Name: 眼毛刺角膜上皮磨损与角膜创面愈合的模型研究 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-10T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 28 s
Description: 学习使用眼毛刺在小鼠角膜表面制造上皮磨损并追踪愈合过程的方法。该技术利用荧光素可视化伤口，为研究角膜上皮祖细胞行为和角膜稳态维持机制提供可靠模型。

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我们非常感谢 Kaisa Ikkala 在实现本方法过程中以及后续将其应用于我们的核心研究问题时所提供的宝贵技术支持和富有洞见的帮助。我们还要感谢实验动物中心以及 Anna Meller 在制定兽医工作指南规划方面给予的帮助。

所有实验均获得国家动物实验委员会的批准。
1. 准备工作
<ol>
	<li>除另有说明外，所有溶液均需提前配制并保持在室温下。按照废弃物处理规定处置使用过的材料和溶液。</li>
	<li>使用4至12周龄的NMRI或ICR远交系小鼠，性别不限。若使用C57BL/6品系，请遵循步骤1.3.2中的氯胺酮-美托咪定配制方法；其余步骤请遵循1.3.3–1.3.5中所述说明。</li>
	<li>在手术开始前及时新鲜配制兽用药品。卡洛芬将在后续使用，因此目前无需配制。
	<ol>
		<li>为制备用于麻醉的氯胺酮-美托咪定溶液，将0.375 mL（储存浓度50 mg/mL）氯胺酮（Ketaminol Vet）与0.25 mL（储存浓度1 mg/mL）美托咪定（Cepetor Vet）混合，并加入1.25 mL无菌0.9% NaCl。按每20 g小鼠体重给予0.15 mL（氯胺酮7.5 mg/kg，美托咪定1 mg/kg）。</li>
		<li>为C57BL/6小鼠制备更稀释的氯胺酮-美托咪定麻醉溶液时，将0.375 mL（储存浓度50 mg/mL）氯胺酮与0.25 mL（储存浓度1 mg/mL）美托咪定混合，并加入2.5 mL无菌0.9% NaCl。按每20 g小鼠体重给予0.15 mL（氯胺酮3.75 mg/kg，美托咪定0.5 mg/kg）。 
		注：此步骤仅适用于成年C57BL/6小鼠。</li>
		<li>为制备用于镇痛的丁丙诺啡溶液，将0.1 mL（储存浓度0.3 mg/mL）丁丙诺啡加入1.9 mL无菌0.9% NaCl中。按每20 g小鼠体重给予0.2 mL（0.15 mg/kg）。</li>
		<li>为制备用于逆转麻醉的阿替美唑溶液，将0.1 mL（储存浓度5 mg/mL）阿替美唑加入4.9 mL 0.9% NaCl中。按每20 g小鼠体重给予0.15 mL（0.75 mg/kg）。</li>
		<li>在麻醉后镇痛期间使用卡洛芬。将0.1 mL（储存浓度50 mg/mL）卡洛芬加入4.9 mL 0.9% NaCl中。按每20 g小鼠体重给予0.15 mL（7.5 mg/kg）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>配制荧光染色液
	<ol>
		<li>为在钴蓝光下观察角膜擦伤（图1），使用荧光溶液。通过精密天平称取10 mg荧光素钠，溶于10 mL磷酸盐缓冲液（PBS）中，配制成0.1%荧光素溶液。</li>
		<li>避光保护荧光素溶液，并在摇床上震荡5分钟。 
		注：荧光素溶液对光敏感，应始终避光保存。该溶液可在+4 °C保存2–3天。使用时建议将荧光素溶液转移至滴眼液用的滴瓶中，转移时需使用无菌滤器过滤。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用前后均需清洁眼科钻头，先用PBS清洗，再用70%乙醇清洗。若在同一手术过程中对多只小鼠进行角膜擦伤操作，每只小鼠操作之间均需执行清洁步骤。</li>
	<li>开启加热板（+37 °C），并在其上放置一张纸巾。</li>
</ol>
2. 角膜擦伤
警告：处理小鼠时需穿戴防护装备（手套、实验服）。称量小鼠体重以估算给药体积。
<ol>
	<li>采用单手抓颈法固定小鼠23。将氯胺酮-美托咪啶混合物经腹腔（i.p.）注射至左下腹部。将小鼠置于单独的笼子中，等待其入睡，通常耗时少于5分钟。&#160;随后，依次经腹腔注射给予布托啡诺和阿替美唑。使用相同的固定技术。 
	注意：一旦给予麻醉，该操作流程不得在任何阶段暂停。</li>
	<li>继续操作前，检查加热板是否已预热。将麻醉后的小鼠放置于加热板上。若尾部反射消失而脚趾反射仍存在，则表明麻醉深度适宜。可通过手指或镊子轻捏尾部及任一趾部来检测上述反射，注意避免用力过大。麻醉效果可持续20–25分钟。</li>
	<li>进行角膜刮擦时，使用已清洁的角膜钻头。旋转钻头底部以启动振动，这是完成刮擦所必需的。当钻头正常工作时，手部可感知到振动。
	<ol>
		<li>用手指分别固定眼睑，逐只打开眼睛。然后将钻头稳固地接触角膜，并在眼球表面前后及侧向移动器械。钻头的振动即可完成划伤操作；切勿对角膜施加压力、晃动或撕裂组织。在中央角膜区域，表面进行20次刮擦动作足以造成损伤。操作过程中不要提起钻头，并尽量保持在需刮擦的角膜区域内。获得标准大小的角膜损伤需要多次练习才能掌握。</li>
	</ol>
	 
	注意：刮擦前可使用聚维酮碘眼用溶液实现角膜无菌化。</li>
</ol>
3. 成像磨损区域
<ol>
	<li>使用钴蓝笔式光源（图1）和荧光素溶液照射角膜擦伤区域。在环境光下，眼表呈无色状态。滴加荧光素溶液后，用笔式光源照射眼睛时，擦伤区域会发出绿色荧光。
	<ol>
		<li>必要时，参照步骤2.3的方法打开擦伤的眼睛，从滴瓶中滴加一滴荧光素溶液。用PBS或0.9% NaCl冲洗眼睛一次，以降低荧光素的背景信号。可使用滴瓶或移液器进行冲洗。如有需要，用柔软的擦拭纸吸除多余液体并清洁眼睫毛。多余的液体通常积聚在眼睛的鼻侧边缘，靠近泪道开口处。 
		注意：清洁时避免接触角膜，以防造成轻微擦伤。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>拍摄角膜擦伤的图像。
	<ol>
		<li>为了在每次成像过程中获得相似的图像，请使用稳定的固定装置来固定钴蓝笔式光源和单反相机（图2）。本方案提供了一种易于重复的操作设置（图2）。
		<ol>
			<li>固定笔式光源和相机时，分别使用带有柔性臂和夹具的台灯以及可调节的相机支架臂。用扎带将笔式光源固定在台灯上，并将其置于小鼠眼睛正上方。光源位置的不同可能会影响擦伤区域的可视化效果。图2中描述了这些工具的一种推荐摆放方式。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>使用单反相机拍摄眼睛图像。将动物置于合适距离和位置，并在室内光线下对相机进行对焦（1:12）。随后关闭除钴蓝笔式光源以外的所有灯光。 
		备注：可用胶带将笔式光源的手柄固定，或使用橡皮筋使光源在整个成像过程中持续开启。这有助于避免图像模糊。建议由一位同事协助完成成像操作。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 角膜擦伤后的苏醒
<ol>
	<li>通过腹腔注射给予第一剂丁丙诺啡，然后给予阿替美唑。操作手法与2.1步骤相同。</li>
	<li>在麻醉后，于角膜擦伤眼和非擦伤眼均滴加一滴抗菌性夫西地酸眼膏（Isathal），以保持眼球表面湿润并防止细菌污染。</li>
	<li>小鼠将在加热板上5-20分钟内苏醒，在麻醉后苏醒期间需持续观察。当小鼠恢复活动能力后，将其放入单独的笼具中。 
	注意：若苏醒时间较长，可将小鼠置于带有加热垫的笼内，或将整个笼具放置在加热板上，并定期监测小鼠状态。随着麻醉作用逐渐消退，小鼠通常会出现身体震颤并以前肢向上伸展的动作。此类行为应在3-4小时内恢复正常，此后可将小鼠放回共用笼具中。</li>
	<li>在角膜擦伤后的连续两天内，按照与步骤2.2和4.2相同的方法，通过腹腔注射给予卡洛芬进行镇痛治疗，并使用眼膏。</li>
</ol>
5. 伤口愈合过程中的成像
<ol>
	<li>在本实验方案中，使用擦伤后 18 小时和 72 小时的时间点来观察伤口闭合情况。
	<ol>
		<li>进行连续成像时，按照 2.2 节所述方法对小鼠进行麻醉。</li>
		<li>按照第 3 节所述方法拍摄图像。</li>
		<li>通过腹腔注射阿替美唑使动物苏醒，并按照 4.3 节所述方法监测苏醒过程。 
		注意：若不再继续随访，在完成 5.1.2 后立即实施安乐死。安乐死方法见 6.1 节。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. 角膜采集与石蜡包埋
<ol>
	<li>在最后一次观察时间点后，处死动物。将小鼠放入可充入 CO2 的密闭容器中，向容器内充入 CO2。当动物不再活动时，用力牵拉尾根部，同时下压颈部区域，以脱位颈椎。 
	警告：务必遵守当地动物福利机构的相关规定。</li>
	<li>使用解剖剪在眼球侧方的皮肤上剪开切口，完整取出眼球。将解剖剪置于眼球下方，剪断视神经，使眼球脱离眼眶。若眼球不易取出，可使用镊子辅助。
	<ol>
		<li>使用26G针头在眼球后部（视网膜侧）打一个小孔，以便溶液自由进入眼内。 
		注意：避免眼球干燥，应将其置于PBS中，直至继续后续操作。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将眼球收集至含有PBS的2 mL离心管中。此步骤不可暂停实验。</li>
	<li>吸除PBS，将眼球置于4%多聚甲醛（PFA）中，在+4 °C固定4–5小时。</li>
	<li>将固定后的眼球转移至组织包埋盒中，用于组织处理。使用组织处理仪并按照以下程序操作：
	<ol>
		<li>用PBS冲洗。</li>
		<li>室温下在70%乙醇中孵育2次，每次45分钟。</li>
		<li>室温下在94%乙醇中孵育2次，每次1小时。</li>
		<li>室温下在无水乙醇中孵育3次，每次45分钟。</li>
		<li>室温下在二甲苯中孵育3次，每次1小时，最后一次二甲苯置于37 °C。</li>
		<li>在60 °C石蜡中孵育3次，每次1小时。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>组织处理完成后，使用组织包埋模具将眼球包埋于液态石蜡中（+60 °C）。将眼球放入模具时，使其朝向侧面，周边边缘朝上。将模具置于冷却板上冷却5–10分钟，使石蜡凝固。</li>
</ol>
7. 角膜的石蜡切片
<ol>
	<li>根据机构或制造商的说明，准备切片机以进行切片。 
	警告：操作锋利的切片刀片时需小心谨慎。</li>
	<li>在切片机旁放置一个盛有室温超纯水的水浴装置，另放置一个盛有加热至 +50 °C 超纯水的水浴装置。</li>
	<li>对眼球进行厚度为 5 µm 的切片。 
	注意：晶状体在切片过程中容易破裂。为避免此情况，每次开始切新的一排切片时，用湿润的纸巾擦拭切割表面。使用自来水润湿纸巾。</li>
	<li>将切片并排置于室温水浴中，然后借助载玻片将其转移至热水浴中。在热水浴中展平切片，直至所有皱褶消失，切片表面呈无光泽状。</li>
	<li>将带有切片的载玻片在 +37 °C 下过夜干燥。</li>
	<li>将载玻片置于 +60 °C 的加热板上 1 分钟，以使切片牢固附着于载玻片上。此后，切片可直接用于染色、免疫组织化学方法处理，或保存于 +4 °C 环境中。</li>
</ol>

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<li>Sato, Y., Seo, N., Kobayashi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+background+differences+between+FVB+and+C57BL%2F6+mice+affect+hypnotic+susceptibility+to+pentobarbital%2C+ketamine+and+nitrous+oxide%2C+but+not+isoflurane%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Anaesthesiologica+Scandinavica%22%5BJournal%5D)">Genetic background differences between FVB and C57BL/6 mice affect hypnotic susceptibility to pentobarbital, ketamine and nitrous oxide, but not isoflurane.</a> Acta Anaesthesiologica Scandinavica. 50 (5), 553-556 (2006).</li>
<li>Pajoohesh-Ganji, A., Pal-Ghosh, S., Tadvalkar, G., Stepp, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((K14+%2B+Compound+niches+are+present+on+the+mouse+cornea+early+after+birth+and+expand+after+debridement+wounds%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">K14 + Compound niches are present on the mouse cornea early after birth and expand after debridement wounds.</a> Developmental Dynamics. 245 (2), 132-143 (2016).</li>
<li>Boote, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+Assessment+of+Ultrastructure+and+Light+Scatter+in+Mouse+Corneal+Debridement+Wounds%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Quantitative Assessment of Ultrastructure and Light Scatter in Mouse Corneal Debridement Wounds.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (6), 2786(2012).</li>
<li>Pal-Ghosh, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MMP9+cleavage+of+the+%CE%B24+integrin+ectodomain+leads+to+recurrent+epithelial+erosions+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">MMP9 cleavage of the β4 integrin ectodomain leads to recurrent epithelial erosions in mice.</a> Journal of Cell Science. 124 (Pt 15), 2666-2675 (2011).</li>
<li>Pal-Ghosh, S., Pajoohesh-Ganji, A., Brown, M., Stepp, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mouse+model+for+the+study+of+recurrent+corneal+epithelial+erosions%3A+alpha9beta1+integrin+implicated+in+progression+of+the+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">A mouse model for the study of recurrent corneal epithelial erosions: alpha9beta1 integrin implicated in progression of the disease.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45 (6), 1775-1788 (2004).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

损伤方法是研究角膜稳态和病理学不同方面的常用工具。擦伤模型为解决眼科学中的相关问题提供了一种控制良好的方法。然而，该实验方案中某些关键步骤值得强调。需要注意的是，文中所述有关兽医用药、伤口愈合时间线及结果的细节，均针对远交系NMRI和ICR品系小鼠进行了优化，但在不同小鼠品系之间可能会有所差异26。根据本方案，实验动物将保持麻醉状态约20分钟，这为实施擦伤操作提供了短暂但充足的时间窗口。然而，在使用眼部钻头时，实际进行擦伤操作非常迅速，完全可在该时间范围内完成。
简便且易于实现的可视化是磨损模型的主要优势之一。结合分子生物学方法，这为深入研究上皮细胞提供了可能。磨损后的角膜可进行组织学或免疫学染色，也可进一步收集并检测其中的蛋白质或核酸。Pajoohesh-Ganji 等 研究表明，使用钝化刀片造成角膜损伤后，角膜上皮细胞中的基因表达模式会发生改变27。为确保采样的可控性，我们建议在手术后立即拍摄损伤区域的图像，并严格按照预定时间点进行样本采集。
<p clas...

许多器官的上皮层都会受到损伤，但它们也具备通过伤口愈合来补偿组织缺损的能力。角膜是研究伤口愈合的极佳模型。它构成眼睛的外表面，为敏感的眼部结构提供保护层，因此角膜可作为抵御病原体和防止水分流失的物理屏障。角膜由三层结构组成：上皮层、基质层和内皮层。角膜上皮层构成角膜的最外层。上皮细胞通过紧密连接彼此牢固黏附，从而维持角膜的屏障功能1,2,3。一层无细胞的角膜基底膜，即Bowman膜，将上皮层与含有大量角质细胞的基质层分隔开来。在基质层下方，内皮细胞负责向上层组织输送营养物质、水分和氧气。
角膜擦伤在临床上非常常见4。角膜损伤类型多样，但大多由微小颗粒（如灰尘或沙粒）、划伤或其他异物引起。本文所述方案旨在复制一种具有临床相关性的角膜上皮擦伤类型，为临床医生和角膜研究人员提供一种可控且具有重要意义的方法，可用于其自身研究中。我们通过使用钝化的 Algerbrush II 眼科钻头对小鼠角膜组织进行擦伤，实施了体内损伤修复检测。在此过程中，我们仅针对中央角膜上皮造成擦伤，而保留器官其他部分不受损伤。因此，该方案非常适合用于研究体内角膜上皮细胞动态或再上皮化过程中的基底膜变化、细胞迁移、增殖和分化5。最近，该模型已被用于分析小鼠角膜中前体细胞的动态行为，并揭示分化后的角膜上皮细胞在损伤后重建角膜干细胞微环境的能力6,7。擦伤后，角膜可恢复其正常的透明性和抗张强度。有趣的是，一项体外研究表明，再上皮化过程并不伴随细胞增殖的增加8。本方案描述了小鼠角膜连续愈合的时间进程，因此适用于检测药物对愈合模式和速度的影响。
角膜已被广泛用于伤口愈合研究。然而，许多研究依赖于其他类型的损伤模型。一种成熟的角膜损伤模型是碱性烧伤，该模型通过将氢氧化钠（NaOH）直接或借助滤纸作用于角膜表面来建立。9碱性物质暴露会导致大范围且弥散的损伤，不仅影响角膜上皮，还累及结膜和基质9,10强碱性溶液已被证实可诱发角膜溃疡、混浊和新生血管形成9炎症细胞通常在6小时内侵入间质，并持续停留至24小时11因此，碱性损伤是研究基质活化的适宜方法。另一种化学损伤可通过将二甲基亚砜（DMSO）作用于角膜而造成。9,10其他常用的损伤模型包括穿透基质层的切口性伤口和仅限于基质层上部的角膜切除伤口。14,15这些方法还可用于解答有关间质性伤口愈合的问题。不同的损伤模型各有其优缺点。角膜上皮刮除或清创最初是使用钝化的手术刀片或刀具进行的 离体 角膜16该方法此后被用于 体内 在小鼠、大鼠和兔中17,18,19,20,21,22. 使用眼用钻头（图1），我们仅去除上皮层的特定区域，而保留其余上皮组织不受影响。通过这种方法，可精确地针对角膜不同部位进行上皮清除。此外，可利用荧光素染色评估擦伤面积。同时，本文还追踪记录了愈合期间擦伤区域的闭合过程。
该方法具有多项优势：i）可精确定位擦伤部位，而化学损伤法无法做到这一点；ii）擦伤操作快速；iii）属于非侵入性方法。本文以远交系NMRI小鼠作为模型描述该方法，但该方法也可应用于多种小鼠遗传模型，以及常用于研究人类角膜损伤的大鼠和兔模型。

<table><tbody><tr><td>NMRI 小鼠</td><td>Envigo</td><td>275</td><td></td></tr><tr><td>0.9% NaCl</td><td></td><td></td><td>使用无菌</td></tr><tr><td>美托咪啶</td><td>Vetmedic</td><td>Vnr087896</td><td>商品名：Cepetor Vet</td></tr><tr><td>氯胺酮</td><td>Intervet</td><td>Vnr511485</td><td>商品名：Ketaminol Vet</td></tr><tr><td>丁丙诺啡</td><td>Invidior</td><td>3015248</td><td>商品名：Temgesic</td></tr><tr><td>阿替美唑</td><td>Orion Pharma</td><td>Vnr471953</td><td>商品名：Antisedan Vet</td></tr><tr><td>卡洛芬</td><td>Norbrook</td><td>Vnr027579</td><td>商品名：Norocarp Vet</td></tr><tr><td>1% 夫西地酸眼膏</td><td>Dechra</td><td>Vnr080899</td><td>商品名：Isathal</td></tr><tr><td>荧光素钠盐</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F6377</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液</td><td></td><td></td><td>PBS</td></tr><tr><td>Algerbrush II 眼科磨头（0.5 mm 尖端）</td><td>Algerbrush</td><td>6.39768E+11</td><td></td></tr><tr><td>钴蓝笔式灯</td><td>SP Services</td><td>DE/003</td><td></td></tr><tr><td>热板仪</td><td>Kunz Instruments</td><td>2007-0217</td><td></td></tr><tr><td>数码单反相机</td><td>Nikon</td><td>D80</td><td></td></tr><tr><td>可调式相机支架和夹具</td><td>Neewer</td><td>10086132</td><td>高度 28 cm</td></tr><tr><td>带柔性臂和夹具的台灯</td><td>Prisma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>软质擦拭纸</td><td>KimtechScience</td><td>7552</td><td></td></tr><tr><td>CO2 麻醉舱</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>解剖工具组</td><td>Fine Science Tools</td><td></td><td></td></tr><tr><td>注射器</td><td>Beckton Dickinson</td><td>303172</td><td></td></tr><tr><td>26G 针头</td><td>Beckton Dickinson</td><td>303800</td><td></td></tr><tr><td>2 mL Eppendorf 管</td><td>Sarstedt</td><td>689</td><td></td></tr><tr><td>组织包埋盒</td><td>Sakura Finetech</td><td>4118F</td><td></td></tr><tr><td>组织处理机 ASP200S</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>二甲苯</td><td>VWR</td><td>UN1307</td><td></td></tr><tr><td>石蜡</td><td>Millipore</td><td>K95523361</td><td></td></tr><tr><td>组织包埋模具 32 × 25 × 6 mm</td><td>Sakura Finetech</td><td>4123</td><td></td></tr><tr><td>切片机</td><td>Microm</td><td>HM355</td><td></td></tr><tr><td>切片用水浴锅</td><td>Orthex</td><td>60591</td><td></td></tr><tr><td>切片用水浴锅</td><td>Leica</td><td>HI1210</td><td></td></tr><tr><td>切片机刀片</td><td>Feather</td><td>S35</td><td></td></tr><tr><td>载玻片</td><td>Th.Geyer GmbH &amp;amp; Co.</td><td>7,695,019</td><td></td></tr><tr><td>超纯水</td><td>Millipore</td><td>MPGP04001</td><td>MilliQ</td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127</td><td>PFA</td></tr></tbody></table>

使用眼部钻头建立角膜上皮擦伤作为角膜伤口愈合模型

Corneal Epithelial Abrasion with Ocular Burr As a Model for Cornea Wound Healing

小鼠角膜是研究伤口愈合的优良模型。角膜是眼睛的最外层，因此是抵御损伤的第一道防线。事实上，临床上最常见的眼部损伤是角膜擦伤。在此，我们利用眼科钻头在麻醉小鼠体内诱导角膜上皮擦伤，从而去除角膜上皮in vivo。该方法可实现靶向且可重复的上皮破坏，同时保持其他区域完整。此外，我们描述了使用荧光素染色对受损上皮进行可视化，并提供了观察受损角膜的具体建议。随后，我们在擦伤后0、18和72小时追踪伤口愈合的时间进程，直至伤口完成再上皮化。角膜损伤的上皮擦伤模型非常适合研究角膜层上皮细胞的增殖、迁移及再上皮化过程。然而，该方法并不适用于研究伤口愈合过程中基质层的激活，因为眼科钻头不会穿透至基质细胞层。该方法也适用于临床应用，例如药物疗效的临床前测试。

本方案描述了一种对小鼠角膜造成擦伤损伤的模型，并介绍了如何追踪和观察擦伤后的愈合过程。近期，我们采用该方法研究了角膜上皮前体细胞在伤口愈合中的作用6。使用成熟工具是成功开展擦伤实验的关键。我们及其他研究者曾使用Algerbrush II角膜磨头（图1）进行擦伤操作6,7,24。该工具的磨头尖端已钝化，尺寸为0.5 mm，其作用方式为刷除而非钻取或剪切角膜上皮。因此，该工具是实施角膜擦伤损伤的推荐选择。
该模型的一个核心特点是，可以在所需时间点轻松观察到受影响区域。在图3A中，我们展示了使用荧光素染色结合...

本方案描述了一种在小鼠眼部表面造成擦伤并随后观察其伤口愈合过程的方法。该方案利用眼部钻头，在麻醉小鼠状态下部分去除眼表上皮。

小鼠角膜是研究伤口愈合的优良模型。角膜是眼睛的最外层，因此是抵御外界侵害的第一道防线……

该方法有助于回答与角膜伤口愈合过程中涉及的细胞和分子机制相关的关键问题。该技术的一个优势在于，它能够模拟急诊室中发生角膜嵌入物（即眼球表面擦伤或划伤）时的实际情况。当我研究角膜上皮祖细胞及其在破坏角膜稳态维持条件下的行为时，首次提出了这一方法的想法。该方法的可视化演示至关重要，因为角膜擦伤操作难度较高，且需要反复练习。首先，使用精密天平称取10毫克荧光素钠盐，配制0.1%荧光素溶液，用于在钴蓝光下观察擦伤情况。然后，将称好的盐加入10毫升磷酸盐缓冲盐水溶液中。避光保护荧光素溶液，并振荡五分钟。将溶液用无菌滤器过滤至滴瓶中，并避光保存。荧光素溶液可在4°C下保存两至三天。使用前后均需清洁眼用钻头。先用 PBS 清洗，再用 70% 乙醇清洗。首先，将麻醉后的小鼠置于加热至 37°C 的加热板上的纸巾上。通过尾部夹捏和脚趾夹捏检查麻醉水平。若尾部反射消失而脚趾反射存在，则表明麻醉深度适宜。旋转钻头底座以启动振动。用手指分开眼睑，打开待处理的眼睛。然后，将钻头牢固地接触角膜，并在眼球表面来回、侧向移动仪器，过程中不得抬起钻头。钻头的振动将完成角膜刮擦。切勿按压、摇晃或撕裂角膜。在中央角膜区域，表面进行20次擦伤动作足以造成损伤。制作角膜擦伤具有一定难度，需要经过练习。务必注意施加正确的压力，并尽量在一次操作中完成角膜刮擦。从滴瓶中向刮擦后的角膜滴加一滴荧光素溶液。随后用0.9%生理盐水冲洗眼睛一次，以降低荧光素的背景干扰。用柔软的擦拭纸吸去多余液体，必要时清洁眼睫毛。为拍摄角膜擦伤图像，将带有钴蓝光笔灯的台灯置于小鼠眼睛正上方。若单独操作，可用胶带固定笔灯按钮，以保持灯光常亮。在室内光线下用单反相机对准眼睛对焦，然后关闭除钴蓝笔灯以外的所有光源。当用钴蓝笔灯照射时，因荧光素分子滞留在不平整的表面，角膜擦伤区域会发出绿色荧光。使用单反相机拍摄眼睛图像。成像完成后，将小鼠放回预热的金属板上。在角膜擦伤眼和未擦伤眼中均滴加一滴抗菌性Fucidin眼膏，以保持眼球表面湿润并防止麻醉后细菌污染。将小鼠置于加热板上，观察其术后5至20分钟的麻醉苏醒过程。当小鼠恢复活动能力后，将其单独饲养于清洁的笼具中。使用批准的方法实施安乐死后，用解剖剪在眼球侧方的皮肤处剪开切口，暴露眼球。随后将解剖剪置于眼球下方，剪断视神经，将眼球从眼眶中取出。将眼球置于含有 PBS 的培养皿中。使用 26 号针头在眼球后部视网膜侧打一个小孔，以允许溶液自由进入眼内。将眼球转移至含有 PBS 的 2 毫升离心管中。然后，移除 PBS，加入 4% 多聚甲醛，在 4°C 下固定眼球 4 至 5 小时。此图像显示小鼠眼球在刮伤后立即拍摄的结果。荧光素信号以亮绿色标记刮伤区域，而上皮其他区域则保持暗色。虚线标示伤口的边界。图像显示作为对照的未受伤对侧眼。白色斑点是相机的反光。角膜上皮损伤后18小时，上皮已基本覆盖暴

corneal-epithelial-abrasion-with-ocular-burr-as-model-for-cornea

Research

科研

JoVE Journal

Medicine

医学

眼毛刺角膜上皮磨损与角膜创面愈合的模型研究

本文描述了一种具有临床相关性的ex...

建立具有临床相关性的模型 离体 用于在天然微环境中研究上皮伤口修复的模拟白内障手术模型

本文描述了一种用于角膜伤口愈合研究的离体角膜器官培养模型的实验方案。该模型系统可用于评估药物在有序的三维多细胞环境中促进再生性愈合或产生药物毒性的效应。...

离体角膜器官培养模型在伤口愈合研究中的应用

本文描述了一种使用环钻和钝性高尔夫球棒状刮匙在小鼠角膜中央制造上皮擦伤伤口的实验方案。该角膜伤口愈合模型具有高度可重复性，目前正被用于评估在疾病背景下受损的角膜伤口愈合情况。...

一种用于研究角膜伤口愈合的上皮擦伤模型

本文建立了基于小鼠和兔的动物模型，用于角膜上皮机械性和化学性损伤的研究，以筛选新的治疗方法及其潜在机制。...

Ex Vivo 和 In Vivo 角膜上皮机械性与化学性损伤动物模型

本文介绍了一种用于研究角膜解剖结构、组织学特征及其愈合过程的新型动物模型。该新型动物模型采用蒙古沙鼠，其角膜在多个方面与人角膜具有相似性。...

蒙古沙鼠作为伤口愈合的动物模型

本方案展示了在鸡胚体内对角膜进行损伤处理的各个步骤。in ovo...

研究胚胎期受伤鸡角膜中的无瘢痕组织再生

本实验方案通过机械摩擦损伤斑马鱼的眼表，以在细胞水平上评估其后续的伤口闭合情况。该方法利用眼科钻头部分去除角膜上皮，并采用扫描电子显微镜追踪伤口闭合过程中细胞形态的变化。...

斑马鱼角膜伤口愈合：从擦伤到伤口闭合的成像分析

本文提出了三种不同的方法来损伤支配角膜的感觉神经纤维。这些方法有助于在小鼠中研究轴突再生。这三种方法可适用于其他动物模型，是研究角膜神经支配生理学及再生的理想选择。...

诱导小鼠角膜神经营养性角膜炎及神经再生的三种策略

我们通过角膜上皮刮除联合角膜缝线的方法建立了一种大鼠严重角膜炎症模型。该研究评估了角膜炎症模式、上皮细胞增殖以及炎症条件下角膜缘干细胞的变化。...

基于角膜上皮刮除联合角膜缝线建立大鼠重度角膜炎模型

利用器官培养的猪角膜和上皮伤口愈合评估治疗和化学毒性

学习使用眼毛刺在小鼠角膜表面制造上皮磨损并追踪愈合过程的方法。该技术利用荧光素可视化伤口，为研究角膜上皮祖细胞行为和角膜稳态维持机制提供可靠模型。

使用眼部钻头建立角膜上皮擦伤作为角膜伤口愈合模型

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