人牙小泡干细胞的分离、鉴定及微 rna 遗传修饰
November 16th, 2018
该协议描述了从人毛囊中提取的牙干细胞的瞬态基因工程。应用的非病毒性修饰策略可以为治疗性干细胞产品的改进奠定基础。
这种方法可以帮助回答再生医学领域的关键问题，例如人类牙泡干细胞可以进行基因工程，以提高其治疗性能。该技术的主要优点是，干细胞可以通过微RNA引入进行修饰，而不会带来稳定的基因组整合的危险。开始两个卵泡的酶消化程序，通过预热到室温，人类牙卵泡干细胞或hDFSC培养基和PBSPSG溶液。
解冻一个等分，每个胶原蛋白类型 I 和 Dispase II 库存解决方案。通过将500微升的胶原酶 I 型库存溶液和 500 微升的 Dispase II 库存溶液添加到含有 1% 抗生素剂的 4 毫升基础介质中，准备消化液。为避免在人类牙齿卵泡干细胞隔离洗涤缓冲液和培养剂期间发生现场污染，必须含有抗生素制剂。
将提取的牙泡放在无菌培养皿中。加入10毫升的PBSPSG溶液，清洗提取的组织。吸气并丢弃溶液，并添加新鲜的 PBSPSG 溶液以重复洗涤。
使用无菌手术刀肉末提取的毛囊成片，如果约1由1毫米。将切碎的组织和 PBSPSG 溶液从培养皿转移到 50 毫升锥形离心管中，用 10 毫升 PBSPSG 溶液清洗 Petri 盘，然后将溶液转移到同一管中。在室温下以 353 x g 离心锥形管 10 分钟。
在托盘组织中加入5毫升的消化溶液，轻轻混合溶液和组织，在37摄氏度和5%CO2的摇培养箱中孵育混合物两个小时。两小时后，将消化的细胞和组织悬浮液在353克下离心10分钟。丢弃上流剂，并在 HDFSC 培养介质的 6 毫升中重新悬挂获得的托盘。
在25平方厘米的细胞培养瓶中播种细胞悬浮液，并在37摄氏度下孵育细胞。在细胞收获和HDFSC表征后，如文本协议所述，在24个井细胞培养板中播种hDFSC。在37摄氏度、5%CO2和20%氧气下孵育24小时。
第二天，在66.7微升的血清介质中稀释40个微RNA，并涡旋溶液。稀释0.67微升的阳离子脂基，转染试剂在66.7微升的减少血清介质，涡流溶液，并在室温下孵育五分钟。五分钟后，将预稀释的微RNA加入预稀释的转染试剂中，混合溶液，在室温下孵育15分钟。
接下来，将准备好的转染复杂性直接添加到细胞上的培养培养中。通过来回摇动24个井细胞培养板轻轻混合。在37摄氏度下孵育细胞24小时。
转染后24小时，在各15毫升锥形离心管中收集样品的上一代。用 1 毫升 PBS 清洗细胞，然后将 PBS 转移到各自的离心管中。将500微升滴水和EDTA加入细胞，在37摄氏度下孵育24井板3分钟。
通过为细胞添加1毫升细胞培养培养，并将溶液转移到各自的离心管中，停止三辛化。在300 x g和4摄氏度下将细胞离心10分钟。从这里开始，除非另有说明，否则将细胞和试剂留在冰上。
丢弃上流剂，将细胞重新填充在100微升染色缓冲液中，将细胞溶液转移到1.5毫升微离心管中。在每个样品中加入0.5毫升胺反应染料，以区分活细胞和死细胞。轻轻混合溶液，在4摄氏度下孵育10分钟。
向细胞中加入1毫升PBS，在300g和4摄氏度的离心机下10分钟丢弃上清液，将细胞重新加到100微升PBS中，加入33微升的甲醛，混合溶液，将样品储存在4摄氏度的高温下，防止光，直到流式测光。将样品转移到适合流式细胞测量的管中，并使用文本协议中描述的浇注策略执行流式细胞测量。分离的人类牙卵泡干细胞显示了为定义间质性细胞而描述的所有特征，细胞是塑料粘附体，在标准培养条件下显示出一种玻璃纤维，如形态。
流细胞测量分析显示，hDFSCs表示一组某些表面抗原，包括CD29、CD44、CD73、CD90和CD105。CD45 和 CD117 缺席。在特定的体外培养条件下，细胞的致生、骨源和成体分化潜力得到免疫污染（一种脂肪酸结合蛋白:骨钙素和Aggrecan）的证实。
用于细胞毒性和Cy3的定量的浇注策略在转染后24小时标记了微RNA吸收效率，确认100%的存活细胞中微RNA吸收。转染和未转染样品中可比数量的死细胞表明，微RNA的引入没有细胞毒性效应。按照此过程，可以执行其他方法，如转样，以回答其他问题，如细胞实验室可塑性。
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概述
本协议描述了从人类牙齿乳头提取的牙干细胞的暂时基因工程。该方法允许使用microRNA引入进行干细胞修改，而无需承担与稳定基因组整合相关的风险。
关键研究组成部分
科学领域
- 再生医学
- 干细胞生物学
背景
- 人类牙齿乳头干细胞（hDFSC）具有潜在的治疗应用。
- 基因工程可以增强这些干细胞的特性。
- 非病毒修改策略是传统方法的更安全替代方案。
研究目的
- 探索hDFSC的基因工程以改善治疗效果。
- 建立牙干细胞暂时修改的协议。
使用的方法
- 牙齿乳头的酶解。
- 配制含I型胶原酶和II型弹性酶的消化液。
- 在洗涤缓冲液和培养基中使用抗生素剂防止污染。
- microRNA引入以实现暂时的基因修改。
主要结果
- 成功实现了hDFSC的暂时修改。
- 该方法通过避免稳定基因组整合证明了安全性。
- 观察到干细胞的治疗特性增强。
结论
- 该协议为改进干细胞治疗提供了基础。
- 暂时的基因工程可以成为再生医学的可行方法。
常见问题
Executive Industry Relevance
This protocol enables transient genetic modification of human dental follicle stem cells using microRNA without stable genome integration, addressing a key safety concern in stem cell-based therapies. The approach supports preclinical de-risking by allowing functional validation of therapeutic enhancements prior to transplantation. It provides a scalable, non-viral method to optimize stem cell efficacy for regenerative medicine applications.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables functional interrogation of microRNA-mediated pathways in stem cell behavior and differentiation potential.
- Operational Value: Provides a reliable method to modulate stem cell phenotype without genomic alteration, supporting hypothesis-driven target validation.
- Predictive Value: Facilitates assessment of therapeutic mechanism through transient phenotypic changes, improving confidence in lead candidate selection.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates standardized, transfection-ready stem cell populations for consistent compound or modulator screening.
- Operational Value: Delivers quantifiable microRNA uptake and viability readouts via flow cytometry, enabling assay reproducibility across laboratories.
- Scalability: Uses cationic lipid transfection compatible with multi-well plate formats for medium-throughput screening workflows.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Supports progression from isolated stem cells to functionally modified cells for preclinical efficacy testing.
- Mechanistic De-risking: Allows evaluation of microRNA effects on stem cell function without insertional mutagenesis concerns.
- Disease-Relevant System: Utilizes postnatal dental follicle as an accessible source of multipotent stem cells with high proliferation potential for tissue repair modeling.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery-to-preclinical continuum by providing a transient modification step after stem cell isolation and characterization, enabling functional optimization before downstream applications.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on stem cell fate and behavior through controlled microRNA introduction.
- Screening: Enables standardized preparation of stem cells for evaluating genetic or pharmacological modulators in multi-well formats.
- Analytics: Provides flow cytometry-based quantification of transfection efficiency and cytotoxicity, supporting objective comparison of conditions.
- Translational Research: Bridges stem cell isolation and preclinical validation by generating modified cells with enhanced therapeutic potential.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable transfection platform applicable to multiple stem cell types and microRNA candidates.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Enhances predictive confidence in stem cell therapeutics by enabling transient, reversible modulation of gene expression.
- Operational Value: Offers a safe, efficient, and reproducible non-viral transfection method with minimal cytotoxic effects.
- Strategic Value: Reduces late-stage biological risk by allowing preclinical assessment of mechanism without genomic integration hazards.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of stem cell candidates through functional validation prior to IND-enabling studies.
Implementation Considerations
- Requires expertise in stem cell culture, enzymatic tissue dissociation, and transfection techniques.
- Needs access to shaking incubators, flow cytometers, and standard cell culture infrastructure.
- Demands standardization of transfection reagent ratios and incubation times across teams for reproducibility.
- Requires adaptation of microRNA dosage and transfection conditions for different stem cell sources or species.
- Limited to transient effects; not suitable for applications requiring stable genetic modification.
