Name: 骨再生生物材料的生物相容性曲线 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 28 s
Description: 了解骨再生生物材料的生物相容性评估策略，通过体外和体内技术预测材料有效性及免疫反应。该多学科平台为骨科生物材料的临床前筛选提供重要参数。

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本研究项目获得了欧盟第七个框架计划（FP7/2007-2013）资助，资助协议编号为263363。

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作者无任何利益冲突需要披露。

在此，我们展示了一种多学科方法，用于对代表性骨再生与修复生物材料进行临床前生物相容性评估。我们检测了成骨细胞（OB）、破骨细胞（OC）以及免疫系统对这些材料的反应。 体内 在小鼠关键骨缺损模型中的愈合反应以及 体外 和 体内 免疫反应。本文旨在展示这些检测方法的操作流程，并总结从生物材料检测中获得的数据与结论。结果表明，本研究策略能够生成有价值的骨生物材料生物相容性谱型。
采用原代细胞实验评估成骨细胞（OB）和破骨细胞（OC）功能。OB 负责骨形成及生理性修复，必须保持活性，并能够分化和诱导矿化。本研究展示了如何开展细胞活力、碱性磷酸酶（ALP）和茜素红 S（ARS）染色实验，以检测具有矿化能力的生理性分化细胞。实验设置两种对照：仅含培养基的对照组用于提供基线值，成骨矿化培养基（MM）对照组则用于在塑料培养表面优化 OB 的分化与矿化，后者作为生物材料的参照标准。对于 OC 的评估，我们共培养 OB 与骨髓来源的 OC 前体细胞，诱导前体细胞分化为多核细胞，并使用抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色，该酶是广泛用于鉴定 OC 的破...

骨修复是一个复杂的过程，始于血肿形成、炎症、骨痂形成，随后是重塑阶段。1,2然而，骨再生能力受限于骨折的大小1,3例如，由创伤、癌症或骨质疏松引起的大型骨骨折可能无法愈合，被称为骨不连骨折。这些骨病变通常需要治疗以促进正常的生理性骨修复与再生。目前，自体骨移植和同种异体骨移植是首选的治疗方法4 每年进行约220万例骨替代手术5尽管这些手术的成功率较高，但仍可能存在一些并发症，例如骨源有限、感染、供体部位并发症以及排斥反应4为应对这些挑战，人们正在寻求骨组织工程的新替代方案。
基于天然或合成聚合物、生物陶瓷或金属，并结合细胞和生物活性分子的生物材料设计正在迅速发展6。目前对生理性骨愈合以及在生物材料作用下的骨愈合过程的理解，依赖于多种因素，包括材料的机械性能，以及来自循环系统和骨折部位的多种局部和全身性因素7,8,9。用于骨再生的生物材料旨在促进成骨性和骨整合10，理想情况下应具备生物相容性、可生物降解性，并具有多孔结构（以促进细胞迁移、氧气和营养物质的输送）。此外，这些材料还需具备足够的强度以支撑骨折部位，缓解疼痛。同时，需要适当的炎症因子来启动愈合过程。然而，如果生物材料引发过度的炎症反应或过敏反应，则可能限制甚至抑制骨愈合11,12。因此，有必要采用跨学科方法来评估用于骨修复的生物材料。
本研究中，我们对代表性材料进行临床前评估：1）Orthovita Vitoss 泡沫，一种市售的松质骨替代材料，由纳米级纯β-磷酸三钙（β-TCP）构成 &#946;磷酸三钙 (&#946;-磷酸三钙（β-TCP）颗粒和I型牛胶原（C）（&#946;β-TCP/C 泡沫）和 2） &#946;β-TCP圆盘。在此，我们通过原代成骨细胞（OB）和破骨细胞（OC）实验，说明这些生物材料的生物相容性测试，以及一种 在体内 骨修复模型，以及包含免疫学评估的综合性分析 体外 T淋巴细胞增殖和细胞因子产生，以及 在体内 免疫原性和致敏性，如先前报道的那样13.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;生物材料&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&amp;beta;-磷酸三钙圆盘（&amp;beta;β-TCP，14 mm</td><td></td><td></td><td>将圆盘置于马弗炉中，在特定温度下进行烧结 1150 &amp;deg;C详细的制备方法可参见 Zimmer 等人（doi: 10.1002/jbm.a.34639）。样品在用于细胞培养前需经紫外线照射（每侧 15 分钟）。</td></tr><tr><td>Orthovita Vitoss 泡沫&amp;beta;β-TCP/C 泡沫</td><td>Orthovita</td><td>2102-1405</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;小鼠成骨细胞培养&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>茜素红 S</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5533</td><td></td></tr><tr><td>ALP 检测缓冲液（2x），pH 10.4</td><td></td><td></td><td>将200 mM甘氨酸、2 mM氯化镁、2 mM氯化锌溶解于超纯水中，并调节pH至10。</td></tr><tr><td>骨生长培养基 (BGM)</td><td></td><td></td><td>&amp;alpha;- MEM + 10% 热灭活 FBS + 1% 青霉素/链霉素</td></tr><tr><td>细胞裂解缓冲液：CyQuant 细胞裂解缓冲液 20x 浓缩液</td><td>Thermo Scientific</td><td>C7027</td><td>将浓缩的细胞裂解缓冲液原液用超纯水稀释20倍。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>细胞活力试剂：Presto Blue 细胞活力试剂</td><td>Invitrogen，Thermo Fisher Scientific</td><td>A13261</td><td></td></tr><tr><td>产气荚膜梭菌来源的 IV 型胶原酶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5138</td><td></td></tr><tr><td>DC 蛋白检测试剂盒 II</td><td>Bio Rad</td><td>5000112</td><td>DC 蛋白检测试剂盒包含试剂 A、试剂 B、试剂 S 以及用于参考标准的 BSA。对于试剂 A'，添加 20 &amp;micro;L 试剂S至 1000 &amp;micro;L 试剂A&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>二甲基亚砜（DMSO）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td>使用前对DMSO进行除菌过滤。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Dispase II（中性蛋白酶，II 型）</td><td>罗氏</td><td>4942078001</td><td></td></tr><tr><td>EnzCheck 碱性磷酸酶活性检测试剂盒&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen，Thermo Fisher Scientific</td><td>E12020</td><td>EnzCheck 磷酸酶检测试剂盒包含 6,8-二氟-4-甲基伞形基磷酸盐（DiFMUP）、N,N-二甲基甲酰胺和 6,8-二氟-7-羟基-4-甲基香豆素（DiFMU）。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7524</td><td></td></tr><tr><td>10% 中性缓冲福尔马林溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT501128</td><td></td></tr><tr><td>甘氨酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8898</td><td></td></tr><tr><td>十六烷基吡啶氯化物（西曲氯铵）一水合物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C9002</td><td></td></tr><tr><td>L-抗坏血酸-2-磷酸三镁盐水合物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8960</td><td></td></tr><tr><td>六水合氯化镁</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2670</td><td></td></tr><tr><td>MEM α 培养基（&amp;alpha;-MEM</td><td>Gibco Life Technologies&amp;nbsp;</td><td>11900-073</td><td></td></tr><tr><td>成骨矿化培养基（MM）</td><td></td><td></td><td>&amp;alpha;-MEM + 10% 热灭活 FBS + 1% 青霉素-链霉素 + 50 &amp;micro;g/mL 抗坏血酸 + 5 mM &amp;beta;-甘油磷酸盐</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液 1x (PBS) pH 7.4</td><td>Gibco，赛默飞世尔科技&amp;nbsp;</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Sigmafast BCIP/NBT</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B5655</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA（0.5%），无酚红（10倍浓缩液）</td><td>Gibco，Thermo Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>15400054</td><td>将浓缩的储备液用1×PBS稀释10倍。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Tween20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>超纯水：无热原细胞培养用水</td><td>VWR</td><td>L0970-500</td><td></td></tr><tr><td>洗涤缓冲液</td><td></td><td></td><td>添加&amp;nbsp; 0.05% Tween20 加至 1x PBS</td></tr><tr><td>氯化锌</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1.08816</td><td></td></tr><tr><td>&amp;beta;二水合β-甘油磷酸二钠盐</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5422</td><td></td></tr><tr><td>24孔悬浮培养板</td><td>Greiner bio-one</td><td>662102</td><td></td></tr><tr><td>24孔细胞培养板</td><td>Greiner bio-one</td><td>662160</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 三角锥形管</td><td>Greiner bio-one</td><td>227261</td><td></td></tr><tr><td>96孔黑色板</td><td>Greiner bio-one</td><td>655076</td><td></td></tr><tr><td>96孔透明板</td><td>Greiner bio-one</td><td>655001</td><td></td></tr><tr><td>离心机：VWR Mega Star 600R</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CO2培养箱：HeraCell 240</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2 mL 冻存管</td><td>Greiner bio-one</td><td>122263</td><td></td></tr><tr><td>一次性滤器单元 FP30/0.2 CA-S</td><td>GE Healthcare Life Sciences Whatman</td><td>10462200</td><td>用于酶溶液的无菌过滤。</td></tr><tr><td>平板扫描仪：Epson Perfection 1200 Photo</td><td>Epson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Infinite M200 Pro 微孔板读板仪</td><td>Tecan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>微量离心管：Eppendorf管，安全锁扣，0.5 mL</td><td>VWR</td><td>20901-505</td><td></td></tr><tr><td>微量离心管：Eppendorf管安全锁 1.5 mL</td><td>VWR</td><td>21008-959</td><td></td></tr><tr><td>Shaker Swip（轨道式和水平式）&amp;nbsp;</td><td>Edmund Buehler&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GFL3032 摇床培养箱</td><td>GFL&amp;nbsp;</td><td>3032</td><td></td></tr><tr><td>一次性移液管：血清移液管</td><td>Greiner bio-one</td><td>612301</td><td></td></tr><tr><td>无菌器械（剪刀、镊子、弯头止血钳）</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>组织培养板（10 cm）</td><td>Greiner bio-one</td><td>664960</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;小鼠成骨细胞-破骨细胞共培养&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1&amp;alpha;1,25-二羟基维生素D3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>17936</td><td>1000倍浓缩储备液（10 &amp;micro;M 在100%乙醇中</td></tr><tr><td>丙酮</td><td>VWR Chemicals</td><td>22065.327</td><td></td></tr><tr><td>骨生长培养基（BGM）</td><td></td><td></td><td>&amp;alpha;- MEM + 10% 热灭活 FBS + 1% 青霉素-链霉素</td></tr><tr><td>蒸馏水</td><td>Carl Roth</td><td>3478.4</td><td></td></tr><tr><td>乙醇（100% vol/vol）</td><td>VWR Chemicals</td><td>20821.365</td><td></td></tr><tr><td>乙醇（70% vol/vol）</td><td>VWR Chemicals</td><td>93003.1006</td><td></td></tr><tr><td>快红紫 LB 盐</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F3381</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7524</td><td></td></tr><tr><td>10% 中性缓冲福尔马林溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT501128</td><td></td></tr><tr><td>MEM α 培养基（&amp;alpha;-MEM</td><td>Gibco Life Technologies&amp;nbsp;</td><td>11900-073</td><td></td></tr><tr><td>N,N-二甲基甲酰胺</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4551</td><td></td></tr><tr><td>萘酚AS-MX磷酸盐</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N4875</td><td></td></tr><tr><td>破骨细胞分化培养基（DM）</td><td></td><td></td><td>&amp;alpha;- MEM + 10% 热灭活 FBS + 1% 青霉素-链霉素 + 1 nM 1,25-(OH)2-维生素D3 + 1 &amp;micro;M 前列腺素 E2&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液 1x (PBS) pH 7.4</td><td>Gibco，Thermo Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>前列腺素 E2 (PGE2)</td><td>Cayman Chemical Company</td><td>9003016</td><td>1000倍浓缩储备液（1 mM，溶于100%乙醇）</td></tr><tr><td>三水合醋酸钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7670</td><td></td></tr><tr><td>酒石酸钠二水合物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8640</td><td></td></tr><tr><td>无菌器械（剪刀、镊子、手术刀）</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TRAP 缓冲液 pH 5.0</td><td></td><td></td><td>将40 mM醋酸钠、10 mM酒石酸钠溶于超纯水中，并调节pH至5。</td></tr><tr><td>超纯水：无热原细胞培养用水</td><td>VWR</td><td>L0970-500</td><td></td></tr><tr><td>24孔悬浮培养板</td><td>Greiner bio-one</td><td>662102</td><td></td></tr><tr><td>24孔细胞培养板</td><td>Greiner bio-one</td><td>662160</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 离心管</td><td>Greiner bio-one</td><td>227261</td><td></td></tr><tr><td>离心机：VWR Mega Star 600R</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CO2培养箱：HeraCell 240</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>金刚石切片刀（10.2 cm × 0.3 cm）</td><td>Buehler</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isomet低速锯</td><td>Buehler</td><td></td><td></td></tr><tr><td>培养皿（6 cm）</td><td>Greiner bio-one</td><td>628,161</td><td></td></tr><tr><td>20 mL 螺口玻璃瓶</td><td>Carl Roth</td><td>EXY4.1</td><td></td></tr><tr><td>一次性无菌注射器 1 mL</td><td>Henry Schein Animal Health</td><td>9003016</td><td></td></tr><tr><td>一次性移液管：血清移液管</td><td>Greiner bio-one</td><td>612301</td><td></td></tr><tr><td>无菌针头：27号G规格×3/4英寸一次性注射针</td><td>Henry Schein 动物保健</td><td>9003340</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;小鼠颅骨缺损模型&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>镇痛：布托啡诺（Bupaq）</td><td>Richter Pharma AG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>麻醉：氯胺酮（Ketamidor），赛拉嗪（Rompun）</td><td>Richter Pharma AG/Bayer HealthCare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>冷灭菌剂：SafeSept Max</td><td>Henry Schein Animal Health</td><td>9882765</td><td></td></tr><tr><td>乙醇（70% vol/vol）</td><td>VWR Chemicals</td><td>93003.1006</td><td></td></tr><tr><td>眼膏：VitA POS 5 g</td><td>Ursapharm</td><td></td><td></td></tr><tr><td>生理盐水溶液（0.9%氯化钠溶液）</td><td>Fresenius Kabi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液 1x (PBS) pH 7.4</td><td>Gibco，赛默飞世尔科技&amp;nbsp;</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>聚维酮碘溶液：Braunol 1000 mL</td><td>B. Braun</td><td>3864154</td><td></td></tr><tr><td>Roti-Histofix 4.5% 缓冲甲醛</td><td>Carl Roth</td><td>2213.6</td><td></td></tr><tr><td>组织粘合剂：Histoacryl 5 × 0.5 mL&amp;nbsp;</td><td>B. Braun Surgical</td><td>1050060</td><td></td></tr><tr><td>个人防护装备：外科手套、帽子和口罩、防护服</td><td>Henry Schein Animal Health</td><td>1045073, 1026614, 9009062, 370406</td><td></td></tr><tr><td>无菌器械（手术刀、剪刀、镊子、持针器）</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>无菌针头：27 号 3/4 英寸和 30 号 1/2 英寸皮下注射针头&amp;nbsp;</td><td>Henry Schein Animal Health</td><td>9003340, 9003630</td><td></td></tr><tr><td>一次性无菌注射器 1 mL</td><td>Henry Schein Animal Health</td><td>9003016</td><td></td></tr><tr><td>加热板：Physitemp</td><td>Rothacher Medical</td><td>TCAT-2LV</td><td></td></tr><tr><td>无菌纱布拭子</td><td>Henry Schein Animal Health</td><td>220192</td><td></td></tr><tr><td>无菌一次性手术刀（图20）</td><td>Henry Schein Animal Health</td><td>9008957</td><td></td></tr><tr><td>外科/牙科钻机：Implantmed SI-923</td><td>W&amp;amp;H Dentalwerk B&amp;uuml;rmoos GmbH</td><td>16929000</td><td></td></tr><tr><td>S-II型手柄</td><td>W&amp;amp;H Dentalwerk B&amp;uuml;rmoos GmbH</td><td>30056000</td><td></td></tr><tr><td>直径4 mm的环钻</td><td>Hager&amp;amp;Meisinger GmbH</td><td>229040</td><td></td></tr><tr><td>灌注管路套装 2.2 m</td><td>W&amp;amp;H Dentalwerk B&amp;uuml;rmoos GmbH</td><td>4363600</td><td></td></tr><tr><td>骨膜剥离器 2 mm / 3 mm</td><td>Henry Schein 动物健康</td><td>472683</td><td></td></tr><tr><td>不可吸收缝线：聚酯绿线，DS19，针长 1.5，USP 4/0，75 cm</td><td>Henry Schein Animal Health</td><td>300715</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;&lt;em&gt;体外&lt;/em&gt; 免疫反应&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>安乐死麻醉剂：氯胺酮（Ketamidor）、赛拉嗪（Rompun）</td><td>Richter Pharma AG/Bayer HealthCare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>细胞增殖ELISA，BrdU（比色法）检测试剂盒</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11647229001</td><td>试剂盒包含 BrdU 标记液、固定液（FixDenat）、抗 BrdU 抗体溶液、洗涤缓冲液和底物溶液。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>刀豆蛋白A（ConA）</td><td>MP Biomedicals</td><td>150710</td><td></td></tr><tr><td>培养基 脾细胞</td><td></td><td></td><td>RPMI 培养基 + 10% 热灭活 FBS + 1% 青霉素-链霉素溶液 + 0.1% 庆大霉素 + 0.2% &amp;szlig;-巯基乙醇 + 1% 非必需氨基酸</td></tr><tr><td>乙醇（70% vol/vol）</td><td>VWR Chemicals</td><td>93003.1006</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>Gibco，Thermo Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>10500064</td><td></td></tr><tr><td>庆大霉素</td><td>Gibco，Thermo Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>15750037</td><td></td></tr><tr><td>小鼠 IL-1&amp;beta; ELISA Ready-SET-Go!</td><td>Invitrogen，Thermo Fisher Scientific</td><td>88-7013-88</td><td></td></tr><tr><td>小鼠 IL-2 ELISA MAX 标准品</td><td>BioLegend</td><td>431001</td><td></td></tr><tr><td>小鼠 IL-4 ELISA MAX 标准品</td><td>BioLegend</td><td>431101</td><td></td></tr><tr><td>小鼠 INF-&amp;gamma; ELISA MAX 标准品</td><td>BioLegend</td><td>430801</td><td></td></tr><tr><td>非必需氨基酸溶液</td><td>Gibco，Thermo Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素&amp;nbsp;</td><td>Gibco，赛默飞世尔科技&amp;nbsp;</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液 1x (PBS) pH 7.4</td><td>Gibco，Thermo Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>红细胞（RBC）裂解缓冲液：BD Pharm Lyse</td><td>BD Bioscience</td><td>555899</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 培养基，HEPES</td><td>Gibco，赛默飞世尔科技&amp;nbsp;</td><td>52400025</td><td></td></tr><tr><td>&amp;beta;-巯基乙醇</td><td>Gibco，赛默飞世尔科技&amp;nbsp;</td><td>31350010</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 锥形管</td><td>Greiner bio-one</td><td>227261</td><td></td></tr><tr><td>96孔组织培养板</td><td>Greiner bio-one</td><td>655180</td><td></td></tr><tr><td>离心机：VWR Mega Star 600R</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>细胞筛 40 &amp;micro;m</td><td>BD Bioscience</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>Infinite M200 Pro 微孔板读板机</td><td>Tecan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>一次性无菌注射器 1 mL</td><td>Henry Schein 动物健康</td><td>9003016</td><td></td></tr><tr><td>无菌手术器械（镊子、载玻片）</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;高通量腹腔注射模型&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>麻醉：氯胺酮（Ketamidor），赛拉嗪（Rompun）</td><td>Richter Pharma AG/Bayer HealthCare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>冷灭菌剂：SafeSept Max</td><td>Henry Schein Animal Health</td><td>9882765</td><td></td></tr><tr><td>乙醇（70% vol/vol）</td><td>VWR Chemicals</td><td>93003.1006</td><td></td></tr><tr><td>眼膏：VitA POS 5 g</td><td>Ursapharm</td><td></td><td></td></tr><tr><td>小鼠 IL-1&amp;beta; ELISA Ready-SET-Go!</td><td>Invitrogen，Thermo Fisher Scientific</td><td>88-7013-88</td><td></td></tr><tr><td>小鼠 IL-2 ELISA MAX 标准品</td><td>BioLegend</td><td>431001</td><td></td></tr><tr><td>小鼠 IL-4 ELISA MAX 标准品</td><td>BioLegend</td><td>431101</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液 1x (PBS) pH 7.4</td><td>Gibco，Thermo Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>聚维酮碘溶液：Braunol 1000 mL</td><td>B. Braun</td><td>3864154</td><td></td></tr><tr><td>Shandon Rapid-Chrome Kwik-Diff 染色试剂盒</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>9990700</td><td>用于细胞分类计数。</td></tr><tr><td>加热板：Physitemp</td><td>Rothacher Medical</td><td>TCAT-2LV</td><td></td></tr><tr><td>血细胞计数板：Neubauer 计数室</td><td>Carl Roth</td><td>PC72.1</td><td></td></tr><tr><td>不可吸收缝合线：Ethibond Excel 4-0</td><td>Ethicon</td><td>6683H</td><td></td></tr><tr><td>可吸收缝合线：Polysorb</td><td>Covidien</td><td>SL-5628</td><td></td></tr><tr><td>Shandon 离心机用于细胞涂片</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>一次性无菌注射器 1 mL</td><td>Henry Schein Animal Health</td><td>9003016</td><td></td></tr><tr><td>无菌纱布拭子</td><td>Henry Schein 动物健康</td><td>220192</td><td></td></tr><tr><td>无菌针头：27 号 RW 27 G × 3/4″ 和 25 G 皮下注射针头</td><td>Henry Schein 动物健康</td><td>9003340, 420939</td><td></td></tr><tr><td>无菌手术器械（手术刀、剪刀、镊子、持针器）</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.4% 台盼蓝溶液</td><td>Gibco，赛默飞世尔科技&amp;nbsp;</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;亚慢性皮下模型&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>麻醉剂：氯胺酮（Ketamidor），赛拉嗪（Rompun）</td><td>Richter Pharma AG/Bayer HealthCare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>冷灭菌剂：SafeSept Max</td><td>Henry Schein Animal Health</td><td>9882765</td><td></td></tr><tr><td>乙醇（70% vol/vol）</td><td>VWR Chemicals</td><td>93003.1006</td><td></td></tr><tr><td>眼膏：VitA POS 5 g</td><td>Ursapharm</td><td></td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液 1x (PBS) pH 7.4</td><td>Gibco，Thermo Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>聚维酮碘溶液：Braunol 1000 mL</td><td>B. Braun</td><td>3864154</td><td></td></tr><tr><td>Roti-Histofix 4.5% 缓冲甲醛</td><td>Carl Roth</td><td>2213.6</td><td></td></tr><tr><td>加热板：Physitemp</td><td>Rothacher Medical</td><td>TCAT-2LV</td><td></td></tr><tr><td>不可吸收缝合线：Ethibond Excel 4-0</td><td>Ethicon</td><td>6683H</td><td></td></tr><tr><td>个人防护装备：外科手套、帽子和口罩、防护服</td><td>Henry Schein Animal Health</td><td>1045073, 1026614, 9009062, 370406</td><td></td></tr><tr><td>一次性无菌注射器 1 mL</td><td>Henry Schein Animal Health</td><td>9003016</td><td></td></tr><tr><td>无菌纱布拭子</td><td>Henry Schein Animal Health</td><td>220192</td><td></td></tr><tr><td>无菌器械（手术刀、剪刀、镊子、持针器）</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>无菌针头：27 号 3/4 英寸一次性使用注射针&amp;nbsp;</td><td>Henry Schein Animal Health</td><td>9003340, 420939</td><td></td></tr></tbody></table>

骨再生用生物材料的生物学相容性评价

Biological Compatibility Profile on Biomaterials for Bone Regeneration

大段骨不连骨折是骨科手术中的重大挑战。尽管自体和同种异体骨移植在愈合此类病变方面效果良好，但其应用仍存在潜在并发症。因此，材料科学家正在开发合成的、生物相容性的生物材料以克服这些问题。在本研究中，我们提出了一种用于评估骨修复生物材料的多学科平台。我们整合了骨生物学与免疫学的专业知识，建立了一个包含体外成骨细胞（OB）和破骨细胞（OC）实验以及体内小鼠骨修复、免疫原性和致敏性模型的综合平台。 体外 破骨细胞（OC）和成骨细胞（OB）检测 体内 骨修复、免疫原性和致敏性的小鼠模型。我们展示了如何开展这些实验，总结了实验结果，并报告了生物材料的生物相容性。具体而言，我们在β-磷酸三钙（β-TCP）圆片的条件下检测了成骨细胞的活力、分化和矿化能力，以及破骨细胞的活力和分化能力 &#946;磷酸三钙 (&#946;β-TCP圆盘。我们还测试了一种β-TCP/胶原（β-TCP/C）泡沫 &#946;β-TCP/胶原蛋白（β-TCP/C）&#946;β-TCP/C泡沫是一种临床用于骨修复的市售材料，本研究在临界尺寸颅骨骨缺损小鼠模型中评估其对骨愈合早期阶段的影响。在平行实验中，我们评估了小鼠的免疫和过敏反应。本方法通过一系列参数生成骨生物材料的生物学相容性谱型，这些参数对于预测用于患者骨愈合与修复的生物材料的生物相容性至关重要。

为了评估β-TCP作为骨修复生物材料的有效性，我们采用了 体外 和 体内 筛选方法。首先，我们检测了OB对β-TCP圆片的反应，并与仅含基础培养基的对照组进行比较。 图2 展示了成骨细胞（OB）在培养第7天和第14天对β-TCP圆片的存活情况。通过测定培养孔中代谢活跃细胞的活性，发现含β-TCP圆片的成骨细胞与仅含组织培养塑料中培养基的成骨细胞的细胞活力相当，表明该生物材料既不促进也不抑制成骨细胞的增殖。
为了进一步评估成骨细胞（OBs），我们采用定性和定量方法检测碱性磷酸酶（ALP）活性，作为细胞分化的标志。图2展示了培养7天后各培养孔中ALP酶的活性。仅含基础培养基的孔中OBs的ALP活性处于基线水平，而在最佳矿化培养基（MM）中，OBs表现出强烈的ALP染色，反映出高水平的成骨细胞分化。相比之...

用于修复大段骨缺损的新型生物材料数量正在持续增加，旨在促进骨愈合并克服与骨移植相关的并发症。本文介绍了一种用于骨修复生物材料临床前生物相容性测试的多学科策略。

大段骨不连骨折是骨科手术中的重大挑战。尽管自体和同种异体骨移植在修复此类损伤方面效果显著，但其应用仍存在潜在并发症。因此，材料科学家正在开发合成的、生物相容性的生物材料以克服这些问题。本研究提出了一种用于评估骨修复生物材料的多学科平台。我们整合了骨生物学与免疫学领域的专业知识，建立了一个包含体外破骨细胞（OC）和成骨细胞（OB）实验，以及体内骨修复、免疫原性和致敏性小鼠模型的综合平台。我们展示了实验的操作方法，总结了实验结果，并报告了生物材料的生物相容性。具体而言，我们在β-磷酸三钙（β-TCP）圆片的背景下检测了OB的存活率、分化能力及矿化能力，以及OC的存活率和分化能力。此外，我们还测试了一种市售临床用于骨修复的β-TCP/胶原（β-TCP/C）泡沫材料，在临界尺寸颅骨缺损小鼠模型中评估其对骨愈合早期阶段的影响。在平行实验中，我们同时评估了小鼠的免疫反应和过敏反应。本方法可生成涵盖多种参数的生物材料生物学相容性谱型，为预测用于患者骨愈合与修复的生物材料的生物相容性提供必要依据。

这些方法有助于回答生物材料领域中的关键问题，特别是在骨再生方面。它们可用于评估生物材料的有效性以及潜在的免疫反应。该多学科平台的主要优势在于，它提供了一系列用于预测骨修复用生物材料生物相容性的参数。这些体外和体内骨科技术的应用可拓展至其他骨科疾病领域，以满足新型骨科生物材料在临床前筛选方面的需求。皮肤科学方法可为骨愈合用生物材料提供研究依据，也可应用于其他任何临床用途的生物材料评估。在添加成骨矿化培养基后第14天，吸取原代成骨细胞的培养液。用0.5毫升1X PBS冲洗两次。然后加入 0.5 毫升 10% 缓冲福尔马林溶液固定细胞，在室温下孵育 10 分钟。10 分钟后，使用一次性移液管吸除 10% 缓冲福尔马林溶液，并用 0.5 毫升超纯水洗涤两次。随后向固定的成骨细胞中加入 250 微升 40 毫摩尔的茜素红 S 染色液。将培养板置于室温下，以每分钟100次的振荡速度在摇床上孵育10分钟。染色液孵育结束后，使用一次性移液管吸除染色液，并加入1毫升超纯水进行冲洗。重复此步骤5至10次，直至冲洗液清澈，以去除非特异性染色。吸出最后一次洗涤液后，加入一毫升冷的 PBS，将培养板置于摇床上，室温孵育 10 分钟，操作同前。接着，将染色后的 β-磷酸三钙圆片转移至新孔中，使用平板扫描仪扫描培养板，以记录矿化情况。图像采集后，加入250微升10%氯化十六烷基吡啶溶液，振荡15分钟以提取茜素红S染料。接着，将各孔中的溶液转移至单独的1.5毫升离心管中，在室温下以17,000 × g离心5分钟。在1.5毫升离心管中，用10%氯化十六烷基吡啶溶液以1:10至1:20的稀释比例对提取液进行稀释。然后将每种稀释后的样品各 300 微升转移至 96 孔板的孔中。设置两个空白孔，仅含 10% 氯化十六烷基吡啶。接下来，通过用 10% 氯化十六烷基吡啶溶液稀释 40 毫摩尔/升茜素红 S 染色液，配制浓度范围为 4 至 400 微摩尔/升的七种茜素红 S 参考标准品，以生成标准曲线。将每种标准品各300微升加入到孔板中。最后，在520纳米波长下读取样品、空白孔和参考标准品的吸光度。通过使用无菌剪刀在髋关节处切除安乐死小鼠的后肢，从股骨和胫骨中分离骨髓成骨前体细胞。在膝关节和踝关节处切断四肢，使用无菌手术刀和镊子去除软组织。切除骨骺。将连接有装满一毫升骨生长培养基注射器的27号针头插入骨髓腔，冲洗骨髓至一个六厘米无菌培养皿中。对所有股骨和胫骨重复此操作后，将细胞悬液转移至一个 50 毫升的锥形管中。用 5 毫升骨生长培养基冲洗六厘米的培养皿，并将冲洗液转移至同一 50 毫升锥形管中。在 4 摄氏度下以 350 × g 离心 5 分钟。离心后，用每孔1毫升的破骨细胞分化培养基重悬细胞。一只BALB/c小鼠提供的破骨细胞前体细胞数量足以用于一块24孔培养板。将悬浮在成骨生长培养基中的原代成

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Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

骨再生生物材料的生物相容性曲线

本文介绍了一种改进的机械测试方法，用于评估骨组织与候选植入物表面之间的锚定强度。该方法可使破坏力精确地垂直或平行于植入物表面平面，并能准确地将破坏力施加于特定的种植体周围区域。...

一种改进的力学测试方法以评估骨-植入物锚定性能

我们在此介绍如何制备骨组织条件培养基（BCM）并检测其活性 体外.

骨诱导培养基：制备与生物活性检测

本文介绍了一种逐步构建具有工程化微通道的类骨模板的通用方法。通过微通道的毛细作用，展示了该模板的高吸收和高保留能力。...

类骨模板中微通道的独特毛细作用可增强细胞募集以修复大段骨缺损

掺杂骨形态发生蛋白2（BMP2）的生物材料已被用作治疗骨不连骨折的一种新治疗策略。为了克服因该因子不可控释放所导致的副作用，我们提出一种新的策略，可将该因子定点固定，从而制备出具有增强成骨能力的材料。...

通过点击化学实现骨形态发生蛋白2在固体表面的定点固定

本文介绍了一种用于评估口腔修复体基台用钛和氧化锆材料上口腔生物膜形成的实验方案，包括对细菌细胞活性及形态特征的分析。in situ...

不同材料 dental implant 口腔生物膜形成

我们介绍了直接培养、直接暴露培养和暴露培养三种方法，用于评估 体外 可降解植入材料的细胞相容性。这些 体外 方法模拟不同 在体...

可降解植入材料研究的直接与间接培养方法 体外

在本研究中，我们详细描述了脱细胞化、物理表征、成像以及 体内...

脱细胞苹果来源支架在骨组织工程中的应用 体外 和 体内

本方案提出一种综合性方法，通过多模态分析手段在全球范围内评估骨再生过程中的骨形成情况。该方法旨在提供有关新骨形成定性与定量的信息，从而提高基础研究和临床前研究的严谨性与有效性。...

体外模型中组织矿化的全面表征

本研究建立了一种大鼠股骨半节段性缺损模型，用于评估骨替代材料在无内固定或外固定条件下承受负荷时的力学性能和成骨性能。...

用于评估承重区域骨替代材料性能的大鼠半节段性骨干骨缺损模型

我们提出了一种在多个层次水平上评估骨再生的实验方案。该多模态方法能够实现跨不同长度尺度的结构分析，有效解决了样本制备中的挑战，并为评价生物材料促进骨再生的效果提供了可靠的分析流程。...

评估骨再生与支架性能的多模态方法

了解骨再生生物材料的生物相容性评估策略，通过体外和体内技术预测材料有效性及免疫反应。该多学科平台为骨科生物材料的临床前筛选提供重要参数。

骨再生用生物材料的生物学相容性评价

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