小鼠骨髓来源树突状细胞和巨噬细胞中荧光融合蛋白的表达

该方法有助于解答巨噬细胞和树突状细胞生物学领域中的关键问题，例如这些细胞类型中各种蛋白质的亚细胞定位及其动态变化。该技术的主要优点在于操作相对简单、成本低廉，并且相较于目前大多数其他可用方法，其表达效率和稳定性更佳。本次实验操作将由我实验室的研究生 Jarmila Kralova 演示。

为制备逆转录病毒，将Platinum Eco包装细胞的单细胞悬液接种于10厘米的培养皿中，并在15毫升DMEM培养基中培养，该培养基需添加10%胎牛血清（FBS），直至细胞融合度达到50%至60%。次日，将20微克目标逆转录病毒载体和10微克PCL eco包装载体加入1毫升无血清DMEM中，轻轻混匀。另取一管，将75微升PEI加入1毫升无血清且不含抗生素的DMEM中，室温孵育5分钟，随后将两管溶液混合，继续在室温下孵育10分钟。

接下来，小心地将Platinum Eco细胞中的培养基更换为8毫升新鲜的37摄氏度DMEM，该培养基添加有2% FBS，然后将转染混合物逐滴小心加入培养板中。在37摄氏度孵育4小时后，弃去上清液，加入10毫升37摄氏度、含10% FBS的DMEM，在37摄氏度继续孵育24小时。次日，使用5毫升移液管将含有嗜同种逆转录病毒颗粒的上清液转移至15毫升离心管中，并通过离心去除细胞碎片及细胞成分。

同时，向培养皿中加入10毫升37摄氏度的含10%胎牛血清（FBS）的DMEM培养基，在37摄氏度下继续孵育24小时，并按上述方法收集第二轮病毒颗粒。为收获骨髓，在组织培养超净台中，使用镊子和剪刀去除后肢的皮肤及部分肌肉组织，小心地将髋臼从髋关节中分离，注意不要折断股骨。在踝关节处剪去足部，并用70%乙醇喷洒骨骼。

然后用纸巾去除剩余的肌肉组织，将骨骼放入含有2% FBS的PBS溶液的5厘米培养皿中。接着弯曲每组骨骼的膝关节，用剪刀小心地将骨骼分离。用剪刀切除其中一块骨骼两端各约一至两毫米的骨骺部分，并使用装有新鲜PBS加FBS、配备30号针头的2或5毫升注射器，从骨骼两端冲洗骨髓至15毫升离心管中。

当从每块骨骼中收集完骨髓后，通过离心沉淀骨髓细胞，并将沉淀物重悬于 2.5 毫升红细胞裂解缓冲液中，在室温下裂解 2 至 3 分钟。裂解完成后，将细胞通过 100 微米细胞筛过滤至新的 15 毫升离心管中，并加入 12 毫升含 FBS 的 PBS 恢复细胞活力。将沉淀物重悬于 DMEM 培养基中，添加 10% FBS 和抗生素用于细胞计数，并将 5 × 10⁶ 至 10 × 10⁶ 个骨髓细胞接种于 10 毫升 DMEM 培养基中，该培养基需补充血清和巨噬细胞集落刺激因子（MCSF），细胞接种于 10 厘米未经组织培养处理的培养皿中。

培养第五天，轻轻倾斜细胞培养皿，除去皿边缘表面除约5毫升外的全部培养基。然后向培养皿中加入20毫升新鲜的、添加了FBS和MCSF的37°C培养基，将细胞放回细胞培养箱中继续培养。收获细胞时，在培养第六至第七天，移除所有培养基和悬浮细胞，并用37°C的PBS洗涤细胞培养物。

在组织培养孵育箱中，使用5毫升0.02% EDTA和PBS在37摄氏度下处理3至5分钟，使贴壁细胞脱落，并用5毫升移液管轻轻吹打，将解离的细胞从培养板底部冲洗下来。随后将细胞转移至含有25毫升新鲜PBS的50毫升离心管中。为在骨髓来源的抗原呈递细胞中诱导EGFP标记蛋白的表达，在细胞分化方案开始时，将骨髓细胞稀释至每毫升DMEM加FBS及抗生素溶液中含有2×10⁶至5×10⁶个细胞，并在每孔加入1毫升培养基进行接种，同时补充适当的分化细胞因子。

在细胞培养箱中孵育四到六小时后，加入两毫升第一轮收集的病毒液（补充polybrene），并通过离心及在细胞培养箱中孵育四小时的方式对细胞进行转导。转导结束后，将每个孔中的非贴壁细胞转移至单独的15毫升离心管中，并通过离心收集细胞。若需要更多数量的细胞，可将多个孔中的细胞用相同的质粒感染，然后在诱导分化前合并细胞。

然后将沉淀重悬于10毫升培养基中，培养基中需添加适当的分化细胞因子，并将细胞接种至每管对应的一块10厘米未经组织培养处理的培养皿中，进行为期六至八天的培养，操作如前所述。在收集第二轮含病毒的上清液后，通过流式细胞术评估Platinum Eco转染效率，结果显示PSTPIP2-EGFP的平均转染效率为62%，OPAL1-EGFP为53%。逆转录病毒转导不影响骨髓来源细胞的分化状态，两种培养体系中超过90%的细胞在转导任一种病毒后，对其相应标志物均呈阳性。

并且观察到两种分化细胞均表现出相应且典型的形态学变化。值得注意的是，无论使用何种逆转录病毒，骨髓来源树突状细胞培养物中EGFP的整体表达水平均低于骨髓来源巨噬细胞的EGFP表达水平。在进行该实验操作时，需特别注意：如果计划将细胞从培养皿中取出用于实验，则必须使用未经过组织培养处理的塑料培养皿，这类培养皿通常用于细菌培养。

在完成该实验步骤后，可进一步采用活细胞成像、超分辨率显微镜或其他类型的显微技术，以探究树突状细胞和巨噬细胞中目标蛋白的亚细胞定位及其动态变化。该技术为免疫学领域的研究人员探索巨噬细胞和树突状细胞所表达蛋白的分布特征及空间关系奠定了基础，并有助于深入理解这些蛋白在免疫应答中的功能。请注意，操作病毒颗粒具有极高的危险性，在执行本实验过程中，必须采取必要的安全防护措施，例如尽量减少气溶胶的产生、佩戴个人防护装备，并在层流罩内进行操作。