离体小鼠心脏Langendorff灌注后多聚核糖体的动态蛋白质组学与miRNA分析

该方法有助于解答有关动态蛋白质合成及参与该过程的蛋白质组的关键问题。该技术能够鉴定出正在被选择进行翻译的mRNA、可参与并干扰翻译过程的microRNA，以及参与蛋白质翻译或自身正在被翻译的蛋白质。该方法可为心脏对压力刺激的响应提供深入见解，也可应用于其他器官对压力急性反应的研究。

演示该实验步骤的是来自 Jennifer Van Eyk 实验室的项目科学家 Miroslava Stastna。实验当天，将梯度混合器的左侧室加入 5 毫升 15% 蔗糖梯度溶液，右侧室加入 5 毫升 50% 蔗糖梯度溶液。打开活塞并启动泵，使用磁力搅拌器搅拌两个小室，并通过连接第二个活塞的管道，使混合后的蔗糖溶液流入置于冰上的薄壁超速离心管中。

接下来，将新鲜或冷冻的心脏组织在冰上用匀浆缓冲液中使用POLYTRON匀浆15秒。孵育结束后，离心裂解液以去除不溶性物质，并收集上清液。保留50微升上清液用于蛋白质定量、RNA提取及RNA完整性分析，将剩余上清液中的100至500微升小心铺加到梯度溶液上。

使用新鲜的裂解缓冲液平衡两个梯度管之间的体积，并将样品置于带有摆动桶转子的超速离心机中进行超速离心。在离心前和离心后均需格外小心，避免扰动蔗糖梯度。收集梯度时，设置馏分收集器在最初三分钟内弃去收集液，随后以每分钟1毫升的速度，在4至19分钟内连续收集17个馏分，同时连续监测254纳米处的吸光度，以分别获取重链、轻链及非翻译组分。

收集到每个组分后应立即置于冰上。若不能立即处理，需将样品储存在零下80摄氏度。为从多聚核糖体组分中提取蛋白质，将收集的蔗糖组分合并为三个最终组分，并将其标记为重链、轻链和非翻译组分。

将每份样品各取 0.5 毫升与 60 微升 100% 三氯乙酸（TCA）混合。将混合物于 -20 °C 避光孵育过夜。次日早晨，在冰上融化样品，然后通过离心沉淀蛋白质。

弃去上清液，再用 0.5 毫升预冷至负 20 摄氏度的丙酮洗涤沉淀物，每次离心后各洗涤一次，共洗涤两次。确保三氯乙酸（TCA）沉淀后的沉淀物完全溶解，必要时使用脉冲超声处理以保证完全溶解。最后一次洗涤后，将沉淀物在空气中干燥，然后重悬于 360 微升 Tris-HCl 缓冲液中。

然后加入 40 µL 二硫苏糖醇，在 55 °C 下振荡孵育 45 分钟。孵育结束后，在避光条件下，向样品中加入 50 µL 碘乙酰胺，在室温下于摇床上孵育 30 分钟，随后按照 1:50 的酶与蛋白质量比加入胰蛋白酶，于 37 °C 振荡过夜孵育。次日早晨，样品冷却后短暂离心，并用 10% 甲酸将 pH 调至 2 至 3，以终止胰蛋白酶活性。

为去除样品中的盐分，首先用 200 微升甲醇对 96 孔板中的各孔填料进行三次预处理，每次 200 微升；随后用每孔 200 微升的 0.1% 甲酸进行三次平衡。接着将样品加入各孔中，并用每孔 200 微升的 0.1% 甲酸洗涤样品三次。利用重力作用，随后施加低真空，用 100 微升含 50% 乙腈的 0.1% 甲酸溶液洗脱两次，将洗脱液收集至每个样品对应的低蛋白吸附 0.5 毫升离心管中。

然后使用浓缩仪将样品洗脱液蒸发至干燥，并将每份胰蛋白酶消化的肽段沉淀重悬于50至100微升含0.1%甲酸的溶液中，用于质谱分析。可进行mRNA分析，以评估特定目标mRNA在各组分中的分布情况，或对多核糖体翻译组分（合并）与非翻译组分之间的mRNA丰度比值进行定量和比较。例如，此处展示了小鼠心脏经缺血处理或缺血-再灌注处理后，与假手术心脏处理相比，mRNA在翻译组分与非翻译组分之间分布的变化情况。

在此代表性实验中，对混合的重组分中部分 microRNA 的分析显示，在缺血条件下有 22 种 microRNA 与多聚核糖体相关，9 种 microRNA 在缺血和再灌注条件下均相关，另有 7 种在两种条件下共有，表明 microRNA 与多聚核糖体的结合在缺血和再灌注应激条件下具有动态变化。此外，大多数线粒体核糖体蛋白在轻组分中被鉴定到，而大多数胞质核糖体蛋白则在重和轻两个组分中均有检出。在进行该实验操作时，需特别注意小心处理蔗糖梯度。

在我们的实验流程中，选择三氯乙酸（TCA）沉淀法从多聚核糖体组分中提取蛋白质，是基于该方法能够有效处理高浓度蔗糖组分，并且可通过质谱鉴定出较多蛋白质。通常，初次接触该方法的研究人员可能会因蔗糖梯度的重复性问题而遇到困难。TCA沉淀法具有多项优势：仅需少量体积即可沉淀蛋白质，沉淀物在管底清晰可见，且沉淀过程中不会出现蔗糖的累积。