Name: c57bl6 小鼠耳蜗植入术与电唤起脑干反应记录 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 6 s
Description: 学习C57BL/6小鼠耳蜗植入术与电唤起脑干反应记录方法，用于研究感音神经性听力损失的电刺激治疗。该手术方案包括急性致聋、电极植入及功能评估，为人工耳蜗技术提供可靠的动物模型。

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作者感谢法国尼斯 Oticon Medical 的 Pierre Stahl 提供动物刺激平台以及关于刺激范式的建议，同时感谢澳大利亚墨尔本 Bionics Institute 的 James B. Fallon 和 Andrew K. Wise 提供的手术建议。本研究工作得到了瑞士国家科学基金会（T.R.B. 的欧洲研究理事会转移资助）资助。

所有操作均按照瑞士巴塞尔大学的动物护理和指南进行，并由瑞士巴塞尔州兽医办公室许可。
注意：本研究使用8–12周龄（体重20–30 g）的C57BL/6成年小鼠。 
左耳作为实验耳，右耳作为动物个体内的对照耳，不进行手术干预。
1. 术前准备
<ol>
	<li>手术前30分钟通过腹腔（i.p.）注射氯胺酮/赛拉嗪（氯胺酮80 mg/kg，赛拉嗪16 mg/kg，i.p.，注射体积为10 μL/g体重）对动物进行麻醉。
	<ol>
		<li>根据足底反射和眼睑反射（脚趾夹捏反应）以及胡须运动情况判断，必要时补充较低剂量的氯胺酮（45 mg/kg，i.p.，注射体积为10 μL/g体重）以维持麻醉。可根据机构指南替换药物及给药方案。 
		备注：通常情况下，使用该药物和剂量方案时，动物每45–60分钟需要注射一次。&#160;从初始切口到围绕植入电极阵列完成缝合的平均时间通常为1–1.5小时。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>检查动物是否完全镇静，表现为呼吸频率规律且无脚趾夹捏反射。维持此麻醉水平。</li>
	<li>使用闭环加热垫将动物体温维持在36.6 °C。涂抹眼膏以防止角膜脱水。这也将抑制动物的眨眼反射，从而减少记录中的噪声。</li>
	<li>沿预定切口线皮下注射（s.c.）局部镇痛药布比卡因/利多卡因（布比卡因0.1 mg/mL，利多卡因0.4 mg/mL，皮下注射0.1 mL），以最大限度减少手术不适。可根据机构指南替换药物及给药方案。</li>
	<li>在颈部皮下注射（s.c.）抗胆碱能药物阿托品（硫酸阿托品氨基，0.1 mg/mL，20 μL，溶于PBS中），以减少黏液分泌并促进呼吸。可根据机构指南替换药物及给药方案。</li>
</ol>
2. 耳聋前声学听觉脑干反应（aABR）
注意：aABR 用于测量耳聋处理前后的听力状态。测试在左耳进行，且需在隔音并屏蔽电磁干扰的屏蔽室内完成。我们建议右利手操作者对左耳进行测试及后续的植入手术。有关小鼠 ABR 的更多细节可参见13,14。ABR 记录使用 Tucker Davis Technologies（TDT）的硬件和软件（BioSig），但也可使用其他系统。
<ol>
	<li>用声学泡沫堵塞对侧（右）耳，以隔离同侧（左）耳的听觉脑干反应（ABR）。将泡沫装入1 mL注射器中，并注入小鼠右耳道，使泡沫完全覆盖整个耳道（泡沫量为0.1–0.2 mL）。确保注射器与耳道口紧密贴合，使泡沫充分进入耳道深处。</li>
	<li>将扬声器置于距离左耳10 cm处。 
	注意：本实验装置中的扬声器使用PCB麦克风进行校准，校准方法见参考文献15。</li>
	<li>用70%乙醇溶液清洁ABR电极。将电极置于皮下：有源电极（Ch1）置于颅顶，参考电极（-）置于同侧耳廓下方，接地电极置于后肢（图1）。</li>
	<li>通过光纤接口将前置放大器和头戴式放大器连接至听觉处理器。</li>
	<li>检测有源电极和参考电极的阻抗。
	<ol>
		<li>若阻抗超过3欧姆，需重新调整电极位置并重新测量。当两个电极阻抗相等时，可获得最佳记录效果。关闭隔音屏蔽室。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在自由场条件下，使用复合听觉处理器及配套软件呈现短声刺激并记录ABR信号。在软件中标准化短声刺激参数：采用持续时间为0.1 ms的单通道单相短声，刺激频率为21 Hz；刺激强度从90 dB SPL以10 dB为步长递减至10 dB SPL；记录时间窗为10 ms。在每个dB水平下平均叠加512次反应信号。</li>
	<li>使用自主编写的Matlab脚本在离线状态下对记录信号施加2,000 Hz低通滤波和300 Hz高通滤波，以降低噪声干扰。</li>
	<li>将ABR阈值确定为能够识别出清晰ABR波形反应的最低dB水平（图2，图3）。</li>
</ol>
3. 手术
注意：常用的器械包括剪刀、手术刀、直头或弯头金属镊子、组织牵开器、多个吸液楔形头以及可吸收纸尖。手术在左耳进行。
<ol>
	<li>将小鼠置于其右侧，避免颈椎受到过度扭转应力。确保身体保持平直，以维持呼吸道通畅。</li>
	<li>使用剪刀（或剃刀）剪除左耳后方的毛发，暴露皮肤。用70%乙醇溶液和聚维酮碘（碘伏）对皮肤进行消毒。</li>
	<li>在显微镜放大16倍的条件下，用手术刀做一道1–1.5 cm的耳后切口。</li>
	<li>切换至更高倍数的显微镜放大（25倍）。</li>
	<li>使用镊子钝性分离厚度不一的皮下脂肪层。 
	注意：解剖时需格外小心，因为颈外静脉横穿此区域。损伤该结构可能导致大量出血。</li>
	<li>牵开胸锁乳突肌，暴露鼓泡骨膜。以面神经作为关键解剖标志，辅助识别听泡。面神经绕过胸锁乳突肌的后/背侧边缘，并沿耳道向前延伸至耳廓。将自持式牵开器轻柔置入切口，以方便暴露听泡（图4）。</li>
	<li>清除听泡背内侧区域上方的组织，清晰显露听泡与乳突之间的骨嵴。</li>
	<li>轻轻旋转30 G针头，在骨嵴的后上方穿刺听泡并造孔（听泡开窗）；该侧骨壁较薄。也可使用牙科手术钻完成此步骤。 
	注意：如需要，此步骤及后续操作可在更高倍数的显微镜下（40倍）进行。必要时可调整显微镜位置，以最大程度地暴露中耳腔视野。</li>
	<li>使用精细镊子夹取小块骨片，逐步扩大听泡开窗，以暴露中耳腔。将开窗向背侧延伸至乳突，直至圆窗龛上方骨质完全清除。鼓索动脉（为颈内动脉分支）走行于圆窗龛腹侧。
	<ol>
		<li>操作时需避免损伤该血管，以防大出血导致死亡。少量出血可通过将一小块明胶海绵（spongostan）压入内耳腔止血。</li>
		<li>将听泡开窗向前上方延伸，以暴露与卵圆窗相连的听小骨——镫骨。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用镊子移除镫骨，暴露卵圆窗。</li>
</ol>
4. 圆窗给药耳毒性药物
<ol>
	<li>使用钝化的30 G针头轻轻穿刺圆窗和卵圆窗膜。检查是否有外淋巴液流出。</li>
	<li>通过卵圆窗缓慢灌注用PBS溶解的0.05%（质量/体积）新霉素溶液（调节至pH 7.4）。液体应从圆窗流出。在圆窗重复相同操作。注意避免灌注针头损伤窗部骨性结构。</li>
	<li>将一小块（1 mm2）浸有新霉素的明胶海绵置于圆窗和卵圆窗凹陷处。</li>
	<li>移除牵开器工具，缝合切口并等待30分钟。</li>
</ol>
5. 耳聋后声学听性脑干反应（ABR）
<ol>
	<li>以与耳聋前相同的方式记录 aABR（步骤 2.2 至 2.8）（图 2b，图 3）。</li>
</ol>
6. 耳蜗植入电极阵列的插入
注意： 耳蜗内电极阵列由四个铂金环带组成（&#216;0.2 mm）的铂/铱合金聚对二甲苯绝缘导线，外层包裹硅胶管（图5).
<ol>
	<li>将牵开器工具放入切口以重新暴露鼓泡。</li>
	<li>将电极阵列插入圆窗（鼓阶），插入深度以第4个电极为准th 铂金环位于圆窗内侧稍处，插入深度约为 2 mm，对应耳蜗内的位置约为 30 kHz16.</li>
	<li>将导线盘绕在鼓室内，并用胶水将导线固定在鼓室上方的组织上。盘绕导线有助于在整个实验过程中保持电极阵列的位置稳定。</li>
	<li>小心移除牵开器，并用组织胶封闭切口。</li>
	<li>在颈部做一垂直于主动电极与参考电极（ABR电极）连线方向的小切口（0.5 mm）。将铂金接地球电极置入皮下口袋中，并用组织胶封闭小切口。图6).</li>
	<li>将电极阵列板连接至动物刺激器平台。</li>
</ol>
7. 电诱发听觉脑干反应（eABR）
注意：使用动物刺激平台（ASP）对电极阵列进行电刺激。也可使用其他电流源和软件系统。
<ol>
	<li>按照之前的方法放置ABR电极（步骤2.3至2.5）（图6）。</li>
	<li>打开ASP软件并定义电脉冲刺激范式。我们采用电荷平衡的双相脉冲，每相持续50 μs，相间间隔10 μs，刺激频率为23.3次/秒（pps）。电刺激以单极电极构型施加，并逐步增加电流强度。在每个电流强度下，共平均400次反应。</li>
	<li>通过TDT前置放大器、放大器和听觉处理器持续呈现电脉冲序列，并记录诱发的eABR反应。</li>
	<li>使用自编的matlab脚本绘制和分析eABR数据（图7）。该脚本及一段示例记录数据见于补充材料中。</li>
</ol>
8. 实验结束
<ol>
	<li>实验结束后，根据机构指南对动物实施安乐死。</li>
	<li>小心打开切口，取出植入物。</li>
	<li>将电极阵列置于蒸馏水中超声处理 10 分钟，以去除组织残留物。 
	注意：如果电极完好且导电正常，则该植入物可重复使用多次。检测方法为：在电极阵列干燥状态下，使用万用表测量其阻抗。</li>
	<li>将电极阵列存放在干燥处。</li>
</ol>

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</ol>

不存在竞争性财务利益。作者无任何需要披露的内容。

本文描述了小鼠急性致聋和耳蜗植入的手术方法，以及通过听觉脑干反应对人工耳蜗刺激进行的功能评估。尽管小鼠耳蜗体积较小，手术具有挑战性，但人工耳蜗小鼠模型是可行的，并在听觉研究中具有重要价值。
在小鼠的中耳内存在镫骨动脉。该动脉从鼓室后内侧进入，经圆窗隐窝下方走行，随后上行至卵圆窗隐窝。在小鼠模型建立初期，我们在暴露鼓室过程中因损伤镫骨动脉而导致术中致命性出血。因此，我们调整了手术策略，采用更为保守的方法，通过更小、更精细的解剖步骤进入鼓室。此后未再观察到因出血引起的并发症。尽管已有研究表明，镫骨动脉电凝对小鼠听力阈值或螺旋神经节细胞数量并无显著影响5，但我们认为，只要在手术过程中保持高度谨慎和专注，结扎该动脉实无必要。我们建议投入足够时间以培养精细的运动技能并达到熟练的技术水平。从初始切口到围绕植入电极阵列完成缝合的平均手术时间通常为1–1.5小时。
在小鼠中描述的急性耳蜗植入手术与在其他啮齿动物（包括大鼠和沙鼠）中使用的&#34;腹侧&#34;手术方式及圆窗插入法相似20,21,22。其他啮齿动物研究则采用&#34;背侧入路&#34;，通过耳蜗基转造口而非圆窗插入，从而完全避开前庭阶（SA），并实现更深度的电极阵列插入6,23,24。在小鼠中植入慢性刺激装置的步骤与本方案所述基本相同，仅需额外使用涤纶网片固定植入物，并加强术后护理5。
在小鼠中进行耳蜗植入手术时，主要的技术挑战在于小鼠耳蜗相对于大鼠和沙鼠的耳蜗尺寸较小，以及存在较大的球囊（SA）。球囊在大鼠中也存在，但在沙鼠中不存在。此外，由于小鼠体型比大鼠和沙鼠更小，因此对手术操作更为敏感，更容易受到手术创伤的影响。
为了消除eABR记录中的电致听觉反应，并模拟大多数人工耳蜗（CI）使用者中存在的毛细胞丢失情况，我们在植入人工耳蜗前对动物进行了耳毒性致聋处理。在活体小鼠中通过药物实现完全致聋较为困难25，因为氨基糖苷类药物引起耳毒性的系统性浓度具有较窄的剂量窗口：连续多日给予较低剂量不会导致毛细胞丢失，而单次给予较高剂量则可能致死26。此外，不同品系小鼠对氨基糖苷类药物的敏感性存在差异26。然而，已有研究表明，在CBA/CaJ小鼠中单次给予氨基糖苷类药物联合袢利尿剂，可在无致命后果的情况下引起广泛的外毛细胞丢失27。在所检查的所有耳蜗中，有一半被报道出现了延迟的内毛细胞死亡27。
在本研究中，我们采用了局部应用氨基糖苷类抗生素新霉素的方法，该方法借鉴了近期在C57BL/6小鼠中建立的实验方案5。急性应用新霉素使听觉诱发反应阈值显著升高了46 dB ± 6.1。尽管这一增幅高于Irving et al. 报道的35 dB增幅（术前与术后：41.6 dB ± 3.3 vs 76.6 dB ± 4.4，p = 0.02，n = 3）5，但我们达到了相似的耳聋后听阈（75.7 dB ± 3.7 vs 76.6 dB ± 4.4）。0.05%的新霉素被认为主要导致听力部分丧失，其机制主要是外毛细胞快速死亡，而内毛细胞的损失需要更长时间才会发生27。因此，在尚存部分听力的耳聋动物中，由内毛细胞和外毛细胞共同产生的电听觉反应可能仅被部分消除4,8,9,10,11,12。尽管0.05%（质量/体积）的新霉素在耳聋后4周内不会减少螺旋神经节神经元的数量5，但在我们的急性实验条件下，尚不清楚新霉素是否会影响听觉神经纤维或促进突触病变（即内毛细胞与I型听觉神经纤维之间突触的丢失）。另一个不确定性在于，局部应用新霉素可能导致耳蜗全长范围内的毛细胞损失分布不均。未来的研究需要解答这些问题。
总之，随着人类耳聋遗传模型的日益增多以及可用的生化工具不断丰富，小鼠已成为听觉研究（包括人工耳蜗领域）中一种极具吸引力的动物模型。

人工耳蜗（CIs）是一种电子设备，可为重度至极重度听力损失患者提供听觉感知。该设备通过手术将电极植入内耳的耳蜗，直接刺激听觉神经。迄今为止，人工耳蜗是最成功的感觉假体，已在全球帮助超过60万名患者1。然而，该设备仍存在不足之处：首先，不同使用者从设备中获得的效益差异显著；其次，大多数人工耳蜗使用者在噪声环境中的言语识别以及对音乐的感知能力仍然较差。
多年来，动物模型已被用于更好地理解人工耳蜗研究中的这些问题，并持续改进设备的安全性和有效性。这些模型为多种现象提供了宝贵的见解，例如人工耳蜗植入后大脑发生的可塑性变化2、应用基因治疗以保留残余听力的效果3，以及电刺激听觉神经的生物物理特性4等众多实例。
小鼠是一种强大的模式生物，因为存在大量可用于耳聋研究的遗传模型。其他优势还包括能够对小鼠基因组进行操作（例如, 通过CRISPR-Cas系统）、利用先进成像技术研究机制的机会，尤其是在大脑中的应用，以及其高繁殖率、快速发育、易于繁殖和操作等优势。在小鼠中实施耳蜗植入手术的主要技术挑战在于耳蜗体积小，以及存在一条较大的镫骨动脉（SA）。该动脉在人类胚胎发育过程中通常会消失，但在包括小鼠、大鼠和沙鼠在内的多种啮齿类动物中终生存在。镫骨动脉走行于圆窗龛下方，这使得进入耳蜗的通路变得复杂，并增加了手术风险。
先前的研究已表明在小鼠中进行人工耳蜗植入的可行性5,6,7欧文等&#160;al. 证明了耳蜗内慢性电刺激可维持长达一个月。虽然也进行了急性刺激，但未展示相关记录结果。他们表明，烧灼镫骨动脉对听力阈值或螺旋神经节神经元数量均无显著影响，且局部应用氨基糖苷类抗生素新霉素（一种耳毒性药物）可有效实现小鼠的耳聋模型建立。5Soken 等人描述了一种改良的经圆窗入路至小鼠耳蜗的背侧手术方法，以更好地保留听力状态6插入铂铱合金丝后，观察到明显的残余听力，听觉脑干反应（ABR）阈值升高28 dB。在ABR阈值显著升高的动物中，耳声发射（OAE）消失。6米斯特里 等人测试了在无电刺激情况下植入的功能性和组织病理学效应7尽管在3个月和6个月大的植入小鼠中低频听力得以保留，但植入物周围出现了类似纤维化的组织，且在开窗部位周围发生了骨生成。7.
简而言之，在关于小鼠人工耳蜗植入（CI）的三项研究中，仅有一项展示了对CI刺激的功能性记录。欧文（Irving）及其同事进行了急性与慢性电听觉脑干反应（eABR）记录，但仅展示了来自慢性CI刺激的数据5。然而，欧文等人开发的带有完全可植入装置的慢性模型在技术上具有挑战性。目前尚不清楚操作难度更低、耗时更短的急性CI刺激是否能够达到类似的效果。
人工耳蜗（CIs）适用于重度至极重度听力损失且无法再从助听器中获益的患者。因此，当使用正常听力动物建立人工耳蜗使用者的动物模型时，应包括致聋操作。另一个对听力动物进行致聋的原因是，对聋耳或听力耳蜗的电刺激会产生不同的神经反应4,8,9,10,11,12。对聋耳耳蜗的电刺激可直接激活听觉神经纤维，产生电-神经反应（α），其特征为潜伏期短、外周动态范围小8,10。相反，对听力耳蜗的电刺激还会通过电听觉反应（β）激发毛细胞，其特征为潜伏期较长、动态范围较大4,11。电听觉反应归因于内毛细胞对神经纤维的正常兴奋、外毛细胞的电诱导收缩以及行波的产生4。电-神经反应和电听觉反应在中枢神经系统中也会导致两种不同的活动模式9。Sato 等人在新霉素致聋前后记录了植入人工耳蜗的豚鼠中脑神经元的活动，该处理可消除电听觉成分的贡献。他们发现，在致聋条件下，放电率-强度函数的斜率更陡峭，且神经元放电率高于听力状态9。因此，根据具体的研究问题，有必要考虑进行致聋处理，以区分听觉神经电刺激过程中产生的电听觉反应和电-神经反应。
本文描述了小鼠急性致聋、耳蜗内电极阵列植入以及通过电诱发听觉脑干反应（eABR）记录耳蜗内电刺激功能的实验方法。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;硬件&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>隔音室</td><td>IAC Acoustics, Winchester, UK</td><td>Mac-2 Enclosure RF Shielded Box 2A</td><td></td></tr><tr><td>MF1 扬声器</td><td>Tucker Davis Technologies (TDT), FL, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PCB 麦克风</td><td>PCB Piezotronics, Inc, NY, USA</td><td>Model 378C01</td><td></td></tr><tr><td>低阻抗前置放大器</td><td>TDT, FL, USA</td><td>RA4LI</td><td></td></tr><tr><td>Medusa 前置放大器</td><td>TDT, FL, USA</td><td>RA4PA</td><td></td></tr><tr><td>RZ6 听觉处理器</td><td>TDT, FL, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>动物刺激平台</td><td>ASP, Oticon Medical, Nice, France</td><td></td><td></td></tr><tr><td>万用表</td><td>Fluks</td><td>#115</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;手术设备&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>闭环加热垫</td><td>FHC, Inc. ME, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>眼药膏</td><td>Alcon, CH</td><td>Lacrinorm Augengel</td><td></td></tr><tr><td>吸音泡沫</td><td>Otoform Ak, Dreve Otoplastik GmbH</td><td>#464</td><td></td></tr><tr><td>一次性皮下针电极</td><td>Horizon, Rochester Electro-Medical Inc.</td><td>S83018-R9, 27G</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>自持式牵开器（Mini Collibri Retractor）</td><td>Fine Science Tools</td><td>#17000-01</td><td></td></tr><tr><td>吸引楔形片</td><td>Agnthos, SE</td><td>#42-886-460</td><td></td></tr><tr><td>可吸收纸尖（中号）</td><td>WPI, FL, USA</td><td>#504182</td><td></td></tr><tr><td>耳蜗内电极阵列</td><td>Bionics Institute, Melbourne, Australia</td><td>4 通道</td><td></td></tr><tr><td>Spongostan 标准止血海绵</td><td>Ferrosan Medical Devices</td><td>#MS0002</td><td></td></tr><tr><td>组织胶水，Loctite 4161 Superbond</td><td>Henkel</td><td>Part No 19743</td><td></td></tr><tr><td>动物刺激平台（ASP）</td><td>Oticon Medical, Nice, France</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;药物/化学品&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>氯胺酮（Narketan）</td><td>Provet AG, CH</td><td>100mg/mL, #VQ_320265</td><td></td></tr><tr><td>赛拉嗪（Rompun）</td><td>Provet AG, CH</td><td>注射用 2%，#1315</td><td></td></tr><tr><td>布比卡因</td><td>Compendium, CH</td><td>Bupivacain Sintetica 注射用 0.5%</td><td></td></tr><tr><td>阿托品（Atropinesulfat Amino）</td><td>Amino AG, CH</td><td>1 mg/mL</td><td></td></tr><tr><td>聚维酮碘（Betadine）</td><td>Provedic, CH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>新霉素（Neomycin trisulfate salt）</td><td>Sigma</td><td>N1876-25G, Lot#WXBB7516V</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;软件&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BioSigRZ</td><td>TDT, FL, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Matlab</td><td>MathWorks, MA, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ASP 软件</td><td>Oticon Medical, Nice, France</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

c57bl/6小鼠的耳蜗植入手术及电诱发听觉脑干反应记录

Cochlear Implant Surgery and Electrically-evoked Auditory Brainstem Response Recordings in C57BL/6 Mice

人工耳蜗（CIs）是一种神经假体装置，能够为聋人提供听觉感知。然而，人工耳蜗无法恢复听觉的全部功能。若要使人工耳蜗使用者能够感知音乐，并在更自然的环境中听清声音（例如在有竞争性说话声、反射声和其他背景噪声的情况下分辨语音），则需要进一步改进植入技术。为了深入理解耳蜗内电刺激的机制及其在整个听觉系统中的响应，必须借助实验动物进行研究。由于存在大量可用的遗传模型，小鼠正成为越来越有吸引力的研究模型。然而，该物种作为人工耳蜗研究模型的应用仍十分有限，主要原因是难以植入微型电极阵列。因此，有关手术操作的更多详细信息对于拓展小鼠在人工耳蜗研究中的应用具有重要意义。
在本报告中，我们详细描述了在C57BL/6小鼠品系中进行急性致聋及耳蜗植入电极阵列的实验方案。我们通过电诱发听觉脑干反应（eABR）展示了该操作的功能有效性，并展示了面神经刺激的示例。最后，我们还讨论了在使用正常听力动物时加入致聋步骤的重要性。该小鼠模型为研究与人工耳蜗使用者相关的遗传和神经生物学机制提供了有力的研究平台。

本研究旨在描述一种用于耳聋小鼠急性人工耳蜗刺激的可靠模型。术前和术后的听力阈值作为耳聋处理效果的功能性读数。在卵圆窗和圆窗局部应用0.05%的新霉素后，声诱发听力阈值显著升高了46 dB ± 6（术前与术后新霉素处理：30.0 dB ± 3.8 vs 75.7 dB ± 3.7，p = 0.0003，配对t检验，n = 7）（图3）。随后将适用于小鼠尺寸的电极阵列插入圆窗（图4，图5）。对耳蜗内电极进行电刺激可稳定地诱发eABR活动（图7）。在某些情况下，人工耳蜗刺激会激活面神经，产生具有短潜伏期或长潜伏期的高幅波形（分别为图8A和图8B）。短潜伏期反应表现为约3 ms时IV波的快速增强，可能为面神经的直接反应；长潜伏期反应出现在约5–6 ms，可能为面神经间接诱发的非听觉性肌肉（肌源性）反应。尽管在动物研究中鲜有文献报道面神经反应，但其在人类人工耳蜗使用者中是一种广为人知的并发症17,18,19。在 图8中，面神经刺激出现在相对中等电流水平（150–200 μA），且见于两只不同的动物。在其他情况下，两种反应可在同一只动物中于极高电流水平下同时出现（未显示）。我们建议将刺激电流控制在面神经激活阈值以下。
<img alt="神经科学实验示意图：动物刺激器平台、前置放大器、隔音装置。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58073/58073fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 1"> 
图1：听觉脑干反应（ABR）实验装置。 将皮下电极置于麻醉小鼠的头顶（活动电极/通道1 [Ch1]）、同侧耳后（参考电极 [Ref]）和后肢（接地电极 [Gnd]）。电极信号经放大后由TDT系统记录。声学刺激通过麦克风传递，电刺激则通过动物刺激器平台传递。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58073/58073fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="听觉脑干反应，比较正常听力与耳聋的波形图，不同声压级下的波形。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58073/58073fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 2"> 
图 2：野生型小鼠在使用 0.05% 新霉素致聋前后对点击刺激的代表性 aABR 波形。 （A）正常听力的 aABR 模式表现为标记为 I-V 的波形，且听阈较低，此处为 30 dB SPL（箭头所示）。 （B）耳聋后的 aABR 模式显示听阈升高，此处为 70 dB SPL（箭头所示）。 波形潜伏期延长，时间抖动增加。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58073/58073fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="ABR 阈值分析；散点图；治疗前与治疗后听觉测量比较。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58073/58073fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 3"> 
图 3：耳聋处理前后的aABR阈值。 新霉素的应用使aABR阈值显著升高了46 dB ± 6。使用新霉素前与使用后相比：30.0 dB ± 3.8 vs 75.7 dB ± 3.7，p = 0.0003，配对t检验，n = 7。误差项为均值的标准误。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58073/58073fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的高清版本。</a>
<img alt="内耳解剖：标注了圆窗和卵圆窗的耳蜗结构显微图像" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58073/58073fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图4"> 
图4：手术过程。 (A) 暴露听泡。在鼓室听泡的脊部（黑色虚线）沿听泡开窗（白色虚点圆圈）进行。B鼓室造瘘术可暴露圆窗、镫骨动脉和卵圆窗。先用新霉素轻柔冲洗卵圆窗，再冲洗圆窗。C) 将电极阵列插入，直至第4个th 电极位于圆窗凹窝内侧。在关闭切口前，将电极导线盘绕于鼓泡内以固定电极阵列。CN VII = 第Ⅶ脑神经（面神经），OW = 卵圆窗，RW = 圆窗，SA = 镫骨动脉，SCM = 胸锁乳突肌，TB = 鼓泡。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58073/58073fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="用于分析流体动力学的微流控芯片与通道示意图；比例尺突出显示精度。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58073/58073fig5.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 5"> 
图 5：小鼠耳蜗植入体。（A）耳蜗内电极阵列由四个铂金环带组成，间距为 0.4 mm，直径 d：0 [尖端]（d=0.21），1（d=0.23），2（d=0.25），3（d=0.27）。每个电极的宽度为 0.2 mm。四根铂铱（90/10）帕里林绝缘导线被包裹在硅胶管中。（B）电极阵列尖端（红色虚线框）的放大图。电极阵列和一个铂金参考球连接至印刷电路板。比例尺 = 1 mm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58073/58073fig5large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="啮齿类动物神经记录装置，Cl阵列连接用于电生理测量。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58073/58073fig6.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图6"> 
图6：电诱发听性脑干反应（eABR）装置示意图。 人工耳蜗铂金接地球电极（Gnd，红色）置于小鼠颈部皮下袋中。活动电极（Ch1(+)，位于头顶）与参考电极（Ref(-)，位于同侧耳部）之间的连线应与电极阵列和接地电极之间的连线垂直，以获得最佳的eABR反应。eABR接地电极（Gnd，黑色）置于后肢。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58073/58073fig6large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="神经信号分析，脑电图波形，示意图，电生理学研究，数据振幅，时间尺度" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58073/58073fig7.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图7"> 
图7：耳聋小鼠对人工耳蜗刺激的代表性耳蜗微音电位（eABR）波形。 以单极配置向电极#1施加双相脉冲序列，脉冲频率为23.3脉冲/秒（pps），重复400次。刺激强度0-175 μA 如图所示 25 μA 步骤（刺激细节参见步骤7.2）。罗马数字表示eABR波的序号。随着电流强度的增加，波幅增大，潜伏期缩短。本示例中，波II出现在约1 ms，波III出现在约2 ms，波IV出现在约3 ms, 波V约4毫秒. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58073/58073fig7large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="电生理波形、信号记录示意图、膜电位分析、1 µV 标尺" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58073/58073fig8.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图8"> 
图8：面神经刺激示例。 在某些情况下，人工耳蜗（CI）刺激可能激活面神经，引发潜伏期较短的直接反应（A）（箭头）或潜伏期较长的间接反应（B）（箭头）。图中示例来自两只植入人工耳蜗的动物，刺激方式为双相脉冲序列，电流强度以50 μA为步长，从0至300 μA逐步增加（刺激参数详见步骤7.2）。罗马数字表示电诱发听性脑干反应（eABR）的波序编号。* 表示由于放大器饱和导致eABR波形被截断。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58073/58073fig8large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

耳蜗植入物的动物模型有助于增进对利用电刺激治疗永久性感音神经性听力损失的技术基础的认识。本研究介绍了一种在小鼠中进行急性致聋和耳蜗植入电极阵列的手术方案，以及通过听觉脑干反应进行功能评估的方法。

C57BL/6小鼠的耳蜗植入手术及电诱发听觉脑干反应记录

人工耳蜗（CIs）是一种神经假体装置，可为聋人提供听觉感知。然而，人工耳蜗无法恢复听力的全部方面……

耳蜗植入物的动物模型有助于增进我们对利用电刺激治疗永久性感音神经性听力损失的技术基础的理解。本方案展示了小鼠的急性致聋与耳蜗植入手术，以及通过听觉脑干反应对耳蜗植入刺激进行的功能性评估。在小鼠中进行耳蜗植入手术的一些主要挑战在于耳蜗体积较小，以及圆窗龛附近存在较大的镫骨动脉。为测量正常听力状态，将声学泡沫装入1毫升注射器中，向一只8至12周龄的C57 black 6小鼠的对侧耳道内注入100至200 µL泡沫，以隔离同侧耳的听觉脑干反应，注意注射器应紧密封闭耳道，确保泡沫完全注入耳道深处。接着，将扬声器置于同侧耳10 cm处，并用70%乙醇清洁aVR电极。将参考电极置于同侧耳廓下方的皮下，活动电极置于头顶皮下。将接地电极置于后肢的皮下。通过光纤接口将头戴式放大器和前置放大器连接至听觉处理器。检测有源电极和参考电极的阻抗。当电极显示的阻抗相同时，关闭隔音室并给予咔嗒声刺激。在自由场条件下，使用适当的复杂听觉处理器和软件记录 aVR。将点击刺激标准化为单通道单相脉冲，脉冲时长0.1毫秒，以21赫兹频率呈现，声压级从90分贝逐步降低至10分贝，每次递减10分贝，记录时间窗为10毫秒。随后确定aVR阈值，即能够识别出明显aVR波反应的最低分贝水平。为诱导耳聋，将小鼠置于右侧体位，注意保持身体平直，以确保气道通畅。剪除同侧耳后方的毛发，并依次使用70%乙醇溶液和聚维酮碘溶液擦洗暴露的皮肤进行消毒。将动物置于解剖显微镜下，使用16倍物镜和手术刀在耳后做一至一点五厘米的切口。在25至40倍放大倍数下，用镊子钝性分离暴露的皮下脂肪层，并牵开胸锁乳突肌，以暴露鼓泡骨膜。面神经绕过胸锁乳突肌后背侧边缘，并沿耳道向耳廓方向前行。以面神经作为识别听泡的解剖标志，轻柔地将自持式牵开器置入切口，以暴露听泡。清除覆盖在听泡内背侧区域的组织，清晰显露听泡与乳突之间的骨嵴，并将一根30号针头轻轻旋转刺入听泡，于骨嵴后上方位置钻出一个小孔。用尖头镊子夹住小块骨片，扩大耳蜗开窗，直至暴露中耳腔。然后将孔向后上方延伸至乳突，直至圆窗龛上方的骨质完全清除。最关键的步骤是制备圆窗龛。操作时务必小心谨慎，以免损伤镫骨动脉。在避免损伤镫骨动脉的前提下，向前上方扩大耳囊开窗，以暴露与卵圆窗相连的中耳听小骨——镫骨。随后去除镫骨，以暴露卵圆窗。为了施加耳毒性药物，使用钝化的30号针头轻轻穿刺圆窗和卵圆窗膜，确认有外淋巴液流出。然后使用装有30号针头的1毫升注射器，通过卵圆窗缓慢灌注0.2毫升含5%（重量/体积）新霉素的PBS溶液。当全部药液注入后，将溶液大量灌入圆窗，注意避免损伤窗部的骨性结构。将浸泡过新霉素的1平方毫米大小的明胶海绵块分别置于圆窗和卵圆窗凹陷处。然后撤去牵开器并缝合切口，并在30分钟后记录植入后的耳蜗前庭诱发肌源性电位（aVR）结果。为插入人工耳蜗电极阵列，需将牵开器重新置入切口以再次暴露鼓室，将电极阵列插入鼓阶，插入深度应使阵列的第四个铂金环恰好位于圆窗内侧。电极阵列的插入也可能具有挑战性。因此，请耐心使用一把镊子引导导线，另一把镊子插入阵列，以找到合适的插入角度。将导线在鼓室内盘绕，并用胶水将导线固定在鼓室上方的组织上。仔细移除牵开器，用组织胶封闭插入部位后，使用手术刀在颈部做一处0.5毫米的切口，切口方向垂直于即将放置有源电极和参考aVR电极位置之间的连线。将接地球电极置入切口，并将电极阵列板连接至动物刺激平台。为执行电aVR操作，请按照先前演示的方式放置电极，并打开动物刺激平台软件。然后定义电脉冲刺激范式，并通过TBT前置放大器、前置放大器和听觉处理器连续记录经电脉冲刺激诱发的aVR反应。术前和术后听力阈值可作为耳聋处理效果的功能性读数。在卵圆窗和圆窗局部应用5%新霉素可显著提高点击诱发的听力阈值。耳聋后对耳蜗内电极进行电刺激，可稳定地诱发电刺激性 aVR 活动。在某些情况下，人工耳蜗刺激会激活面神经，产生高幅波形，其潜伏期较短者约在三毫秒左右，表现为 Wave III 迅速增强，可能为面神经的直接反应；而潜伏期较长者出现在五至六毫秒左右，可能为面神经间接诱发的非听觉性肌源性反应。本研究证实，尽管人工耳蜗体积较小且手术难度较高，小鼠人工耳蜗植入模型仍具有可行性。在进行该操作时，重要的是要考虑采用一种严格的方案，以消除aVR记录中的任何电声反应，并模拟大多数人工耳蜗使用者中存在的毛细胞丧失情况。总之，随着人类耳聋的遗传模型数量不断增加，以及小鼠中可用的生物医学工具日益丰富，小鼠已成为包括人工耳蜗研究在内的相关工具研究中极具吸引力的动物模型。

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一种用于多区域体内记录的灵活便捷电生理光导电极的集成制备方法

学习C57BL/6小鼠耳蜗植入术与电唤起脑干反应记录方法，用于研究感音神经性听力损失的电刺激治疗。该手术方案包括急性致聋、电极植入及功能评估，为人工耳蜗技术提供可靠的动物模型。

C57BL/6小鼠的耳蜗植入手术及电诱发听觉脑干反应记录

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