人牙囊干细胞的分离、鉴定及基于微小RNA的遗传修饰

该方法有助于回答再生医学领域中的关键问题，例如人类牙囊干细胞是否可通过基因工程改造以增强其治疗特性。该技术的主要优势在于，可通过引入微小RNA（microRNA）对干细胞进行修饰，而不会产生基因组稳定整合的风险。开始进行两个牙囊的酶消化操作时，需将人牙囊干细胞（hDFSC）培养基和PBSPSG溶液预热至室温。

解冻 I 型胶原酶和 II 型中性蛋白酶储存液各一份。取 500 微升 I 型胶原酶储存液和 500 微升 II 型中性蛋白酶储存液，加入至含有 1% 抗生素试剂的 4 毫升基础培养基中，配制消化液。为避免在人牙囊干细胞分离过程中发生污染，所使用的洗涤缓冲液和培养基必须含有抗生素试剂。

将提取的牙囊置于无菌培养皿中。加入 10 毫升 PBSPSG 溶液以洗涤提取的组织。吸除并弃去溶液，再加入新鲜的 PBSPSG 溶液重复洗涤步骤。

使用无菌手术刀将提取的卵泡切成约1毫米×1毫米大小的组织块。将切碎的组织和PBSPSG溶液从培养皿转移至50毫升锥形离心管中，用10毫升PBSPSG溶液冲洗培养皿，并将冲洗液一并转移至同一离心管中。在室温下以353 × g离心10分钟。

向沉淀的组织中加入5毫升消化液，轻轻混匀溶液与组织，在37摄氏度、5%CO2条件下于摇床培养箱中孵育两小时。两小时后，在室温下以353 ×g离心消化后的细胞和组织悬液10分钟。弃去上清液，将获得的沉淀物重新悬浮于6毫升HDFSC培养基中。

将细胞悬液接种至25平方厘米的细胞培养瓶中，在37摄氏度条件下培养细胞。人真皮成纤维样干细胞（hDFSC）的收获及鉴定步骤如文本方案所述，将hDFSCs接种于24孔细胞培养板中。在37摄氏度、5% CO₂和20%氧气条件下培养24小时。

次日，将40皮摩尔的microRNA溶于66.7微升低血清培养基中，并涡旋混匀。将0.67微升基于阳离子脂质的转染试剂溶于66.7微升低血清培养基中，涡旋混匀后，室温孵育5分钟。5分钟后，将预先稀释的microRNA加入预先稀释的转染试剂中，混匀溶液，并在室温下孵育15分钟。

接下来，将制备好的转染复合物逐滴直接加入细胞的培养基中。通过前后轻轻摇动24孔细胞培养板，使液体轻柔混匀。将细胞在37摄氏度条件下孵育24小时。

转染后24小时，用相应的15毫升圆锥形离心管收集各样本的上清液。用1毫升PBS洗涤细胞，并将PBS转移至相应的离心管中。向细胞中加入500微升胰蛋白酶和EDTA，将24孔板在37摄氏度孵育3分钟。

加入 1 毫升细胞培养基以终止消化反应，并将溶液转移至相应的离心管中。在 4 摄氏度下以 300 × g 离心 10 分钟。此后，除非另有说明，始终将细胞和试剂置于冰上。

弃去上清液，将细胞重悬于100 µL染色缓冲液中，并将细胞悬液转移至1.5 mL微量离心管中。向每个样品中加入0.5 mL胺反应性染料，以区分活细胞与死细胞。轻轻混匀溶液，在4 °C孵育10分钟。

向细胞中加入1毫升PBS，于300g、4摄氏度离心10分钟。弃去上清液，将细胞重悬于100微升PBS中，加入33微升多聚甲醛，混匀溶液，将样品置于4摄氏度避光保存，直至进行流式细胞术检测。将样品转移至适用于流式细胞术检测的管中，按照文本方案中描述的设门策略进行流式细胞术分析。分离获得的人牙囊干细胞表现出间充质基质细胞定义所描述的全部特征：在标准培养条件下，细胞贴壁生长，并呈现类似玻璃纤维的形态。

流式细胞术分析显示，人牙龈来源的干细胞（hDFSCs）表达一组特定的表面抗原，包括CD29、CD44、CD73、CD90和CD105，而CD45和CD117则不表达。在特定的体外培养条件下，通过免疫染色证实了这些细胞具有成脂、成骨和成软骨分化潜能，分别检测到脂肪酸结合蛋白、骨钙素和聚集蛋白聚糖。

转染后24小时，用于定量细胞毒性和Cy3标记的microRNA摄取效率的门控策略证实，100%的活细胞均摄取了microRNA。转染与未转染样品中死亡细胞数量相当，表明microRNA高效导入且无细胞毒性效应。采用此方法后，可进一步开展其他实验，如转分化，以回答细胞可塑性（Cytolab plasticity）等其他科学问题。