Name: Langendorff 灌注后离体小鼠心脏 Polysomes 的动态蛋白质组学及 miRNA 分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 54 s
Description: 学习Langendorff灌注后离体小鼠心脏多聚核糖体的动态蛋白质组学及miRNA分析方法。该技术可识别参与翻译的mRNA、干扰翻译的microRNA及相关蛋白质，为研究心脏应激反应提供重要工具。

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美国国立卫生研究院 P01 HL112730（RAG，JVE）、美国国立卫生研究院 R01 HL132075（RAG，JVE）、芭芭拉·史翠珊女性心脏中心（RAG，JVE）、多萝西与菲利普·莱昂分子心脏病学讲席（RAG）、埃里卡·格拉泽女性心脏健康讲席（JVE）以及捷克科学院机构支持项目 RVO: 68081715（MS）。

所有动物实验均按照机构指南进行，并经西达斯-西奈医学中心机构动物护理和使用委员会批准。
1. 小鼠心脏的兰格多夫灌注
<ol>
	<li>小鼠心脏的缺血再灌注Langendorff灌流
	<ol>
		<li>对成年小鼠（8周龄，雄性，C57BL6/j）腹腔注射戊巴比妥钠70 mg/kg。通过脚趾夹捏无回缩反应确认深度麻醉。</li>
		<li>腹腔注射肝素500 U/kg进行抗凝。</li>
		<li>通过胸骨切口打开胸腔，切开膈肌并沿肋缘切至腋前线，随后沿腋前线切至前肢以完全打开胸廓。暴露心脏后，用镊子夹住升主动脉并迅速取出心脏。动物因失血而死亡。将心脏置于冰冷的Krebs溶液（NaCl 6.9 g/L，KCl 0.35 g/L，NaHCO3 2.1 g/L，KH2PO4 0.16 g/L，MgSO4 0.141 g/L，葡萄糖2 g/L，CaCl2 0.373 g/L）中。</li>
		<li>用钝头针插管主动脉，并以恒定压力模式逆行灌注Krebs溶液。</li>
		<li>经过15分钟的稳定期后，对心脏施加30分钟的全心无流缺血，随后进行30分钟的再灌注。</li>
		<li>在基线灌注15分钟后、缺血30分钟后或再灌注30分钟后取材。去除心房组织，将心室组织在液氮中速冻。</li>
		<li>于-80 °C保存备用</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 组织匀浆、溶解及蔗糖密度梯度沉降
<ol>
	<li>梯度溶液的制备
	<ol>
		<li>配制100 mL的15%和50%蔗糖溶液，每种溶液中加入4 mL 2.5 M NaCl； 
		0.8 mL 1.25 M MgCl2；1 mL 1 M Tris-HCl，pH 7.5；15 g或50 g蔗糖（分别对应15%和50%溶液）；超纯水定容至100 mL；并在15%溶液中加入二甲苯青（终浓度0.02 mg/mL）以染色</li>
		<li>使用0.22 µm滤器过滤每种溶液</li>
		<li>在使用梯度的当天，分别取40 mL的15%和50%蔗糖溶液，并向每种溶液中加入环己酰亚胺，使其终浓度为100 µg/mL
		<ol>
			<li>使用梯度混合器将15%和50%蔗糖溶液混合形成连续梯度</li>
			<li>将左侧室加入5 mL 15%蔗糖溶液</li>
			<li>将右侧室加入50%蔗糖溶液</li>
			<li>打开活塞并启动泵，通过磁力搅拌器搅拌两个小室中的溶液</li>
			<li>使用连接至第二个活塞的导管，使混合后的蔗糖溶液流入薄壁超速离心管中，最终体积约为10 mL</li>
		</ol>
		</li>
		<li>将制备好的梯度溶液置于4 °C保存（如需可过夜，但不可超过此时间）</li>
	</ol>
	</li>
	<li>心肌组织的匀浆处理
	<ol>
		<li>使用聚四氟乙烯匀浆器（Polytron）在经过滤的裂解缓冲液（适用于蔗糖梯度分离的改良配方）中匀浆新鲜或冷冻的心肌组织，缓冲液含100 mM KCl、20 mM Tris（pH 7.5）、5 mM MgCl2、0.4% NP-40，并加入100 µg/mL环己酰亚胺以维持多聚核糖体结构，0.1 U RNase抑制剂以及蛋白酶抑制剂混合物（每50 mL缓冲液加入1片）</li>
		<li>将裂解液置于冰上孵育15分钟</li>
		<li>在4 °C条件下以18,000 × g离心15分钟，去除不溶性物质，收集上清液</li>
		<li>保留50 µL上清液用于蛋白质定量、RNA提取及RNA完整性分析（见图2）</li>
		<li>将500–100 µL上清液小心铺加于梯度溶液顶部，并用裂解缓冲液平衡离心管</li>
	</ol>
	</li>
	<li>沉降及组分收集
	<ol>
		<li>在4 °C条件下，使用摆桶转子进行超速离心，转速为37,000 rpm，持续120分钟。根据制造商说明，此条件在最大半径处相当于228,000 × g</li>
		<li>使用连续监测254 nm波长吸光度（OD254）的方法，将每个梯度收集为17个组分（每管约600 µL），分装至微量离心管中</li>
		<li>按以下程序设置组分收集器：
		<ol>
			<li>弃去前3分钟收集的液体（对应梯度前的空管液体）</li>
			<li>从第4分钟至第19分钟，以1 mL/min的速度收集，共分为17个组分</li>
		</ol>
		</li>
		<li>每收集一个组分立即置于冰上。若不立即处理，应将样品在-80 °C冷冻保存。典型的梯度收集过程中紫外密度扫描图谱见图1</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 多聚核糖体及非翻译组分中 mRNA 的分离与分析
<ol>
	<li>mRNA 提取
	<ol>
		<li>如果样品在收集后经过速冻处理，则将其在冰上解冻</li>
		<li>将每份组分各 200 µL 转移至新的离心管中 
		注意：&#160;在此步骤中，可将两个或更多连续的组分合并。应在分析 OD254 图谱后谨慎操作，避免多聚核糖体组分与非多聚核糖体组分混合。</li>
		<li>为每个样品加入 10 ng 荧光素酶 RNA 作为内参对照，用于标准化处理。 
		注意：应使用荧光素酶引物作为内参对照，以标准化实验结果。</li>
		<li>向每根离心管中加入 700 µL RNA 提取试剂（苯酚与异硫氰酸胍的单相溶液；参见 材料表），充分混匀，并在室温下孵育 5 分钟。</li>
		<li>加入 140 µL 氯仿，涡旋振荡 15 秒，室温孵育 2–3 分钟。</li>
		<li>在 4 °C 条件下，以 12,000 × g 离心 15 分钟。</li>
		<li>小心将上层水相转移至新管中。</li>
		<li>由于各组分中 RNA 含量较低，需向每管中加入 10 µg 糖原作为载体。</li>
		<li>向每管中加入 350 µL 异丙醇，充分混匀后于 -20 °C 孵育 1 小时，以提高得率。</li>
		<li>在 4 °C 条件下，以 12,000 × g 离心 15 分钟。</li>
		<li>弃去上清液，加入 700 µL 75% 乙醇洗涤 RNA 沉淀。</li>
		<li>在 4 °C 条件下，以 7,500 × g 离心 5 分钟。</li>
		<li>去除乙醇，将沉淀在空气中干燥 10–15 分钟。 
		注意：RNA 沉淀过度干燥将影响其在水中的完全溶解。</li>
		<li>将 RNA 沉淀重悬于 50 μL 无 RNase 的超纯 H2O 中。</li>
		<li>在 55 °C 孵育 10 分钟。</li>
		<li>取每份样品 2 μL 用于测定提取 RNA 的质量和数量，其余样品储存于 -80 °C。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>逆转录与定量 PCR
	<ol>
		<li>使用 4 μL 逆转录 cDNA 合成试剂盒（参见 材料表）进行 20 μL 反应体系。根据样品数量配制预混液，将所需体积转移至各管，并向每管加入 5 μL 待测 RNA。该体积可根据 Taq 聚合酶工作条件的适用范围进行调整。</li>
		<li>将离心管放入热循环仪中，按照试剂制造商推荐的程序进行孵育：25 °C 孵育 5 分钟，46 °C 逆转录 20 分钟，95 °C 逆转录酶失活 1 分钟。</li>
		<li>使用针对每对引物优化的程序进行定量 PCR。 
		注意：为检测特定 mRNA 在各组分中的存在情况，应使用等体积的已分离 RNA 进行逆转录。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>结果分析
	<ol>
		<li>利用目标基因和荧光素酶的 Ct 值计算 ΔCt 值</li>
		<li>将每个组分的 ΔCt 值表示为所有组分中总 mRNA 值的百分比，以可视化 mRNA 在不同组分间的分布情况（表 1）</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 来自多聚核糖体组分和非翻译组分的miRNA的分离与分析
<ol>
	<li>mRNA 和 miRNA 的提取 
	注意：本方案遵循试剂盒说明书的操作步骤，仅作少量修改。
	<ol>
		<li>将甘油和内参对照解冻，置于冰上保存。</li>
		<li>向 200 µL 混合样本中加入 700 µL miRNA 提取试剂。</li>
		<li>加入终浓度为 1 µg/µL 的甘油，并用移液器充分混匀，室温孵育 5 分钟。</li>
		<li>加入 3.5 µL 的 1.6 × 108 倍稀释的内参对照，混匀。</li>
		<li>加入 200 µL 氯仿，涡旋振荡至少 15 秒。</li>
		<li>室温孵育 3 分钟。</li>
		<li>在 4 °C 条件下，以 12,000 × g 离心 15 分钟。</li>
		<li>用移液器将上清液转移至新的 1.5 mL 离心管中，弃去中间层和下层有机相。</li>
		<li>向上清液中加入 1.5 倍体积的 100% 乙醇，混匀。</li>
		<li>将 700 µL 此混合液转移至 miRNA 提取柱中，在室温下以最大转速离心 15 秒，弃去穿流液；如有剩余样品，重复此步骤。</li>
		<li>向柱中加入 700 µL 缓冲液 1，在室温下以最大转速离心 15 秒，弃去穿流液。</li>
		<li>向柱中加入 500 µL 缓冲液 2，在室温下以最大转速离心 15 秒，弃去穿流液。</li>
		<li>向柱中加入 500 µL 80% 乙醇，在室温下以最大转速离心 2 分钟，弃去穿流液。</li>
		<li>将提取柱转移至新的 2 mL 无盖离心管中，打开管盖，在室温下以最大转速离心 5 分钟，弃去穿流液。</li>
		<li>向柱中加入 16 µL 无 RNA 酶的水，在室温下以最大转速离心 1 分钟。收集洗脱液并置于冰上，或于 -80 °C 保存以备后续分析。 
		注意：每个样本可取 2 µL 用于 OD 值测定。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>逆转录反应
	<ol>
		<li>在冰上配制反应体系。每 20 µL 逆转录反应体系中加入 4 µL miRNA 逆转录缓冲液、2 µL 核酸、9 µL 总 RNA、2 µL 酶和 3 µL 无 RNA 酶的水；混匀后短暂离心。</li>
		<li>设置 PCR 仪程序如下： 
		37 °C 反应 60 分钟； 
		95 °C 灭活 5 分钟； 
		4 °C 保存。</li>
		<li>从 PCR 仪中取出反应管，加入 200 µL 无 RNA 酶的水。可于 -20 °C 保存，或直接进行实时荧光定量 PCR。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>实时荧光定量 PCR 
	注意：本方案采用 96 孔板格式。请在冰上配制反应体系。
	<ol>
		<li>根据实验要求配制 PCR 反应混合液，并加入上述 miRNA 来源的 cDNA。可批量配制多个反应体系。</li>
		<li>每孔加入总量为 25 µL 的 PCR 混合液与 cDNA 混合物。</li>
		<li>使用光学封板膜密封反应板。</li>
		<li>在室温下以 1,000 × g 离心 1 分钟。</li>
		<li>设置实时荧光定量 PCR 仪程序如下： 
		初始激活：95 °C 15 分钟； 
		三步循环程序：94 °C 变性 15 秒，55 °C 退火 30 秒，70 °C 延伸 30 秒（在此步骤收集荧光信号），共 40 个循环； 
		熔解曲线分析按仪器默认程序进行。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>比较分析
	<ol>
		<li>归一化示例（见 表 2）：
		<ol>
			<li>找出 SCM 的最小值。</li>
			<li>将所有 SCM 值归一化至该最小值。</li>
			<li>用该归一化值分别减去目标 miRNA（MOI）和内参基因（REF）的 Ct 值。</li>
			<li>使用 2-ΔCt 公式进行数据分析。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 蛋白质组学分析
<ol>
	<li>从多聚核糖体组分中提取蛋白质 
	<ol>
		<li>将收集的蔗糖组分合并为三个最终组分。标记这些组分为 重 （高效率多聚核糖体位于第4、5、6和7组分的合并组分中，该区域蔗糖浓度最高，位于梯度管底部） 光 低效多聚核糖体位于合并的第8、9、10和11组分中（梯度离心管中部） 非翻译的 （合并蔗糖浓度最低的组分12、13、14和15；梯度管顶部）。对合并后的组分进行蛋白质定量检测。</li>
		<li>配制三氯乙酸（TCA）的100%母液，置于4 °C避光保存。取0.5 mL样品与60 µL 100% TCA混合，于-20 °C避光孵育过夜。 
		注意：使用 1.5 mL 低蛋白吸附离心管（参见 材料表).</li>
		<li>过夜孵育后，将样品置于冰上解冻，并在15,000 x g4 °C 下孵育 30 分钟。弃去上清液。 
		注意：样品中含100 µg总蛋白时，可在管底观察到可见的蛋白质沉淀。</li>
		<li>将丙酮置于 -20 °C 冰箱中预冷。向蛋白沉淀中加入 0.5 mL 冷丙酮，于 15,000 x g4 °C 下离心 15 分钟。弃去上清液。重复此步骤两次。</li>
		<li>将沉淀在空气中干燥。用360 µL的50 mM Tris-HCl缓冲液（pH 8）重悬沉淀。 
		注意：如有需要，可使用脉冲超声波仪重新悬浮沉淀物。</li>
		<li>加入40 µL 0.1 M 二硫苏糖醇（终浓度10 mM），在55 °C摇床上孵育45分钟。加入50 µL 0.15 M 碘乙酰胺（终浓度17 mM），避光于室温摇床上孵育30分钟。</li>
		<li>制备胰蛋白酶溶液：将20 µg胰蛋白酶重悬于100 µL 50 mM碳酸氢铵溶液中。按照1:50（w/w）的胰蛋白酶与蛋白质比例，向样品中加入相应体积的胰蛋白酶溶液，确保pH为8，于37 °C摇床中孵育过夜。 
		注意：加入 1 M 碳酸氢铵以调节 pH 至 8。</li>
		<li>胰蛋白酶消化后，将样品冷却，短暂离心，加入10%甲酸调节pH至2–3以终止胰蛋白酶活性，随后进行样品脱盐处理。 
		注意：使用 µ-洗脱板进行样品脱盐。</li>
		<li>用200 µL甲醇通过真空抽滤对96孔板中的固相萃取吸附剂进行活化，重复三次，随后用200 µL 0.1%甲酸重复活化三次。上样后，用200 µL 0.1%甲酸洗涤样品三次。用100 µL 50%乙腈/0.1%甲酸溶液洗脱样品两次，收集至低蛋白吸附的0.5 mL离心管中。 
		注意：首先利用重力缓慢洗脱样品，随后开启低真空进行洗脱。</li>
		<li>使用浓缩仪将样品洗脱液完全蒸干，随后直接进行质谱分析，或于 -80 °C 保存至使用。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>质谱分析
	<ol>
		<li>将每个沉淀（含胰蛋白酶消化的肽段）重悬于50–100 µL溶液中，取1 µL注入质谱仪。 
		注意：优化复溶和注射体积以获得最大强度的LC/MS/MS信号。在本实验中，扫描峰中心处的最大信号（总离子流；TIC）范围为1E8至2E9。</li>
		<li>使用C18捕获柱（300 µm 内径 × 5 mm，5 µm，100Å），随后通过C18分离柱（75 µm 内径 × 250 mm，2 µm，100Å）进行肽段分离，流速设定为300 nL/min。将纳升电喷雾源毛细管温度设为275 °C，喷雾电压设为2 kV。</li>
		<li>采用线性梯度洗脱：5–35% B 持续 90 分钟，35–95% B 持续 3 分钟，95% B 维持 7 分钟，随后在 5% B 下平衡 25 分钟（A 相：0.1% 甲酸/水，B 相：0.1% 甲酸乙腈溶液）。对每次 MS1 扫描中强度最高的 15 个离子，使用 CID 模式采集其 MS2 谱图。每份样品进行 3 次质谱技术重复分析。 
		注意：请根据您的样品在特定质谱仪器上优化并使用合适的实验条件和参数。第5.2节中提到的条件/参数已在我们的实验室中使用并经过优化。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>蛋白质鉴定/定量
	<ol>
		<li>质谱分析后，使用 MSConvert 软件（http://proteowizard.sourceforge.net/tools/msconvert.html）将原始谱图文件转换为兼容的 mzXML 文件。</li>
		<li>将转换后的文件提交至 SEQUEST 搜索引擎，并设置搜索参数， 例如， UniProtKB/Swiss-Prot 小鼠数据库（最新权威审阅版本）；使用胰蛋白酶进行半酶解（KR/-后）；最多允许2个漏切位点；前体离子质量范围：400 至 4,500 amu；静态修饰：羧甲基化（C），57.021465 amu；肽段质量容差：50 ppm；碎片离子质量类型：单一同位素质量。 
		注意：可使用其他蛋白质数据库搜索工具和数据流程。如果使用数据库进行 例如 大鼠的数据库相比小鼠和人类的数据库尚不完善，因此可能需要针对小鼠（和/或人类）数据库进行搜索以提高蛋白质组的覆盖度。在此情况下，需去除蛋白质名称中的冗余信息。</li>
		<li>进行搜索后分析。设置数据查看的筛选条件。例如，将最低蛋白质概率（蛋白质阈值）设置为 95% 或 99% 即， 仅显示经统计学分析表明在样品中存在概率为95%或99%的蛋白质。设置肽段阈值筛选条件（例如， 95%), 即， 用于确定质谱图是否鉴定出肽段的最低概率阈值。选择用于判定蛋白质存在的最少肽段数量（建议蛋白质鉴定至少需要2个肽段）。</li>
		<li>评估已鉴定蛋白质的质量与数量。确保使用蛋白质特征性肽段进行定量。若鉴定出特定亚型，需确认其依据为观测到包含该亚型特有氨基酸序列的胰蛋白酶肽段。所有标注为“类似”或“假定”的蛋白质，均应进行比对分析，以确认所观测的肽段是否对应于已知蛋白质。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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<li>Fic, E., Kedracka-Krok, S., Jankowska, U., Pirog, A., Dziedzicka-Wasylewska, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+protein+precipitation+methods+for+various+rat+brain+structures+prior+to+proteomic+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Comparison of protein precipitation methods for various rat brain structures prior to proteomic analysis.</a> Electrophoresis. 31, 3573-3579 (2010).</li>
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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

多核糖体图谱分析可通过研究特定mRNA或整个转录组的翻译状态，来分析蛋白质翻译过程6,7。当需要研究局部翻译时（例如突触体），该方法也具有重要价值8。传统上，该方法涉及在蔗糖梯度中分离单核糖体和多核糖体及其相关的mRNA，并可结合基因组学或蛋白质组学技术以获得预期结果6,9。例如，我们课题组近期的一项研究揭示了在经历体外循环（CPB）的患者心脏中存在一种模拟缺血/再灌注损伤的转录后调控机制。利用多核糖体图谱分析，我们发现CPB术后心脏中核编码的线粒体蛋白翻译水平升高2。
本文介绍的动态蛋白质组多聚核糖体分析方法可以揭示与多聚核糖体相关联的mRNA群体及其正在被主动翻译的蛋白质的变化。由于mRNA的翻译在一定程度上受miRNA调控，对这些组分中的miRNA进...

心脏以动态方式对缺血（I）和再灌注（R）损伤作出反应。然而，目前对这一反应过程中蛋白质合成的急性变化仍缺乏深入了解。为解决这一问题，我们采用了已建立的多聚核糖体谱分析方法1，以鉴定反映核糖体和翻译调控因子从细胞质重新分布至多聚核糖体、以及新合成蛋白质（NSPs）增加所导致的蛋白质丰度变化。在缺血/再灌注（I/R）条件下，新蛋白质合成的增加发生在与新mRNA转录时间不一致的时间范围内2；此外，已有研究报道mRNA表达水平与蛋白质丰度之间存在不一致性3。基于这些原因，我们选择分析由蛋白质翻译所反映的动态蛋白质组的变化。为此，我们定量多聚核糖体组分中的mRNA，并分析多聚核糖体组分中的蛋白质组成。最后，由于微小RNA（miRs）可调控mRNA的翻译可用性，并可能干扰蛋白质翻译效率4,5，我们进一步检测了miRs在多聚核糖体组分中的分布情况，重点关注其对I/R的响应。
我们选择采用离体小鼠Langendorff灌流模型，在持续灌流的基础条件下、30分钟全心无血流缺血后，以及30分钟缺血再加30分钟再灌注后分别采集组织。随后将心脏组织溶解，并通过蔗糖梯度离心分离多聚核糖体，继而进行蛋白质组学分析，并分别通过PCR和微阵列技术选择性检测mRNA和miRNA。该方法组合为理解动态蛋白质组提供了一种强有力的手段，可同时检测mRNA、miRNA和新合成蛋白质（NSPs），并分析调控蛋白、miRNA和mRNA在非翻译组分、低效率多聚核糖体和高效率多聚核糖体之间的重新分布（见图1）。通过进一步分析关键调控因子（如eIF2α或mTOR）的磷酸化状态，可深入揭示该过程的动态调控机制。以下将详细描述各个实验步骤。

<table><tbody><tr><td>戊巴比妥</td><td>Vortech Phamaceuticals</td><td>9373</td><td>用于安乐死</td></tr><tr><td>肝素</td><td>Sagent</td><td>103424</td><td>用于兰格多夫灌流装置</td></tr><tr><td>镊子</td><td>Fine Science Tools</td><td>91110-10</td><td>用于悬挂心脏</td></tr><tr><td>兰格多夫系统</td><td>Radnoti + 自制</td><td>n/a</td><td>由定制吹制玻璃、导管和水浴组成的“四心脏”系统</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S7653-5KG</td><td>克雷布斯缓冲液和蔗糖梯度</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P5405</td><td>克雷布斯缓冲液和裂解缓冲液</td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;42&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>P-5504</td><td>克雷布斯缓冲液</td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>M7774-500G</td><td>克雷布斯缓冲液</td></tr><tr><td>葡萄糖</td><td>Sigma</td><td>G5767</td><td>克雷布斯缓冲液</td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>C1016-500G</td><td>克雷布斯缓冲液</td></tr><tr><td>蔗糖粉末</td><td>Sigma</td><td>S0389-1KG</td><td>蔗糖梯度</td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>208337</td><td>蔗糖梯度和裂解缓冲液</td></tr><tr><td>Tris-base</td><td>Sigma</td><td>T1503-1KG</td><td>蔗糖梯度和裂解缓冲液</td></tr><tr><td>二甲苯青</td><td>Sigma</td><td>X-4126</td><td>蔗糖梯度</td></tr><tr><td>放线菌酮</td><td>Sigma-aldrich</td><td>239763</td><td>蔗糖梯度和裂解缓冲液</td></tr><tr><td>RNaseOUT</td><td>Life Technologies</td><td>C00019</td><td>裂解缓冲液中的RNA酶抑制剂</td></tr><tr><td>Igepal CA-360 (NP40)</td><td>Sigma</td><td>I3021</td><td>裂解缓冲液</td></tr><tr><td>蛋白酶抑制剂混合片剂，不含EDTA</td><td>Roche</td><td>5056489001</td><td></td></tr><tr><td>超透明薄壁离心管，13.2 mL，14 mm × 89 mm</td><td>Beckman Coulter</td><td>344059</td><td></td></tr><tr><td>超速离心机</td><td>Beckman</td><td>LE-80K</td><td>用于梯度的超速离心</td></tr><tr><td>转子</td><td>Beckman</td><td>SW41</td><td>用于梯度的超速离心</td></tr><tr><td>Biologic LP（泵）</td><td>Biorad</td><td>731-8300</td><td>梯度的分级收集</td></tr><tr><td>BioFrac</td><td>Biorad</td><td>741-0002</td><td>梯度的分级收集</td></tr><tr><td>Eppendorf RNA/DNA LoBind 微量离心管，2 mL</td><td>Sigma</td><td>Z666513-100EA</td><td>梯度组分分离和RNA提取</td></tr><tr><td>TRIzol试剂</td><td>Life technologies</td><td>AM9738</td><td>RNA提取</td></tr><tr><td>荧光素酶对照RNA</td><td>Promega</td><td>L4561</td><td>RNA提取</td></tr><tr><td>氯仿</td><td>Fisher Scientific</td><td>C606-4</td><td>RNA提取</td></tr><tr><td>糖原，RNA级</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R0551</td><td>RNA提取</td></tr><tr><td>异丙醇</td><td>Sigma</td><td>I9516</td><td>RNA提取</td></tr><tr><td>乙醇</td><td>Sigma</td><td>E7023-1L</td><td>RNA提取</td></tr><tr><td>iScript cDNA合成试剂盒</td><td>BioRad</td><td>170-8891</td><td>逆转录</td></tr><tr><td>iTaq通用SYBR Green Supermix</td><td>BioRad</td><td>175-5122</td><td>定量PCR</td></tr><tr><td>miRNeasy Micro试剂盒（50）</td><td>Qiagen</td><td>217084</td><td>总RNA提取试剂盒</td></tr><tr><td>miScript II RT试剂盒（50）</td><td>Qiagen</td><td>218161</td><td>miRNA逆转录试剂盒</td></tr><tr><td>miScript Sybr Green PCR试剂盒（200）</td><td>Qiagen</td><td>218073</td><td>miRNA实时PCR表达分析试剂盒</td></tr><tr><td>Centrifuge 5424R</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>用于在不同温度下对1.5 mL或2.0 mL离心管进行离心，最高转速为21130 × g</td></tr><tr><td>Centrifuge 5810R</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>用于在不同温度下对实时PCR板进行离心，最高转速为2039 × g</td></tr><tr><td>My Cycler热循环仪</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td>用于逆转录</td></tr><tr><td>CFX96实时系统/C1000 Touch热循环仪</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td>用于实时PCR分析</td></tr><tr><td>miRNeasy血清/血浆内参对照</td><td>Qiagen</td><td>219610</td><td>用于RNA提取的质量控制</td></tr><tr><td>硬壳96孔PCR板，低轮廓，薄壁，带裙边，绿色/透明</td><td>Bio-Rad</td><td>HSP9641</td><td>用于实时PCR分析</td></tr><tr><td>Microseal 'B' PCR板密封膜，带粘合剂，光学透明</td><td>Bio-Rad</td><td>MSB1001</td><td>用于实时PCR板密封</td></tr><tr><td>Research plus单通道移液器，灰色；0.5–10 &amp;micro;L</td><td>Eppendorf</td><td>UX-24505-02</td><td>用于移液</td></tr><tr><td>PIPETMAN Classic移液器，P20</td><td>Gilson</td><td>F123600G</td><td>用于移液</td></tr><tr><td>PIPETMAN Classic移液器，P200</td><td>Gilson</td><td>F144565</td><td>用于移液</td></tr><tr><td>Rainin L-1000XLS Pipet-Lite XLS LTS移液器，100–1000 &amp;micro;L</td><td>Gilson</td><td>17011782</td><td>用于移液</td></tr><tr><td>糖原，RNA级</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R0551</td><td>提高总RNA提取效率</td></tr><tr><td>Posi-Click 1.7 mL离心管，自然色</td><td>Denville</td><td>C2170</td><td>RNA提取与储存；试剂混合</td></tr><tr><td>热循环管 - 0.2 mL，带独立盖，标准0.2 mL管，光学透明</td><td>Denville</td><td>C18098-4 (1000910)</td><td>逆转录反应</td></tr><tr><td>Sharp 10精密屏障吸头</td><td>Denville</td><td>P1096-FR</td><td>用于移液</td></tr><tr><td>Sharp 20精密屏障吸头</td><td>Denville</td><td>P1121</td><td>用于移液</td></tr><tr><td>Sharp 200精密屏障吸头</td><td>Denville</td><td>P1122</td><td>用于移液</td></tr><tr><td>LTS 1 mL带滤芯吸头</td><td>Rainin</td><td>RT-L1000F</td><td>用于移液</td></tr><tr><td>miScript引物检测试剂盒（200）</td><td>Qiagen</td><td>（根据miRNA不同而变化）</td><td>用于实时PCR分析</td></tr><tr><td>Gradient Master ver 5.3 Model 108</td><td>BioComp Instruments</td><td></td><td>用于制备蔗糖梯度</td></tr><tr><td>三氯乙酸</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T6399</td><td></td></tr><tr><td>丙酮</td><td>Sigma Aldrich</td><td>650501</td><td></td></tr><tr><td>Tris盐酸盐</td><td>Amresco</td><td>M108</td><td></td></tr><tr><td>二硫苏糖醇</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP172</td><td></td></tr><tr><td>碘乙酰胺</td><td>Gbiosciences</td><td>RC-150</td><td></td></tr><tr><td>测序级修饰猪胰蛋白酶</td><td>Promega</td><td>V5111</td><td></td></tr><tr><td>碳酸氢铵</td><td>BDH</td><td>BDH9206</td><td></td></tr><tr><td>甲酸，Optima LC/MS级</td><td>Fisher Chemical</td><td>A117</td><td></td></tr><tr><td>甲醇，Optima LC/MS级</td><td>Fisher Chemical</td><td>A454</td><td></td></tr><tr><td>乙腈，Optima LC/MS级</td><td>Fisher Chemical</td><td>A996</td><td></td></tr><tr><td>Protein LoBind离心管，0.5 mL</td><td>Eppendorf AG</td><td>22431064</td><td></td></tr><tr><td>Protein LoBind离心管，1.5 mL</td><td>Eppendorf AG</td><td>22431081</td><td></td></tr><tr><td>HLB &amp;micro;Elution板，30 &amp;micro;m</td><td>Oasis</td><td>186001828BA</td><td></td></tr><tr><td>SpeedVac浓缩仪</td><td>Thermo Scientific</td><td>Savant SPD2010</td><td></td></tr><tr><td>超声破碎仪</td><td>Qsonica</td><td>Oasis180</td><td></td></tr><tr><td>离心机</td><td>Thermo Scientific</td><td>Sorvall Legend micro 21R</td><td></td></tr><tr><td>LC捕获柱PepMap 100 C18</td><td>Thermo Scientific</td><td>160454</td><td></td></tr><tr><td>LC分离柱PepMap RSLC C18</td><td>Thermo Scientific</td><td>164536</td><td></td></tr><tr><td>质谱仪</td><td>Thermo Scientific</td><td>Orbitrap Elite离子阱质谱仪</td><td></td></tr><tr><td>MSConvert软件</td><td>ProteoWizard Toolkit</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sorcerer-SEQUEST软件</td><td>Sage-N Research, Inc.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

离体小鼠心脏langendorff灌注后多聚核糖体的动态蛋白质组学与mirna分析

Dynamic Proteomic and miRNA Analysis of Polysomes from Isolated Mouse Heart After Langendorff Perfusion

研究蛋白质翻译的动态变化需要专门的方法。本文利用离体灌流小鼠心脏结合多聚核糖体分析技术，检测了在缺血和再灌注过程中新合成蛋白质的变化。为了进一步理解蛋白质翻译的动态变化，我们对负载在细胞质核糖体（多聚核糖体或多聚体）上的 mRNA 进行了表征，同时还分离了线粒体多聚核糖体，并比较了在高效翻译组分（mRNA 上结合多个核糖体）、低效翻译组分（结合较少核糖体，也包括线粒体多聚核糖体）以及非翻译组分中 mRNA 和蛋白质的分布情况。microRNA（miRNA）也可与正在翻译的 mRNA 结合，从而降低翻译效率；因此，我们还分析了 miRNA 在各组分中的分布。我们在基础灌流状态、30 分钟全无灌注缺血末期以及再灌注 30 分钟后，分别检测了 mRNA、miRNA 和蛋白质的分布情况。本文展示了完成该分析所使用的方法，特别是蔗糖梯度中蛋白质提取的优化策略——此前尚未见相关报道——并提供了一些代表性结果。

mRNA 分析 
mRNA 结果可以表示为特定 mRNA 在各组分中的分布情况（图 3A）；为了进行定量分析，可将多核糖体翻译组分合并，与非翻译组分进行比较（图 3B），并以翻译组分与非翻译组分中 mRNA 丰度的比值形式呈现。通过将高效多核糖体组分与低效多核糖体组分（以及非翻译组分）分别分析，可以获得更多信息。在分析 miRNA 时这一点尤为重要，因为 miRNA 富集于低效组分中（在此处干扰其靶 mRNA 的蛋白质翻译）。
与假手术组相比，在小鼠心脏经历缺血以及缺血/再灌注处理后，某种特定mRNA在翻译组分与非翻译组分间的分布发生变化，其代表性结果如图4所示。
<p class="jove_content" fo:keep-togeth...

本文介绍了一种在离体灌注小鼠心脏上进行多聚核糖体分析的实验方案。我们描述了心脏灌注、多聚核糖体分析的方法，以及针对多聚核糖体组分中mRNA、miRNA和多聚核糖体蛋白质组的分析方法。

离体小鼠心脏Langendorff灌注后多聚核糖体的动态蛋白质组学与miRNA分析

研究蛋白质翻译的动态变化需要采用专门的方法。本文通过分析……响应下新合成蛋白质的变化情况

该方法有助于解答有关动态蛋白质合成及参与该过程的蛋白质组的关键问题。该技术能够鉴定出正在被选择进行翻译的mRNA、可参与并干扰翻译过程的microRNA，以及参与蛋白质翻译或自身正在被翻译的蛋白质。该方法可为心脏对压力刺激的响应提供深入见解，也可应用于其他器官对压力急性反应的研究。演示该实验步骤的是来自 Jennifer Van Eyk 实验室的项目科学家 Miroslava Stastna。实验当天，将梯度混合器的左侧室加入 5 毫升 15% 蔗糖梯度溶液，右侧室加入 5 毫升 50% 蔗糖梯度溶液。打开活塞并启动泵，使用磁力搅拌器搅拌两个小室，并通过连接第二个活塞的管道，使混合后的蔗糖溶液流入置于冰上的薄壁超速离心管中。接下来，将新鲜或冷冻的心脏组织在冰上用匀浆缓冲液中使用POLYTRON匀浆15秒。孵育结束后，离心裂解液以去除不溶性物质，并收集上清液。保留50微升上清液用于蛋白质定量、RNA提取及RNA完整性分析，将剩余上清液中的100至500微升小心铺加到梯度溶液上。使用新鲜的裂解缓冲液平衡两个梯度管之间的体积，并将样品置于带有摆动桶转子的超速离心机中进行超速离心。在离心前和离心后均需格外小心，避免扰动蔗糖梯度。收集梯度时，设置馏分收集器在最初三分钟内弃去收集液，随后以每分钟1毫升的速度，在4至19分钟内连续收集17个馏分，同时连续监测254纳米处的吸光度，以分别获取重链、轻链及非翻译组分。收集到每个组分后应立即置于冰上。若不能立即处理，需将样品储存在零下80摄氏度。为从多聚核糖体组分中提取蛋白质，将收集的蔗糖组分合并为三个最终组分，并将其标记为重链、轻链和非翻译组分。将每份样品各取 0.5 毫升与 60 微升 100% 三氯乙酸（TCA）混合。将混合物于 -20 °C 避光孵育过夜。次日早晨，在冰上融化样品，然后通过离心沉淀蛋白质。弃去上清液，再用 0.5 毫升预冷至负 20 摄氏度的丙酮洗涤沉淀物，每次离心后各洗涤一次，共洗涤两次。确保三氯乙酸（TCA）沉淀后的沉淀物完全溶解，必要时使用脉冲超声处理以保证完全溶解。最后一次洗涤后，将沉淀物在空气中干燥，然后重悬于 360 微升 Tris-HCl 缓冲液中。然后加入 40 µL 二硫苏糖醇，在 55 °C 下振荡孵育 45 分钟。孵育结束后，在避光条件下，向样品中加入 50 µL 碘乙酰胺，在室温下于摇床上孵育 30 分钟，随后按照 1:50 的酶与蛋白质量比加入胰蛋白酶，于 37 °C 振荡过夜孵育。次日早晨，样品冷却后短暂离心，并用 10% 甲酸将 pH 调至 2 至 3，以终止胰蛋白酶活性。为去除样品中的盐分，首先用 200 微升甲醇对 96 孔板中的各孔填料进行三次预处理，每次 200 微升；随后用每孔 200 微升的 0.1% 甲酸进行三次平衡。接着将样品加入各孔中，并用每孔 200 微升的 0.1% 甲酸洗涤样品三次。利用重力作用，随后施加低真空，用 100 微升含 50% 乙腈的 0.1% 甲酸溶液洗脱两次，将洗脱液收集至每个样品对应的低蛋白吸附 0.5 毫升离心管中。然后使用浓缩仪将样品洗脱液蒸发至干燥，并将每份胰蛋白酶消化的肽段沉淀重悬于50至100微升含0.1%甲酸的溶液中，用于质谱分析。可进行mRNA分析，以评估特定目标mRNA在各组分中的分布情况，或对多核糖体翻译组分（合并）与非翻译组分之间的mRNA丰度比值进行定量和比较。例如，此处展示了小鼠心脏经缺血处理或缺血-再灌注处理后，与假手术心脏处理相比，mRNA在翻译组分与非翻译组分之间分布的变化情况。在此代表性实验中，对混合的重组分中部分 microRNA 的分析显示，在缺血条件下有 22 种 microRNA 与多聚核糖体相关，9 种 microRNA 在缺血和再灌注条件下均相关，另有 7 种在两种条件下共有，表明 microRNA 与多聚核糖体的结合在缺血和再灌注应激条件下具有动态变化。此外，大多数线粒体核糖体蛋白在轻组分中被鉴定到，而大多数胞质核糖体蛋白则在重和轻两个组分中均有检出。在进行该实验操作时，需特别注意小心处理蔗糖梯度。在我们的实验流程中，选择三氯乙酸（TCA）沉淀法从多聚核糖体组分中提取蛋白质，是基于该方法能够有效处理高浓度蔗糖组分，并且可通过质谱鉴定出较多蛋白质。通常，初次接触该方法的研究人员可能会因蔗糖梯度的重复性问题而遇到困难。TCA沉淀法具有多项优势：仅需少量体积即可沉淀蛋白质，沉淀物在管底清晰可见，且沉淀过程中不会出现蔗糖的累积。

dynamic-proteomic-mirna-analysis-polysomes-from-isolated-mouse-heart

Research

科研

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

Langendorff 灌注后离体小鼠心脏 Polysomes 的动态蛋白质组学及 miRNA 分析

采用Langendorff模式的离体心脏灌流结合31P核磁共振波谱法，将生物化学与生理学整合于同一实验中。该方案可在连续监测心脏生理功能的同时，动态测定心肌高能磷酸化合物的含量及其转换速率。若操作正确，此技术是评估心脏能量代谢的有力手段。...

使用31P 核磁共振波谱法评估离体小鼠心脏功能与能量代谢

单细胞表达谱分析可对单个细胞进行详细的基因表达分析。我们描述了心肌细胞的分离方法，以及对所得裂解液进行全转录组微阵列分析或特定靶标qPCR检测的制备步骤。...

成年小鼠心肌细胞的单细胞转录谱分析

质谱技术的进步使得对多种组织中蛋白质表达和修饰的高通量分析成为可能。结合亚细胞组分分离技术和疾病模型，定量质谱分析与生物信息学方法能够揭示生物系统中的新特性。本文所述方法用于分析心脏疾病背景下与染色质相关的蛋白质，且可轻松适用于其他人类疾病的体内模型。...

疾病中染色质蛋白质组的定量分析

为了研究心肌细胞的收缩功能和钙瞬变，可从野生型和突变型小鼠心脏中分离出单个心肌细胞。这有助于表征由任何原因引起的心功能障碍中细胞功能障碍所起的作用。...

小鼠心肌细胞的分离与生理学分析

由于可获取的组织量有限，对早期胚胎小鼠瓣膜中蛋白质表达的分析一直受到阻碍。本论文提供了一种从发育中的胚胎小鼠瓣膜区域提取蛋白质以进行蛋白质印迹分析的实验方案。...

从小鼠胚胎心脏瓣膜发育区域分离蛋白质

micro-RNAs（miRNAs）是一类短小且高度同源的RNA序列，可作为信使RNA（mRNAs）的转录后调控因子。目前的miRNA检测方法在灵敏度和特异性方面存在差异。本文描述了一种结合了 原位...

利用小鼠心脏切片进行组织特异性miRNA表达谱分析 原位 杂交

本文描述了一种从单个成年小鼠心脏的心房和心室同时分离心肌细胞和非心肌细胞的方法。该方案可稳定获得高活力的心肌细胞和非心肌细胞，并详细说明了适用于细胞表型鉴定和体外分析的优化细胞特异性培养条件。...

成年小鼠心脏中同时分离与培养心房心肌细胞、心室心肌细胞及非心肌细胞

一种用于从小鼠中分离心肌细胞的顺行灌流方法

哺乳动物大脑的发育需要在翻译水平上对基因表达进行精确调控。本文介绍了一种多聚核糖体分析系统，该系统配备易于组装的蔗糖梯度制备与分级分离平台，可用于评估发育中大脑内mRNA的翻译状态。...

利用多聚核糖体分析法研究小鼠发育大脑中的翻译过程

本文介绍了一种从心肌梗死（MI）后小鼠心脏中分离出足量且高活性的非心肌细胞的实验方案。该方法可用于后续的单细胞测序、流式细胞术分析以及原代细胞培养。...

制备心肌梗死后成年小鼠心脏的非心肌细胞悬液用于单细胞RNA测序

学习Langendorff灌注后离体小鼠心脏多聚核糖体的动态蛋白质组学及miRNA分析方法。该技术可识别参与翻译的mRNA、干扰翻译的microRNA及相关蛋白质，为研究心脏应激反应提供重要工具。

离体小鼠心脏Langendorff灌注后多聚核糖体的动态蛋白质组学与miRNA分析

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