳃鳗。</li>
	<li>计算偏好指数22 每次试验均进行评估，并使用Wilcoxon符号秩检验评价其显著性。 
	注意：偏好指数的结果为一个单一数值，可为正值或负值。偏好指数为正值表示具有吸引力，而为负值则表示具有排斥性。若偏好指数与零相比具有显著差异，则认为该组分具有活性。 
	<img alt="偏好指数公式；用于统计分析中计算偏好的图示方程。" src="/files/ftp_upload/58059/58059eq1v2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="方程"> 
	此处， 
	Bc = 七鳃鳗在施加气味物质前于对照通道中停留的时间， 
	Be = 在施加气味物质前停留在实验通道中的时间， 
	Ac = 气味物质施加后在对照通道中停留的时间，以及 
	Ae = 应用气味物质后在实验通道中停留的时间。</li>
</ol>
5. 从活性组分中通过色谱法分离纯化合物
<ol>
	<li>对能够引发嗅觉反应（步骤3）并诱发行为反应（步骤4）的组分池，重复执行步骤2.1至2.4。</li>
	<li>使用Sephadex LH-20柱通过尺寸排阻色谱法进一步将活性组分纯化为单个化合物。
	<ol>
		<li>将样品用0.5 mL初始流动相[CHCl3-MeOH (1:1) 或 MeOH 100%]溶解，依次上样至CHCl3-MeOH (1:1)柱和MeOH (100%)柱，并进行洗脱以获得化合物。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. 利用质谱法（MS）和核磁共振（NMR）对纯净化合物进行结构解析
<ol>
	<li>将纯化后的化合物溶解并用高效液相色谱（HPLC）的初始流动相（通常为甲醇:水 = 1:1，v:v）稀释，配制成约 1 μg/mL 的 10 μL 溶液。
	<ol>
		<li>将样品溶液转移至 HPLC 小瓶中，并放入 HPLC 自动进样器。进样 10 μL 至电喷雾离子化质谱（ESIMS），使用色谱-质谱联用仪记录高分辨电喷雾离子化质谱（HRESIMS）图谱23。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>根据质谱仪软件中的数据库预测分子式（参见材料表）24。
	<ol>
		<li>打开进样样品的色谱图，通过选择色谱峰获得其质谱图。</li>
		<li>在工具模块下的元素组成中输入测得的质荷比（m/z）值（保留四位小数），并将容差参数设置为 PPM &lt; 5。</li>
		<li>调整元素符号参数以匹配所测分子的元素组成。软件将基于单次质谱分析结果预测分子式。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>根据实验方案25选择氘代溶剂（600 μL，CH3OH-d4 或 DMSO-d6）溶解样品。
	<ol>
		<li>将样品完全溶解于所选氘代溶剂中，配制成浓度约为 0.1 至 10 mg/mL 的溶液。将样品溶液转移至核磁共振（NMR）样品管中，在 900 MHz NMR 谱仪上记录一维（1H、13C）和二维 NMR 谱图 [1H-1H 相关谱（COSY）、异核单量子相干谱（HSQC）、异核多键相关谱（HMBC）]26。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将装有样品的 NMR 样品管放入涡轮气流旋转器中。使用深度规确保样品高度位于检测窗口的中央。打开 NMR 软件（参见材料表），点击提升按钮以将样品送入磁体。
	 
	注意：将手置于磁体顶部以感受从磁体顶部流出的气体，同时应能听到轻微的哨音。</li>
	<li>轻柔地将样品放置在磁体顶部的气垫上，再次按下提升按钮，使样品下降进入 NMR 磁体中。
	 
	注意：注意听“咔哒”声，以确认样品已到达正确位置。</li>
	<li>创建新的数据集，并加载 NMR 仪器推荐的默认参数（参见材料表）。
	<ol>
		<li>输入“lock”以启动自动锁场程序，并在提示页面选择溶剂。</li>
		<li>进行精细调节时，在操作面板中调整解锁模式下的按钮，移动操作面板上的光标，然后再次锁定磁体。</li>
		<li>在提示的Atma页面中，调整操作面板中的参数以进行调谐，该过程可能需要几分钟。等待调谐完成后继续下一步。</li>
		<li>在命令行输入“topshim”以启动自动匀场程序。等待匀场完成后继续下一步。</li>
		<li>输入“rga”以设置自动接收增益调整，然后输入“d1”设置脉冲间延迟，再输入“zg”开始数据采集，并等待采集完成。</li>
		<li>输入“ef”或“efp”处理数据，然后输入“apk”进行自动相位校正。在 NMR 数据处理软件中完成数据处理。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过解析 NMR 数据分析结果推断化合物的化学结构。</li>
	<li>统计13C NMR 谱图中的碳信号数目，并从高分辨质谱（HR-MS）预测结果中选择匹配的分子式。</li>
	<li>对1H NMR 谱图中的质子信号进行积分，并根据 HSQC 谱图中的信号分配碳原子与质子之间的连接关系。</li>
	<li>根据1H-1H COSY 和 HMBC 谱图中的相关信号，确定碳骨架的连接方式。</li>
	<li>基于结构推理初步指定化学结构27。在化学结构数据库中检索该初步结构，并与文献中的类似物进行比较。</li>
	<li>利用核奥弗豪泽效应谱（NOESY）确定相对构型。
	 
	注意：由于对映异构体在质谱及各种波谱方法中表现出相同的性质，某些化合物（尤其是含有 2’-羟基或 2’-NH2 的化合物）的绝对构型需通过衍生化反应来确定。衍生化反应后，谱图中出现的差异有助于明确大多数化合物的绝对构型28。</li>
</ol>
7. 通过电生理图（EOG）和生物测定确认纯化合物具有气味且具有行为活性
<ol>
	<li>重复步骤 3.1 - 3.5。</li>
	<li>对于浓度-反应曲线，根据步骤 6.2 测定的分子量，将信息素原液（10-3 M，溶于 50% 甲醇/水，-20 °C 保存）用 50% 甲醇/水配制成 10-6 M 至 10-13 M 的 10 倍系列稀释液，总体积为 10 mL。将含 L-精氨酸和纯化合物的工作溶液置于玻璃小瓶中，并放入循环水浴中，使温度平衡至 8 °C。</li>
	<li>重复步骤 3.7 - 3.18。</li>
	<li>重复步骤 4.1 - 4.2。</li>
	<li>使用蠕动泵以 200 mL/min 的恒定流速，持续 5 分钟，将纯化合物以 EOG 检测阈值浓度施加至随机分配的实验通道，同时将溶剂（50% 甲醇/去离子水）施加至对照通道。</li>
	<li>重复步骤 4.4 - 4.6。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

鱼类生活在一个充满尚未被鉴定化合物的化学世界中。生物活性检测引导的分级分离技术已被证明对于鉴定和表征介导多种化学相互作用的生物活性分子至关重要，例如在樱鳟31、亚洲象32以及海七鳃鳗33,34,35中所观察到的相互作用。生物活性检测引导的分级分离是一种有效的方法，能够从初始提取物精确追踪并定位到纯化的活性化合物。通过该方法鉴定出的生物活性化合物，可能揭示出具有独特化学骨架的新型化合物，而这种结构通常难以从已知的生物合成途径中预测得到。
通过EOG记录来确定哪些组分或化合物能够引发嗅觉反应。为了准确测量假定信息素在EOG记录中的嗅觉反应，需注意若干关键技术要点。首先，根据机构动物护理与使用委员会（IACUC）批准的操作规程，必须使用3-氨基苯甲酸乙酯（MS222）对鱼类进行深度麻醉，并通过肌肉注射三碘季胺...

信息素是生物个体释放的特定化学信号，有助于其寻找食物来源、探测捕食者以及调节同种个体之间的社会行为1。昆虫的信息素通讯已被广泛研究2；然而，水生脊椎动物信息素的化学鉴定及其生物学功能尚未得到充分研究。了解所释放信息素的化学结构与功能，可用于促进濒危物种的恢复3,4，或控制有害物种5,6。这些技术的应用需要对具有生物活性的信息素成分进行分离和表征。
信息素鉴定是天然产物化学的一个分支。由于信息素分子本身的特性，信息素研究的进展在一定程度上受到限制。信息素通常不稳定且释放量极微，目前仅有少数采样技术可用于检测微量挥发性物质7,8 或水溶性化合物9鉴定信息素的方法包括：1）对已知化合物进行靶向筛选，2）代谢组学分析，以及3）生物活性引导的组分分离。靶向筛选已知化合物是指检测那些已被假定可作为信息素的生理过程代谢副产物，且这些化合物可从商业途径获得。该方法的局限性在于研究人员仅能测试已知且可获取的化合物。然而，该方法已成功鉴定了在金鱼中起信息素作用的性激素。10,11,12代谢组学是另一种信息素鉴定方法，可识别生物系统内潜在的小分子代谢产物13. 两组代谢谱的比较（即，一种活性 与 一种非活性提取物）可用于鉴定潜在的代谢谱，从中纯化代谢物、解析其结构并验证其生物活性14特定混合物的复杂配方更有可能通过代谢组学检测到加性或协同效应，因为代谢物被视为一个整体，而非一系列组分分数。13然而，代谢组学的应用依赖于合成标准品的可获得性，因为所产生的数据无法帮助解析新结构。
生物测定引导的分级分离是一种整合了化学与生物学两个领域的系统性、迭代式研究方法。该方法利用生理学和行为学生物测定的结果，指导活性信息素化合物的分离与鉴定。粗提物依据某种化学性质进行分级分离即分子大小、极性 等等。）并利用电嗅觉图（EOG）记录和/或生物测定法进行检测。通过重复上述分馏步骤以及EOG和/或生物测定，筛选出具有生物活性的组分。纯化活性化合物的结构通过质谱和波谱方法解析，获得其分子量及结构信息，从而为化合物的合成提供模板。生物测定导向的分馏方法可获得多种代谢产物，甚至可能发现具有独特化学骨架的新颖信息素，这些结构难以通过生物合成途径预测。
本文描述了一种基于生物活性检测的分级分离方法，用于分离和鉴定雄性海七鳃鳗性信息素化合物的生物活性。海七鳃鳗（Petromyzon marinus）是研究信息素通讯的理想脊椎动物模型，因为这种鱼类在完成其包含幼虫、幼体和成体三个不同阶段的溯河洄游生活史过程中，高度依赖嗅觉系统来感知化学信号。海七鳃鳗的幼虫栖息于淡水溪流的沉积物中，经历显著的变态过程后转变为幼体，并迁移到湖泊或海洋中，寄生在大型鱼类宿主上。在脱离宿主后，成体返回产卵溪流，其洄游过程受到溪流中定居幼虫释放的洄游信息素引导15,16,17,18,19。成熟的雄性个体上溯至产卵场，释放一种多组分的性信息素以吸引配偶，间歇性地繁殖约一周后死亡15,20。鉴定海七鳃鳗信息素具有重要意义，因为调控其信息素通讯系统是目前被考虑用于控制五大湖地区入侵性海七鳃鳗种群的策略之一21。

<table><tbody><tr><td>带细丝的优质标准壁硼硅酸盐毛细管&amp;nbsp;</td><td>Warner Instruments</td><td>G150F-4</td><td>记录电极和参比电极（外径 1.5 mm，内径 0.86 mm）</td></tr><tr><td>拉针仪</td><td>Narishige</td><td>PC-10</td><td>用于制备EOG电极</td></tr><tr><td>金刚石尖端玻璃切割器</td><td>Generic</td><td></td><td>用于切割EOG电极尖端</td></tr><tr><td>硼硅酸盐玻璃毛细管</td><td>World Precision Instruments</td><td>1B150-4</td><td>EOG用气味递送管</td></tr><tr><td>直筒E系列记录电极夹，适用于外径1.5 mm玻璃毛细管，配有Ag/AgCl小球</td><td>Warner Instruments</td><td>ESP-M15N</td><td>记录电极夹</td></tr><tr><td>带手柄E系列参比电极夹，适用于外径1.5 mm玻璃毛细管，配有&amp;nbsp; Ag/AgCl小球&amp;nbsp;</td><td>Warner Instruments</td><td>E45P-F15NH</td><td>参比电极夹</td></tr><tr><td>1 mm插针</td><td>Warner Instruments</td><td>WC1-10</td><td>用于连接参比电极夹和记录电极夹</td></tr><tr><td>2 mm插针</td><td>Warner Instruments</td><td>WC2-5</td><td>用于连接参比电极夹和记录电极夹</td></tr><tr><td>琼脂</td><td>Sigma</td><td>A1296</td><td>熔融琼脂，用于填充电极</td></tr><tr><td>氯化钾（KCl）</td><td>Sigma</td><td>P9333</td><td>3M KCl，用于填充电极和电极夹</td></tr><tr><td>微量移液管填充丝</td><td>World Precision Instruments</td><td>MF28G-5</td><td>用于填充电极和电极夹</td></tr><tr><td>L-精氨酸</td><td>Sigma</td><td>A5006</td><td>EOG阳性对照气味剂</td></tr><tr><td>甲醇</td><td>Sigma</td><td>34860</td><td></td></tr><tr><td>水浴锅</td><td>定制</td><td>N/A</td><td>用于盛放EOG实验用气味剂</td></tr><tr><td>3-氨基苯甲酸乙酯（MS222）</td><td>Syndel USA</td><td>Tricaine1G</td><td>EOG麻醉剂</td></tr><tr><td>三碘季胺酚（Gallamine triethiodide）</td><td>Sigma</td><td>G8134-5G</td><td>EOG麻痹剂</td></tr><tr><td>1 mL注射器</td><td>BD Biosciences</td><td>301025</td><td>用于注射麻痹剂</td></tr><tr><td>皮下注射针头 26G 5/8</td><td>BD Biosciences</td><td>305115</td><td>用于注射麻痹剂</td></tr><tr><td>滚轴夹</td><td>World Precision Instruments</td><td>14043-20</td><td>调节麻醉剂流入七鳃鳗口腔的流速</td></tr><tr><td>氯化钠（NaCl）</td><td>J.T. Baker</td><td>3624-05</td><td>用于配制0.9%生理盐水</td></tr><tr><td>V形塑料支架（作为样品台）</td><td>定制</td><td>N/A</td><td>在EOG实验中固定七鳃鳗</td></tr><tr><td>塑料槽</td><td>定制</td><td>N/A</td><td>用于支撑EOG实验中的V形塑料支架</td></tr><tr><td>手术刀片 - #11</td><td>Fine Science Tools</td><td>10011-00</td><td>用于EOG解剖</td></tr><tr><td>手术刀柄 - #3</td><td>Fine Science Tools</td><td>10003-12</td><td>用于EOG解剖</td></tr><tr><td>直头超细镊子</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-00</td><td>用于EOG解剖，Dumont #5SF 镊子</td></tr><tr><td>弯头超细镊子</td><td>Fine Science Tools</td><td>11370-42</td><td>用于EOG解剖，Moria MC40B</td></tr><tr><td>直头弹簧剪</td><td>Fine Science Tools</td><td>15003-08</td><td>用于EOG解剖</td></tr><tr><td>体视显微镜</td><td>Zeiss</td><td>Discovery V8</td><td>用于EOG解剖</td></tr><tr><td>照明光源</td><td>Zeiss</td><td>CL 1500 ECO</td><td>用于EOG解剖</td></tr><tr><td>塑料管路</td><td>Generic</td><td></td><td>用于连接循环式EOG装置和水浴锅</td></tr><tr><td>气味递送管路</td><td>定制</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>管路内滤器及垫圈组件</td><td>Lee Company</td><td>TCFA1201035A</td><td></td></tr><tr><td>显微操作器</td><td>Narishige</td><td>MM-3</td><td>用于定位电极和气味递送毛细管</td></tr><tr><td>磁性固定装置</td><td>Kanetec</td><td>MB-K</td><td></td></tr><tr><td>阀驱动器</td><td>Arduino</td><td>定制</td><td>用于控制气味刺激阀门的开启</td></tr><tr><td>电磁阀</td><td>Lee Company</td><td>LFAA1201618H</td><td>用于气味刺激的阀门</td></tr><tr><td>NeuroLog 交流/直流放大器</td><td>Digitimer Ltd.</td><td>NL106</td><td>用于放大诱发电信号的幅度</td></tr><tr><td>带前置放大头的NeuroLog直流前置放大器</td><td>Digitimer Ltd.</td><td>NL102G</td><td>用于放大诱发电信号的幅度</td></tr><tr><td>低通60 Hz滤波器</td><td>Digitimer Ltd.</td><td>NL125</td><td></td></tr><tr><td>数据采集卡（Digitizer）</td><td>Molecular Devices LLC</td><td>Axon Digidata 1440A</td><td></td></tr><tr><td>运行Axoscope数据采集软件的戴尔计算机（OptiPlex 745）</td><td>Molecular Devices LLC</td><td>AxoScope 版本 10.4</td><td></td></tr><tr><td>法拉第笼</td><td>定制</td><td>N/A</td><td>电磁噪声屏蔽</td></tr><tr><td>双选择迷宫</td><td>定制</td><td>N/A</td><td>防水处理的船用级胶合板，内衬塑料膜</td></tr><tr><td>排污泵</td><td>Honda</td><td>WT30XK4A</td><td>从附近河流向迷宫注水</td></tr><tr><td>带管路的蠕动泵</td><td>Cole Parmer</td><td>Masterflex 07557-00</td><td>用于在迷宫中递送气味剂</td></tr><tr><td>逆变发电机</td><td>Honda</td><td>EU1000i</td><td>为蠕动泵供电</td></tr><tr><td>释放笼</td><td>定制</td><td>N/A</td><td>用于在迷宫中使七鳃鳗适应环境</td></tr><tr><td>网状材料</td><td>Generic</td><td></td><td>用于限定迷宫尺寸，并通过网辊减少水流扰动</td></tr><tr><td>桶（5加仑）</td><td>Generic</td><td></td><td>用于混合气味剂</td></tr><tr><td>流量计</td><td>Marsh-McBirney</td><td>Flo-Mate 2000</td><td>用于测量流量</td></tr><tr><td>XAD 7 HP 树脂</td><td>Dow chemical</td><td>37380-43-1</td><td>用于条件化水的提取&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>甲醇</td><td>Sigma</td><td>34860</td><td>用于条件化水的提取&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>水浴锅</td><td>Yamato</td><td>BM 200</td><td>用于条件化水的提取&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>冷冻干燥机</td><td>Labconco</td><td>CentriVap Concentrator</td><td>用于条件化水的提取</td></tr><tr><td>氯仿</td><td>Sigma</td><td>CX1050</td><td>用于分离组分池</td></tr><tr><td>硅胶 70-230目</td><td>Sigma</td><td>112926-00-8</td><td>用于分离组分池</td></tr><tr><td>硅胶 230-400目</td><td>Sigma</td><td>112926-00-8</td><td>用于分离组分池</td></tr><tr><td>预涂硅胶TLC板</td><td>Sigma</td><td>99571</td><td>用于分离组分池</td></tr><tr><td>茴香醛</td><td>Sigma</td><td>A88107</td><td>用于分离组分池</td></tr><tr><td>Sephadex LH-20</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0090-01</td><td>用于分离组分池</td></tr><tr><td>Amberlite XAD 7 HP 树脂</td><td>Sigma</td><td>XAD7HP</td><td>用于条件化水的提取&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>4根容量为2.5L的玻璃柱</td><td>Ace Glass Inc.</td><td>5820</td><td>用于条件化水的提取&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>丙酮</td><td>Sigma</td><td>650501</td><td>用于条件化水的提取&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>TQ-S TOF LC质谱仪（或同等设备）</td><td>Waters Co.</td><td>N/A</td><td>用于结构鉴定</td></tr><tr><td>二元HPLC泵</td><td>Waters Co.</td><td>1525</td><td>用于分离组分池/化合物</td></tr><tr><td>Agilent 900MHz NMR波谱仪（或同等设备）</td><td>Agilent</td><td>N/A</td><td>用于结构鉴定</td></tr><tr><td>旋转蒸发干燥系统</td><td>Buchi</td><td>RII</td><td>用于条件化水的提取&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>紫外灯（254 nm）</td><td>Spectronics Co.</td><td>ENF-240C</td><td>用于薄层色谱&amp;nbsp;</td></tr></tbody></table>

利用生物测定引导的分级分离法鉴定七鳃鳗信息素

The Identification of Sea Lamprey Pheromones Using Bioassay-Guided Fractionation

生物测定引导的分级分离是一种迭代方法，利用生理学和行为学生物测定的结果来指导活性信息素化合物的分离与鉴定。该方法已成功用于鉴定多种动物物种中作为信息素发挥作用的化学信号。七鳃鳗依靠嗅觉来检测介导其行为或生理反应的信息素。我们利用鱼类生物学的这一知识，推测潜在信息素的功能，并指导活性信息素组分的分离与鉴定。采用色谱法从处理过的水中提取、浓缩并分离化合物。通过电嗅觉图（EOG）记录确定哪些组分可引发嗅觉反应。随后使用双选迷宫行为实验，判断具有气味的组分是否也具有行为活性并诱导偏好反应。质谱和波谱方法提供分子量和结构信息，以辅助结构解析。通过EOG和行为实验验证纯化合物的生物活性。在迷宫中观察到的行为反应最终应在野外环境中加以验证，以确认其在自然溪流环境中的功能。这些生物测定具有双重作用：1）指导分级分离过程；2）确认并进一步明确所分离组分的生物活性。本文报告了一项代表性海七鳃鳗信息素鉴定研究的结果，展示了生物测定引导分级分离方法的应用价值。鉴定海七鳃鳗信息素尤为重要，因为调控其信息素通讯系统是当前控制入侵性海七鳃鳗在劳伦提安五大湖扩散的备选策略之一。该方法可轻松适用于广泛生物类群的化学通讯研究，有助于揭示水传化学生态学的机制。

图解总结了生物测定导向分离方案中所述的步骤，如图1所示。该方案包括分离和表征5种假定的海七鳃鳗信息素的结构、嗅觉活性及行为活性的步骤（图2）。通过质谱和核磁共振数据（图3和图4），从经成熟雄性海七鳃鳗处理过的水中解析出了匹罗米曾A-B和匹罗米酮A-C的结构22,29。
我们获得的EOG记录代表性数据（图5）表明，Petromyzene A-B和Petromyzone A-C均为强效的气味分子，能够有效刺激成年海七鳃鳗的嗅上皮组织，并具有较低的...

本文介绍了一种用于分离和表征海洋七鳃鳗疑似信息素化合物的结构、嗅觉活性及其行为反应的实验方案。

基于生物活性检测的分级分离是一种迭代方法，利用生理学和行为学生物测定结果来指导目标化合物的分离与纯化。

该方法有助于解答化学生态学领域的关键问题，例如信息素的鉴定。此技术的主要优势在于能够将新化合物与信息素功能关联起来。开始该实验时，将15至30条性成熟的雄性海七鳃鳗置于装有250升通气的休伦湖水的水箱中，水温维持在16至18摄氏度。为了通过固相萃取提取条件水，需通过泵送系统将水从储罐输送至色谱柱顶部。水样流经一系列四个一升容量的玻璃色谱柱，其中填充有两公斤中等极性的聚合物离子交换树脂。随后，在40摄氏度的减压条件下，通过旋转蒸发持续五小时去除有机溶剂，并收集萃取物。为分离组分流份，先将硅胶在初始流动相中浸泡30分钟。将含溶剂的硅胶转移至玻璃柱中，打开阀门使流动相流过。接着，将提取物与硅胶充分混合，并将其加样至液相色谱柱的硅胶床之上。用从95%氯仿-甲醇到100%甲醇的梯度洗脱，总体积为2.5升，然后将洗脱液分别收集到10毫升的小瓶中。随后，在预涂硅胶板上进行薄层色谱（TLC）实验，将样品点在起始线上，并将板的起始线浸入密封玻璃缸中的展开剂中。当展开剂迁移至终点线时，将板从缸中取出，静置10分钟使溶剂挥发。首先在254纳米的紫外光下观察斑点，然后使用色谱喷雾器将含有5%茴香醛的酸性甲醇溶液喷洒在板上，并在85摄氏度下加热3分钟进行染色。随后，在40摄氏度下减压旋转蒸发约30分钟，将组分浓缩至残留物。进行EOG记录时，使用微量移液器将3摩尔氯化钾溶液注入已极化的毛细管电极和预制有银-氯化银颗粒的固态电极 holder 中。然后，将极化电极插入电极架中。接着，在容量瓶中，用去离子水配制的10⁻² mol/L L-精氨酸储备液，以活性炭过滤水稀释，制备100毫升10⁻⁵ mol/L的L-精氨酸溶液。对于浓度反应曲线，用10倍梯度稀释法分别制备10毫升的组分混合液。现在，将一条已麻醉的七鳃鳗置于V形支架中，并用湿润的纸巾包裹以防止干燥。将含有50毫克/升MS222的循环充气水通过导管插入其口腔腔内。调节流速，确保水从鳃孔流出，以持续灌流鳃部。用过滤水冲洗气味递送管路，并将其连接至安装在显微操作器上的阀门。接着，将气味递送毛细管插入嗅上皮腔内，向嗅上皮递送过滤水，以在不施加气味物质时防止组织干燥。然后，将记录电极和参考电极安装到显微操作器上。将参考电极放置在鼻孔附近体表皮肤上。使用体视显微镜，将记录电极缓慢下降至刚好接触嗅上皮表面。随后，将气味递送管从背景过滤水中转移至10⁻⁵ M的L-精氨酸溶液中。打开计算机、放大器、滤波器和数字化仪。使用阀驱动软件，通过勾选 T1 框、将 T 设置为 4 秒并勾选 T2 框，程序设定为施加持续 4 秒的单次气味刺激。在数据采集软件中，将采集模式设置为高速示波器模式。点击播放图标，然后在阀驱动软件中点击开始，以触发气味脉冲。开始记录空白对照、L-精氨酸，然后按浓度从低到高的顺序记录气味物质，每次施加之间用过滤水冲洗两分钟。为鉴定具有行

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Research

科研

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

利用生物测定引导分馏法鉴定海洋鳗信息素

本文演示了一种通过电天线图分析法测定成年脐橙螟（Amyelois...

触角电位生物测定作为寄主植物挥发物筛选工具

在本视频中，我们演示了一种检测海洋海葵Anthopleura...

磷脂酶活性检测：一种凝胶扩散法测定 Anthopleura dowii 粗毒提取物中磷脂酶活性的方法

在变态过程中，海七鳃鳗会失去胆囊和胆管，这一过程类似于人类的胆道闭锁。本研究改进了一种新的固定与透明化方法（CLARITY），以利用激光扫描共聚焦显微镜对整个胆管系统进行可视化观察。该方法为研究胆管退行性变化提供了强有力的工具。...

一种用于可视化七鳃鳗（Petromyzon marinus）肝脏变态过程中胆道退化的新型透明化方法

本生物测定法采用一种模式捕食性鱼类，通过营养成分相似的食物基质，检测海洋生物组织有机提取物中天然浓度下的摄食抑制代谢物的存在。...

一种用于评估海洋生物组织中次级代谢产物抗捕食活性的鱼类摄食实验室生物测定法

本文描述了一种通过液相色谱/质谱法改进的聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性方法，用于河豚物种的基因分型。该方法采用反相硅胶整体柱分离经酶切后的扩增产物。此技术可解析寡核苷酸的单一同位素质量，有助于碱基组成的鉴定。...

通过液相色谱/质谱法改进河豚毒素鱼类的聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性基因分型

在爬行动物中，来自同种个体的皮肤脂质对性信号传递至关重要，并可能用于入侵物种的管理。本文描述了从蜕皮或完整个体中提取皮肤脂质、测定与分析总脂质质量，以及通过组分分离对脂质进行分离的实验方案。 通过...

化学分离、定量与爬行动物皮肤脂质的分离

对嗅神经进行细胞外多单位记录是评估海洋鱼类嗅觉敏感性的敏感、可靠且可重复的方法。该方法记录初级感觉输入，且不受外界盐度的影响。...

硬骨鱼类嗅神经的细胞外多单位记录

神经肽的质谱表征可提供序列、定量和定位信息。该优化的工作流程不仅适用于神经肽研究，也适用于其他内源性肽类。本文提供的实验方案描述了使用液相色谱-电喷雾电离质谱（LC-ESI-MS）、基质辅助激光解吸/电离质谱点样（MALDI-MS spotting）以及基质辅助激光解吸/电离质谱成像（MALDI-MS...

Callinectes sapidus 中神经肽的多维度质谱分析

本文介绍了一种从海葵中获取粗毒提取物并检测其溶血活性和磷脂酶活性的实验方案。...

通过简易生物测定法鉴定海葵粗提物中的溶血活性与磷脂酶活性

本方案建立了提取和量化秀丽隐杆线虫（C.

秀丽隐杆线虫中挥发性性信息素的提取与化学吸引测定

本方案介绍了一种完全自动化的流程，用于从水体和富含脂质的鱼类组织中提取土臭素和2-甲基异茨醇。该方法可在这些化合物达到气味阈值之前实现早期检测。文中提供了来自水产养殖环境的代表性数据。...

利用高容量吸附萃取探针和气相色谱-质谱法对水和鱼类中的土臭素与2-甲基异茨醇进行提取与检测

学习利用生物测定引导分馏法鉴定海洋鳗信息素，通过固相萃取和旋转蒸发分离化合物，结合电嗅觉图记录和行为分析表征其嗅觉效价。该方法将新型化合物与信息素功能联系起来，为化学生态学研究提供重要工具。

利用生物测定引导的分级分离法鉴定七鳃鳗信息素

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