利用生物测定引导的分级分离法鉴定七鳃鳗信息素

该方法有助于解答化学生态学领域的关键问题，例如信息素的鉴定。此技术的主要优势在于能够将新化合物与信息素功能关联起来。开始该实验时，将15至30条性成熟的雄性海七鳃鳗置于装有250升通气的休伦湖水的水箱中，水温维持在16至18摄氏度。

为了通过固相萃取提取条件水，需通过泵送系统将水从储罐输送至色谱柱顶部。水样流经一系列四个一升容量的玻璃色谱柱，其中填充有两公斤中等极性的聚合物离子交换树脂。随后，在40摄氏度的减压条件下，通过旋转蒸发持续五小时去除有机溶剂，并收集萃取物。

为分离组分流份，先将硅胶在初始流动相中浸泡30分钟。将含溶剂的硅胶转移至玻璃柱中，打开阀门使流动相流过。接着，将提取物与硅胶充分混合，并将其加样至液相色谱柱的硅胶床之上。

用从95%氯仿-甲醇到100%甲醇的梯度洗脱，总体积为2.5升，然后将洗脱液分别收集到10毫升的小瓶中。随后，在预涂硅胶板上进行薄层色谱（TLC）实验，将样品点在起始线上，并将板的起始线浸入密封玻璃缸中的展开剂中。当展开剂迁移至终点线时，将板从缸中取出，静置10分钟使溶剂挥发。

首先在254纳米的紫外光下观察斑点，然后使用色谱喷雾器将含有5%茴香醛的酸性甲醇溶液喷洒在板上，并在85摄氏度下加热3分钟进行染色。随后，在40摄氏度下减压旋转蒸发约30分钟，将组分浓缩至残留物。进行EOG记录时，使用微量移液器将3摩尔氯化钾溶液注入已极化的毛细管电极和预制有银-氯化银颗粒的固态电极 holder 中。

然后，将极化电极插入电极架中。接着，在容量瓶中，用去离子水配制的10⁻² mol/L L-精氨酸储备液，以活性炭过滤水稀释，制备100毫升10⁻⁵ mol/L的L-精氨酸溶液。对于浓度反应曲线，用10倍梯度稀释法分别制备10毫升的组分混合液。

现在，将一条已麻醉的七鳃鳗置于V形支架中，并用湿润的纸巾包裹以防止干燥。将含有50毫克/升MS222的循环充气水通过导管插入其口腔腔内。调节流速，确保水从鳃孔流出，以持续灌流鳃部。

用过滤水冲洗气味递送管路，并将其连接至安装在显微操作器上的阀门。接着，将气味递送毛细管插入嗅上皮腔内，向嗅上皮递送过滤水，以在不施加气味物质时防止组织干燥。然后，将记录电极和参考电极安装到显微操作器上。

将参考电极放置在鼻孔附近体表皮肤上。使用体视显微镜，将记录电极缓慢下降至刚好接触嗅上皮表面。随后，将气味递送管从背景过滤水中转移至10⁻⁵ M的L-精氨酸溶液中。

打开计算机、放大器、滤波器和数字化仪。使用阀驱动软件，通过勾选 T1 框、将 T 设置为 4 秒并勾选 T2 框，程序设定为施加持续 4 秒的单次气味刺激。在数据采集软件中，将采集模式设置为高速示波器模式。点击播放图标，然后在阀驱动软件中点击开始，以触发气味脉冲。

开始记录空白对照、L-精氨酸，然后按浓度从低到高的顺序记录气味物质，每次施加之间用过滤水冲洗两分钟。为鉴定具有行为活性的组分，将性成熟雌性海七鳃鳗置于迷宫中的释放笼内，适应环境五分钟。释放海七鳃鳗后，记录其在10分钟内分别停留在实验通道和对照通道中的累计时间，两个通道均含有河水。

接下来，使用蠕动泵以每分钟200毫升的恒定流速，将溶剂中的测试刺激物施加到随机分配的实验通道，同时向对照通道施加溶剂，持续5分钟；随后在溶剂中继续施加测试刺激物10分钟，并记录七鳃鳗在实验通道和对照通道中停留的累计时间。在此步骤中，进一步采用凝胶过滤色谱法，利用Sephadex LH-20柱将活性组分纯化为单一化合物。将样品溶于0.5毫升初始流动相中，依次上样至氯仿-甲醇柱和甲醇柱，然后洗脱活性组分以获得目标化合物。

将纯化的化合物溶解并用高效液相色谱的初始流动相稀释，配制成约1微克/毫升的10微升溶液。接着，将样品溶液转移至高效液相色谱小瓶中，并放入高效液相色谱自动进样器。将样品注入电喷雾离子化质谱，使用色谱-质谱联用仪记录高分辨率电喷雾离子化质谱图谱。

将样品完全溶解于所选的氘代溶剂中，配制成浓度约为 0.1 至 10 毫克/毫升的溶液。将样品溶液转移至核磁共振管中，在 900 兆赫核磁共振波谱仪上测定一维和二维核磁共振谱。图中所示为一台 600 兆赫核磁共振波谱仪。

通过波谱和光谱方法鉴定出五种新的海七鳃鳗假定信息素，并阐明了其结构。这些假定信息素可刺激成年海七鳃鳗的嗅觉上皮组织，在电嗅觉图记录中表现出低检测阈值。在双选迷宫行为实验中，性成熟的雌性海七鳃鳗被Petromyzone A、Petromyzene A和Petromyzene B吸引，而回避Petromyzone C。在实施这一跨学科实验流程时，重要的是要协调化学与生物学实验，以完成该迭代性实验方案。

采用此方法后，还可进行X射线晶体学分析和衍生化反应等其他方法，以回答有关化合物立体化学等进一步的问题。该技术发展后，为天然产物和神经行为学领域的研究人员探索水生生物（如海七鳃鳗）信息素的可能生物合成途径及其生物学功能铺平了道路。请注意，氯仿的操作具有极高危险性，处理该试剂时必须采取预防措施，例如在通风橱中操作，并佩戴手套和安全护目镜。