Name: 第三代机械 Vaping 装置生成电子烟气溶胶: 毒理学研究的应用 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 39 s
Description: 了解第三代机械电子烟装置生成气溶胶的标准化方法，用于毒理学研究。该技术通过计算机控制暴露系统，帮助研究人员评估电子烟气溶胶吸入对健康的影响，并分析其复杂成分。

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本项目得到了路易斯安那州州长生物技术计划（GBI-BOR#013）资助（AP），以及路易斯安那州立大学兽医学院教师启动资金（AN）的支持。

小鼠的饲养和操作均遵循美国国立卫生研究院（NIH）《实验动物护理与使用指南》。所有涉及小鼠的操作程序和方案均经路易斯安那州立大学机构动物护理与使用委员会批准。下述描述针对本实验所用设备，具体信息见材料/设备表。所有供气均经过高效微粒空气（HEPA）过滤。
1. 准备
<ol>
	<li>研究 &amp;#38; 仪器设备
	<ol>
		<li>获得必要的批准（例如., 动物照护与使用委员会（IACUC））以及研究相关的培训。</li>
		<li>在通风良好的区域安装设备，并熟悉其操作方法。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>重量法测量
	<ol>
		<li>称量一张洁净的全新25 mm滤膜，记录其重量，将滤膜放入滤膜盒中。</li>
		<li>将装有滤膜的滤膜盒与个人采样泵及流量计串联，流量计应能准确测定1 L/min（LPM）的流量。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>电子烟设备
	<ol>
		<li>将雾化器旋入储液罐底座（图1). 
		注意：可提供线圈电阻为 0.15、0.5 或 1.5 Ω 的雾化器。</li>
		<li>关键步骤：向雾化器中加入几滴（2 至 3 滴）电子烟液，以确保棉芯充分浸润，避免干烧图2).</li>
		<li>将储液管套插入储液管中，然后将装有雾化器的储液管底座旋入储液管套中（图1).</li>
		<li>将组装好的烟弹拧到电子烟主机上。确保烟弹开口朝上，并将顶盖安装到烟弹顶部。图1).</li>
		<li>将电子烟装置放置在底板上，通过旋转电磁阀的推杆完成操作。就位后，将其旋转复位，使其与电子烟装置上的触发按钮对齐。</li>
		<li>将电子烟装置的末端连接至冷凝器的下部 通过 一个双向阀接头和一段管路（图3).</li>
		<li>确保冷凝器的上端正确连接至气溶胶发生系统和气溶胶暴露室 通过 合适的管路。</li>
		<li>关键步骤：确认气溶胶浓度测量仪器已安装在气溶胶暴露室的出口处。</li>
		<li>关键步骤：取下储液罐盖，向储液罐中加入10 mL电子烟液，然后重新装上储液罐盖。 
		注意：此体积适用于2小时的暴露时间。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 暴露
<ol>
	<li>软件连接
	<ol>
		<li>实验当天，打开计算机。请记得同时开启 开启 通过手动按下电源按钮开启气溶胶浓度测量仪器。</li>
		<li>启动操作软件。点击 实验环节选择合适的研究。选择电子烟实验的模板。</li>
		<li>在新建实验窗口中，输入实验会话的名称。在实验属性窗口中，于操作员栏内输入操作员姓名缩写。单击 好的.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通道校准
	<ol>
		<li>按照校准向导中的步骤操作，以充分校准气溶胶发生系统。
		<ol>
			<li>步骤 1：单击 下一步 在确认气溶胶浓度测量仪器（MicroDust Pro）选项框内已有勾选标记后，进入通道校准窗口。</li>
			<li>步骤2：在“应用数值”窗口中，单击 下一步第3步：将目标值输入设为0 g/m3第4步：将T形校准插件插入插槽，完成校准过程并按下 下一步 进入以下窗口。</li>
			<li>输入气溶胶浓度测量仪器上读取的数值。按下 下一步 输入该值后，查看校准结果窗口并点击 下一步.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>最后一步：在校准完成窗口中，单击 完成系统流量测试时，在测试窗口中测试泵1和泵2（参见用户手册）。</li>
		<li>确认——“您要开始记录连续数据吗？”，点击 是确认——“您要启动默认配置文件吗？”，点击 是.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>电子香烟气溶胶暴露
	<ol>
		<li>如果正在进行 体内 吸入实验，此时将小鼠放入全身暴露舱中。</li>
		<li>立即进入“配置文件”窗口，右键单击所需配置文件，向下滚动至 开始任务 以在暴露室（舱）内启动新鲜空气的偏置气流。</li>
		<li>当准备启动电子烟气溶胶生成与暴露实验时，右键单击“配置文件窗口”中所需的配置文件，向下滚动至 开始任务 并单击鼠标左键以选择（图4).</li>
		<li>关键步骤：记录气溶胶浓度测量仪器测得的浓度。该浓度应为 &#62; 0 mg/m3. 
		注意：该设备的工作原理基于光学检测，在本系统中用于实时定性评估腔室内的暴露水平。</li>
		<li>确保在整个暴露期间储液罐中有电子烟液。</li>
		<li>在达到所需的曝光时间后，若要停止实验，可右键单击曲线图，向下滚动至 停止剖面， 左键单击以选择，并确保在曝光过程结束后立即启动偏置流。</li>
		<li>将受试对象（动物）从暴露室中移出，并放回其饲养笼具和饲养室中。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 暴露后分析
<ol>
	<li>实验结束后，关闭操作软件并关闭 关闭 气溶胶浓度测量装置</li>
	<li>将装有滤膜的滤盒从泵上取下，并记录取下时间。将滤膜放入干燥器中，使其干燥至少48小时（建议96小时）。随后，称量附着有电子烟气溶胶颗粒的滤膜，并记录重量。</li>
	<li>以每口呼出物中质量计，计算总颗粒物（TPM）浓度23.
	<ol>
		<li>记录滤膜上累积的质量。根据采样持续时间和泵流量计算暴露期间采集的总体积。</li>
		<li>将滤膜上收集到的颗粒物质量除以空气体积。 
		注意TPM 浓度以重量/体积单位表示。将 TPM 浓度除以电子烟使用过程中产生的总 puff 次数。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 清洁与维护
<ol>
	<li>将电子烟烟油从电子烟油舱中倒出，并使用附带的注射器清空冷凝器。确保实验过程中雾化芯未发生烧焦。每次实验后均需更换雾化芯。</li>
	<li>每次实验后清洁泵体。拆下泵头，取下连接件和阀门。使用棉签或纸巾擦去多余的烟油或积聚的湿气。</li>
	<li>清洁全身暴露舱。按照制造商的说明操作，清除所有表面的冷凝烟油。 
	注意：建议避免使用酒精，因其可能导致不可逆的损坏。</li>
</ol>

JM 和 AR 供职于 SCIREQ Scientific Respiratory Equipment Inc.，这是一家与本文内容相关的商业实体。SCIREQ Inc. 是 emka TECHNOLOGIES 公司旗下企业。&#160;本文的开放获取费用由 SCIREQ Scientific Respiratory Equipment Inc. 提供。

一个尚未解决的重要问题是长期暴露于电子烟气溶胶是否会导致肺部毒性。此外，电子烟对人类健康的整体安全性仍存在争议。2016年8月，美国食品药品监督管理局（FDA）将其监管权限扩展至所有烟草制品，包括电子烟。然而，电子烟研究具有挑战性且十分复杂，主要原因包括：1）缺乏标准化的评估方法；2）电子烟设备种类繁多（来自466个已识别品牌的约2,800种不同型号）24；3）超过7,700种独特的电子烟液风味24；4）不同比例的保湿剂存在多种可能的组合方式。鉴于该领域的复杂性，为应对挑战并产生可靠的科学证据，必须审慎考虑实验条件并采用可重复的实验流程。本研究重点描述了一种电子烟气溶胶生成技术，该技术可使研究人员获得与真实且全面的电子烟气溶胶暴露相关效应连续谱的独特数据集。这些数据对于及时回答与电子烟相关的安全性或毒性问题具有重要意义，有助于制定针对电子烟设计特征的监管措施，从而可能直接影响公共卫生政策。
在本文中，使用一种计算机控制的系统生成了具有实际意义的暴露环境，该系统能够整合最新一代的电子烟设备，并支持预设或用户自定义的自动抽吸模式以及设定运行条件（例如，恒定电源、标准电阻值、电压或温度）。这些自动抽吸模式包括来自CORESTA推荐方法（CRM）N°8125（表2）中“电子烟气溶胶生成与收集的常规分析机器——定义与标准条件”所规定的标准条件：55 mL抽吸容量、3 s抽吸持续时间、30 s抽吸间隔以及方波抽吸曲线。由于该系统可生成多种自动抽吸模式，因此也符合ISO 20768（电子烟产品——常规分析 vaping 机器——定义与标准条件）26的抽吸模式要求。正如预期，电子烟抽吸模式的标准条件与ISO 330827中定义的传统香烟吸烟机标准条件（35 mL抽吸容量、2 s抽吸持续时间、60 s抽吸间隔以及钟形抽吸曲线）存在明显差异。用户中香烟吸烟模式与电子烟使用模式之间的这些差异已有充分研究证实28。在本研究中，所提供的示例和数据表明，使用该系统和一款可调电压的第三代电子烟设备所产生的气溶胶具有较高的总颗粒物（TPM）浓度，每55 mL和70 mL抽吸分别可达0.27和0.82 mg。这些浓度下的电子烟气溶胶在暴露室出口处立即被采集（表1-2，图5）。结果还显示，当电压从1.8 V变化至4.8 V时，每次抽吸产生的颗粒物质量差异超过160倍（表1）。该电压范围代表了美国市场上电子烟设备典型的操作设置，其允许施加的电压范围为2.9至5.2 V29。本研究结果与先前发表的数据一致18,21，即在类似抽吸模式下，电子烟发生器出口处测得的TPM浓度较高（1.4至5.8 mg/抽吸）。本操作规程中的关键步骤包括：在每次暴露前向雾化器中添加几滴电子烟液，以确保a）不发生干烧；b）在整个暴露过程中储液罐内始终有电子烟液供应；并通过实时浓度测量设备定期读数，确认电子烟气溶胶按预期生成。已有充分证据表明，电子烟使用者会尽量避免“干抽”，即在干烧条件下发生的抽吸行为。这种使用状态与高水平醛类物质（包括甲醛）的生成有关，而甲醛是一种已知的致癌物和呼吸系统毒物13,30。因此，在暴露过程中避免此类情况至关重要。最后，在尼古丁暴露方面，小鼠每日暴露于含36 mg/mL尼古丁电子烟液产生的气溶胶中2小时，持续28天（每次抽吸尼古丁水平为0.12 mg），其血清中可测得的可替宁浓度为91 ng/mL（图8）；该水平接近于传统香烟吸烟者（>100 ng/mL）31,32,33，但低于常规电子烟使用者的水平（唾液可替宁中位数为252 ng/mL）34。一项关于电子烟使用模式的研究报告指出，电子烟使用者每日最多可进行235次抽吸35,36。这与本研究的暴露模式非常相似，即每日每30秒进行一次抽吸，持续2小时（共240次抽吸）。因此，该电子烟使用模式能够模拟电子烟使用者每日的抽吸频率和行为特征。
在过去十年中，电子烟设备已从第一代类似香烟、一次性、低功率的设备，发展到第二代可拆卸、可重复填充的储油罐式设备，再到如今的第三代具有可定制功能的储油罐式设备。24 1）雾化器线圈电阻：负责加热电子烟液的元件；以及2）电源控制器：a）可在不同电压下工作，b）影响加热元件的温度，c）决定溶液的沸点温度是否能够达到24,37. 在使用电子烟时，通常将电子烟液加热至 200 &#176;C 或更高38，其成分以气溶胶形式与生物基质相互作用，因此对电子烟气溶胶进行表征至关重要。电子烟液溶剂的挥发性不同，以丙二醇（PG）为主（70%）的溶液黏度较低，且在较低温度下即可蒸发37产生相对较小颗粒的气溶胶，从而增强使用者的“喉部击打感”体验20另一方面，以VG为基础的电子烟液在较高温度下气溶胶化37 并产生相对较大颗粒的气溶胶，从使用者的角度来看，这会增强风味并增加产生的蒸汽量5,17,39因此，先前已证实电子烟液中PG/VG比例会影响电子烟气溶胶中颗粒物的粒径分布。19,20。如图所示 图5使用PG/VG比例为50/50的电子烟液，获得的电子烟气溶胶中位直径约为100 nm。这些结果与Baassiri报道的数据范围一致。 等.20这表明，除了电子烟液基础成分外，暴露参数（包括电子烟工作设置（电阻、电压和功率）以及抽吸模式）也可能影响所产生气溶胶的物理特性。此外，添加到电子烟液基础成分中的尼古丁浓度和调味化学品也可能影响电子烟气溶胶的理化性质。先前研究表明，黏度较低的电子烟液会产生粒径更小的气溶胶颗粒，导致蒸汽密度降低，从而得到较低的总颗粒物（TPM）浓度17. 在两种被测电子烟液中使用相同的PG/VG比例时，含有36 mg/mL尼古丁和肉桂香料成分的电子烟液（即相较于仅含PG/VG的基础液，该烟液被进一步稀释，成分为PG/VG + 尼古丁 + 肉桂香料）表现出比仅由PG和VG组成的电子烟液更低的黏度。两种电子烟液之间黏度的明显差异，可能解释了在相同电子烟使用设置下每口呼出气溶胶质量的差异。表2然而，较低的总颗粒物（TPM）浓度并不一定意味着气溶胶的危害性更低，因为还必须考虑气溶胶的粒径分布及其化学成分。事实上，丙三醇（VG）的热降解以及电子烟液组分之间的化学反应会释放有害醛类物质，包括甲醛和乙醛，这些物质已被证实对人体健康具有严重威胁。15,17,40。如前所述 表3化学分析显示，此处产生的电子烟气溶胶还含有丙烯醛、一氯苯酚、邻苯二酚和苯并噻唑。这些物质均为已知的呼吸道刺激物，其中邻苯二酚根据国际癌症研究机构（IARC）的分类， additionally 被归类为可能对人类致癌（2B组）。41,42,43这进一步加剧了电子烟液中所添加香精成分化学特性相关的效应。例如，肉桂醛和双乙酰是香料与提取物制造商协会列为具有呼吸系统危害的高优先级香精化学品，当工人吸入后，已被证实会损害肺功能并导致不可逆的肺部损伤（闭塞性细支气管炎，即“爆米花肺”）。44. 肉桂醛已被证明具有高度细胞毒性 体外45,46,47 在电子烟液中非常流行48在本研究中，肉桂味电子烟液产生的电子烟气溶胶中检测到肉桂醛的存在（表3 和 图7总体而言，这表明有必要对电子烟气溶胶的物理和化学特性进行分析。
如上所述，此处描述的暴露技术具有极高的灵活性。它允许对吸气模式进行调整（通过 软件）、电子烟设备的操作特性，甚至是暴露舱类型（鼻部暴露和全身暴露）通过 硬件）。这为研究者提供了充分的灵活性，可根据每个研究项目的需求调整或优化实验条件。该技术的故障排查包括确保电子烟冷凝器、管路、泵和暴露腔之间的连接牢固，以及所有暴露腔均密封良好（详见用户手册）。如本研究中指出并验证的，多种因素可能影响电子烟气溶胶的生成及其成分22这些因素与电子烟液配方的组分比例及其成分有关，会影响气溶胶的化学组成；同时也与所选用的电子烟设备特性及操作参数有关，后者影响电子烟液雾化时的加热条件，从而影响气溶胶的化学和物理特性。电子烟液由公认安全（GRAS）的食品添加剂组成，但其经加热和雾化后的安全性尚未得到证实。尤为重要的是，电子烟使用者在吸入这些气溶胶时，可自主控制吸用模式，并可选择电子烟液种类以及电子烟设备的操作参数（电阻和电压）。这些是显著影响电子烟气溶胶排放的关键因素，因此在实验研究中应严格控制并详细记录。
与大多数实验方法一样，本研究中的电子烟暴露技术也具有优势和局限性。尽管该方法用途广泛，非常适合毒理学研究，但已知小鼠为鼻呼吸动物，全身体暴露除了经吸入途径外，还可能允许经皮肤和口腔吸收。全身体暴露与仅鼻暴露吸入方式的优缺点已在其他文献中被广泛描述49，50。虽然仅鼻暴露更接近模拟控制呼吸道内颗粒物输送与沉积的吸气/呼气模式，但这种暴露方式对动物造成的应激更大，不适用于需要大量动物参与的长期吸入研究49。此外，已有研究比较了在相同暴露条件下（如暴露于TiO2纳米颗粒、香烟烟雾）通过吸入途径暴露的啮齿类动物采用全身体暴露与仅鼻暴露的情况，结果发现这两种暴露方式在肺部颗粒沉积和肺部反应方面无统计学差异50，51。由于电子烟气溶胶慢性暴露所引起的影响目前尚缺乏充分记录和深入研究，本文所描述的电子烟暴露系统有助于填补这一知识空白。此外，本研究中使用的第三代机器 vaping 设备采用水平方向放置。设备的方向可能会影响气溶胶的产生；然而，据我们所知，此前尚未对第三代电子烟设备的方向变量进行过测试。水平方向是电子烟初学者用户的首选位置，有助于改善导液性能并最大限度减少电子烟液泄漏的风险。因此，水平方向能够代表电子烟使用者群体的 vaping 行为，其他研究团队也已采用该方式21。还需注意的是，电子烟设备上显示的功率可能与实际供给设备的功率略有差异22，52，因此建议对外部测量电源值，或使用有线电源以确保能量供应的稳定性。
目前在与长期暴露于电子烟气溶胶相关的毒性生物标志物方面，仍存在显著的研究和知识空白。该暴露系统为此领域提供了重要进展，使研究人员能够确定动物长期吸入雾化电子烟液所产生的影响。其他已有的电子烟暴露方法也具备研究抽吸模式及电子烟设备操作参数对毒理学终点影响的能力。19,20,22,53这些暴露系统将有助于为未来针对新型替代烟草产品的监管提供科学依据。最终，设计严谨且适当的毒理学研究将为政策制定者、医疗保健提供者以及900万名电子烟使用者的美国人提供更充分的信息支持。4最重要的是，应避免使用无法模拟真实使用电子烟场景的暴露系统。电子烟液通常在200℃下加热 &#176;C级或更高的温度38 在电子烟设备中，因此，若仅将电子烟液进行雾化或加热至37℃的场景 &#176;C，然后雾化8不应被视为代表电子烟使用者的消费情况。目前，电子烟消费者可能通过使用第三代电子烟设备的设计特性，调节特定的加热条件，从而达到潜在有害的电子烟气溶胶成分水平 通过 雾化器线圈电阻和电池电压的变化。因此，需要开展更多实验研究，以确定与长期吸入电子烟气溶胶相关的健康影响。这首先需要建立可重复且标准化的电子烟暴露系统。25,26因此，拥有一个多功能的电子烟暴露系统，能够实现多种暴露场景（包括自动化的代表性吸用行为轮廓），对开展实验研究具有重要意义。

电子烟（e-cigs）使用相关的安全性问题在科学界正引发广泛讨论。一方面，制造商和销售商宣传电子烟可能具有减少危害的益处，可作为当前吸烟者的替代产品，因其避免了传统香烟中存在的多种有害物质；而另一方面，公共卫生政策制定者则担忧缺乏关于人类长期健康暴露影响的数据1,2电子烟至少具有两种不同用途：1）作为尼古丁递送的替代载体；2）作为戒烟辅助装置3根据美国疾病控制与预防中心（CDC）的数据，2014年，超过900万美国成年人定期使用电子烟。从2013年到2014年，高中生中使用电子烟的比例增长了超过300%。4鉴于电子烟在青少年及成年人群中的使用日益增加1,2,4，鉴于关于电子烟作为更安全的吸烟替代品的流行说法虽广为流传却未经证实，有必要回答一些关键的科学问题，以确定电子烟的使用是否对人类健康构成潜在风险，尤其是对呼吸系统的影响1,2尽管电子烟于2007年首次在美国商业化，但针对电子烟气溶胶暴露影响的研究仍极为有限 体外 以及对肺部结构、功能和整体健康的影响5,6,7,8,9,10,11因此， 体外, 体内 流行病学数据对于制定与电子烟消费相关的公共政策和法规至关重要。然而，在这一新兴领域产生可靠且可重复的科学证据，首先需要建立标准化的电子烟抽吸模式，并在实验室环境中构建能够反映人类使用情况的可重复暴露条件。
第三代电子烟设备由至少一个加热线圈（雾化器）和一块锂离子电池组成，其电源控制器可在不同电压下运行。这些电子烟设备还配有储液装置，用于盛装电子烟液（e-liquid）。电子烟液，也称为电子烟油（e-juice），主要由尼古丁、香料以及作为载体的溶剂（保湿剂）组成，常见成分包括丙二醇（PG）、植物甘油（VG）和水。根据美国食品药品监督管理局（FDA）的规定，电子烟液是由多种成分混合而成的 &#34;公认安全&#34; （GRAS）食品添加剂、香料化学品和保湿剂，以及尼古丁，在食品中可被视为安全。然而，当这些液体制剂通过电子烟设备雾化时，会被雾化器加热，从而改变电子烟液的理化性质，并产生含有羰基化合物（更具体地说是醛类化合物）的气溶胶或蒸汽。12,13这些醛类物质由甘醇的热降解和氧化形成，该过程同时会产生羟基自由基。14,15,16,17在特定条件下雾化时存在于电子烟气溶胶中的那些醛类物质13包括甲醛、乙醛、羟基丙酮、丙烯醛、缩水甘油和双乙酰，这些物质均已被证实对人类健康具有显著的负面影响，其中甲醛是明确的人类致癌物。15,16,17此外，电子烟气溶胶还由细颗粒（250 - 950 nm）组成18,19 和超细（44 - 97 nm）20 已知可通过引发炎症和氧化应激机制导致肺部毒性的颗粒物17根据电子烟液的成分， 即.，配方中各组分所占的百分比，以及施加在电子烟设备上的电压（该电压会影响用于雾化电子烟液的温度），将导致气溶胶中总颗粒物（TPM）浓度的变化，从而产生不同水平的颗粒物以及不同浓度的醛类物质，而这些醛类物质已被证明在特定的 vaping 条件下生成19,21这些气溶胶由电子烟使用者吸入，使用者可自行调节电子烟设备的电压。电压的选择基于个人对尼古丁递送速率、气溶胶产量及灼热感的偏好。12因此，为了为电子烟及电子烟液的生产与消费政策制定提供科学依据，深入理解这些气溶胶的特性至关重要。
在科学研究背景下，存在若干亟待解决的问题，涉及：1）电子烟使用者可选择的多种电子烟设备配置和操作选项；2）缺乏可用于实验环境中的标准化、具有代表性的电子烟吸入行为特征谱型22。这凸显了迫切需要统一电子烟研究方案，首要任务是规范电子烟气溶胶的生成与表征技术22。本研究聚焦于这一挑战，详细描述了一种逐步操作的电子烟气溶胶生成方法，并采用了被认为能够真实反映实际暴露场景的具体实验参数。本研究还旨在评估电压对电子烟气溶胶总颗粒物（TPM）浓度的影响，气溶胶由第三代电子烟设备产生，并集成至商用计算机控制的暴露系统中，用于小鼠全身吸入实验。该实验方案的描述，包括电子烟气溶胶的生成与表征过程，有助于在实验室条件下建立具有代表性的标准化电子烟吸气模式，为后续毒理学研究提供支持。

<table><tbody><tr><td>&lt;em&gt;inExpose&lt;/em&gt; 完整解决方案——用于将电子烟气溶胶递送至5L全身暴露舱，包含eVic-VTC Mini（电子烟设备，Joyetech）</td><td>SCIREQ Scientific Respiratory Equipment Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;flexiWare 软件&amp;nbsp;&lt;/em&gt;</td><td>SCIREQ Scientific Respiratory Equipment Inc.</td><td>FW8</td><td></td></tr><tr><td>计算机</td><td>Dell</td><td>Core 2 Duo</td><td></td></tr><tr><td>Tygon&amp;nbsp;</td><td>Tygon</td><td>R-3603&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>MicroDust Pro</td><td>Cassella</td><td>176000A</td><td></td></tr><tr><td>个体采样泵</td><td>Sensidyne</td><td>Gilian BDX II</td><td></td></tr><tr><td>玻璃纤维滤膜</td><td>Millipore</td><td>AP4002500</td><td></td></tr><tr><td>采样盒</td><td>实验室自制</td><td></td><td></td></tr><tr><td>流量计</td><td>TSI Inc.</td><td>4100 系列</td><td></td></tr><tr><td>电子烟液（e-juice）</td><td>本地电子烟商店</td><td></td><td></td></tr><tr><td>扫描迁移粒径谱仪</td><td>TSI Inc.</td><td>3080</td><td></td></tr><tr><td>微量天平&amp;nbsp;</td><td>Sartorius&amp;nbsp;</td><td>MC5 Micro Balance&amp;nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

使用第三代电子烟机产生电子烟气溶胶：在毒理学研究中的应用

Generation of Electronic Cigarette Aerosol by a Third-Generation Machine-Vaping Device: Application to Toxicological Studies

电子烟（e-cig）设备通过加热将主要由保湿剂、尼古丁和香料化学物质组成的液体（e-liquid）转化为可吸入的气溶胶。所产生的气溶胶包含细颗粒物和超细颗粒物，以及可能对人体健康有害的尼古丁和醛类物质。电子烟使用者会吸入这些气溶胶，而使用第三代电子烟设备时，除了可选择不同的电子烟液和吸食模式外，还可调节设备的设计参数（如电阻和电压）。这些因素是显著影响吸入气溶胶毒性的关键变量。然而，电子烟的研究具有挑战性和复杂性，主要原因是缺乏标准化的评估方法，以及市场上存在大量不同型号、品牌、烟液风味和溶剂的电子烟产品。这些因素凸显了迫切需要统一电子烟研究方案，尤其是从电子烟气溶胶的生成与表征技术入手。本研究聚焦于这一挑战，详细描述了一种分步操作的电子烟气溶胶生成技术，并设定了被认为能够真实反映实际暴露场景的具体实验参数。该方法分为四个部分：准备、暴露、暴露后分析，以及设备的清洁与维护。通过使用两种类型的电子烟液和不同电压所获得的代表性结果，以质量浓度、粒径分布、化学成分以及小鼠体内可替宁水平的形式呈现。这些数据展示了所用电子烟暴露系统的多功能性，除了适用于毒理学研究外，该系统还支持多种计算机控制的暴露场景，包括自动化的、具有代表性的电子烟吸食行为轮廓模拟。

表1 显示了在电子烟气溶胶生成后，5升全身暴露舱内暴露环境的特征。这些数据来自仅使用溶剂载体（电子烟液基础成分）进行的2小时暴露实验。 即不含香料和尼古丁的丙二醇（PG）与植物甘油（VG）按50/50比例混合。气溶胶由第三代电池供电的电子烟装置产生，其电阻为0.5 Ω。共测试了七种电子烟电压，抽吸模式设定为每次抽吸体积70 mL、持续时间3 s，抽吸间隔1 min。正如预期，随着电子烟电压的升高，暴露舱内总颗粒物（TPM）浓度增加，以每次抽吸的重力法计算质量（mg）表示。然而，在所研究的电压范围内，TPM浓度的变化呈现出一定程度的S形曲线模式。电压与TPM浓度之间的关系在1.8至3.2 V范围内初始呈线性增长，随后在3.2至4.8 V之间出现指数级跃升并趋于平台期。
图5 展示了在全身体暴露舱内对电子烟气溶胶进行物理表征的结果。使用扫描迁移率粒径谱仪在不同实验条件下测量了颗粒物数量浓度和粒径分布。通过采用多种预设或用户自定义的自动抽吸程序，并对其进行调整或修改，可获得广泛范围的质量浓度和数量浓度，以及主要由细颗粒和超细颗粒组成的粒径分布。 通过 软件（图6），以及电子烟设备的设计选项（即.，雾化器线圈电阻或电池电压）。这些结果凸显了该暴露系统在实验条件下模拟多种可能的人类使用电子烟行为特征的灵活性。
例如，基于当前关于电子烟使用者个人偏好的信息，建立了一个实验性的电子烟暴露环境，并对其进行了表征（表2）。在此实验中，电子烟设备配备了一个电阻为0.5 Ω的线圈雾化器，并在3.2 V电压下运行。所采用的吸入轮廓包括每次吸入55 mL的吸入量、持续3秒的吸入时间和30秒的间隔时间；所测试的电子烟液包含载体溶剂（即，丙二醇（PG）和植物甘油（VG）按50/50比例混合），单独使用或与36 mg/mL尼古丁及肉桂香料联合使用（表2）。在2小时的暴露期间内，该暴露方案相比先前使用的每分钟1次、每次70 mL的吸入方案，可产生更多的吸入次数，并允许采集更高的总体积（分别为13,200 mL与8,400 mL）。因此，在相同电压和相近功率条件下，该吸入轮廓下每次吸入所产生的平均颗粒物质量较低（表1，表2）。结果似乎表明，电子烟液中尼古丁和肉桂香料的存在可能对每次吸入的颗粒物质量产生负面影响。然而，这两种实验条件之间的差异未达到统计学显著性水平。
采用后一种抽吸轮廓（55 mL 吸入量、3 秒吸气持续时间、30 秒间隔）生成的电子烟气溶胶的化学分析结果如表 3和图 7所示。在 3.2 V 条件下，使用由丙二醇（PG）与植物甘油（VG）按 50/50 比例混合、含 36 mg/mL 尼古丁及肉桂香精的电子烟液，共采集了 82 口电子烟气溶胶，将其收集于硅胶基滤膜上，随后采用气相色谱-质谱法（GC/MS）对电子烟释放物进行化学表征。该样品在冷凝器后立即采集。分析结果显示，除预期的尼古丁和肉桂醛外，电子烟气溶胶中还检出丙烯醛、邻苯二酚和苯并噻唑等其他化合物。这些化学物质已知为呼吸道刺激物，表明电子烟液在加热和雾化后，其气溶胶成分具有复杂性。
除了电子烟气溶胶的理化表征外，所采用的电子烟发生器和暴露系统也适用于动物暴露实验。如图8所示，血清可替宁（尼古丁的主要代谢产物）浓度可用于监测或确认小鼠暴露于含尼古丁电子烟液所产生的电子烟气溶胶。在本示例中，暴露于电子烟气溶胶的小鼠其血清可替宁浓度显著升高。
<img alt="电子烟装置组件示意图，包含储液底座、雾化器、储液罐、套管、导管适配器等部件。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58095/58095fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图1"> 
图1. 电子烟发生装置的分解示意图。 图像展示了构成电子烟发生装置的各个部件（电子烟单元、储液底座、雾化器、储液罐、储液罐套管、导管适配器）。
<img alt="用于流体动力学研究的喷嘴设计液滴形成过程示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58095/58095fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 2"> 
图 2. 电子烟发生器雾化器。 电子烟液体注入雾化器位置的示意图。
<img alt="用于电子烟雾生成研究的组装式电子烟发生器示意图，包含冷凝器和注射器。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58095/58095fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图3"> 
图3. 电子烟整体视图。 图像显示了包含延长部分和冷凝器的组装式电子烟发生器。
<img alt="PD1 过程控制分析的机器模拟图，包含性能指标。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58095/58095fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 4"> 
图4. 电子烟生成器操作软件。 图像显示了软件中 vaping 曲线的选择。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58095/58095fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="电子烟气溶胶表征；显示颗粒尺寸和浓度分布的图表。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58095/58095fig5.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 5"> 
图 5. 使用第三代电子烟发生器在5 L暴露室中产生的电子烟气溶胶的代表性物理表征，显示（A）电子烟设备功率（6–40 W）对可生成暴露条件的影响，以及（B）电子烟气溶胶由细颗粒和超细颗粒组成。 使用扫描迁移率粒径谱仪测量颗粒数量浓度和粒径分布。暴露参数：雾化器电阻为0.5 Ω，电压从1.8 V至4.8 V变化；采用两种抽吸轮廓之一进行抽吸：每次抽吸持续3 s、抽吸体积70 mL，每60 s一次，或每次抽吸持续3 s、抽吸体积55 mL，每30 s一次；电子烟液由丙二醇（PG）和植物甘油（VG）按50/50比例组成。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58095/58095fig5large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="信号编辑器图表；泵流速与时间关系；实验室软件界面；流量测量分析" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58095/58095fig6.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图6"> 
图6. 可创建、调整或修改自动给药曲线 通过 软件。 图像显示了用于输入关键电子烟吸入特征参数的“配置文件创建向导”的一个步骤，包括单次吸气量、吸气持续时间、吸气间隔和吸气曲线轮廓。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58095/58095fig6large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="色谱分析，通过离子峰、质谱法、保留时间进行化合物鉴定。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58095/58095fig7.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 7"> 
图 7. 电子烟气溶胶的气相色谱-质谱（GC/MS）结果谱图。 如表 3所述，使用电子烟设备产生气溶胶，其雾化器线圈电阻为 0.5 Ω，工作电压为 3.2 V，抽吸模式为每次抽吸体积 55 mL、持续时间 3 s，抽吸间隔 30 s；所用烟油成分为丙二醇（PG）与植物甘油（VG）按 50/50 比例混合，含 36 mg/mL 尼古丁及肉桂风味添加剂。共收集 82 次抽吸烟气溶胶样品，直接在冷凝器后的硅基滤膜上捕集，随后采用气相色谱-质谱联用技术（GC/MS）进行化学成分分析。(A) 全谱图；(B) 局部放大图。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58095/58095fig7large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="电子烟气溶胶暴露示意图及血清可替宁水平图；SMPS、CPC、MicroDustPro 设置。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58095/58095fig8.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 8"> 
图 8. 动物实验用电子烟暴露系统的示意图。 全身式电子烟气溶胶吸入系统（A）适用于动物暴露实验，经电子烟暴露的雄性 BALB/C 小鼠体内的可替宁水平（B）与主流香烟烟雾暴露水平相当。空气对照组的可替宁水平为 0.3–1.2 ng/mL。每组 N = 6，*p &lt; 0.05。采用小鼠/大鼠可替宁 ELISA 检测。暴露参数：雾化器电阻和电池电压分别设定为 1.5 Ω 和 4.2 V；按照每次吸气持续 3 秒、吸气体积 55 mL、每 30 秒一次的吸食轮廓进行抽吸；电子烟液成分为 36 mg/mL 尼古丁、肉桂香精以及 50/50 的丙二醇/植物甘油（PG/VG）比例。小鼠每日暴露于 TPM 浓度为 0.12 ± 0.09 mg/口的电子烟气溶胶中，每天 2 小时，持续 28 天；对照组则暴露于过滤空气。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58095/58095fig8large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td rowspan="2">电子烟电压 (V)</td>
			<td rowspan="2">电子烟功率 (W)</td>
			<td rowspan="2">每口质量 (mg)</td>
			<td>腔室</td>
			<td rowspan="2">腔室温度 (oC)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>相对湿度 (%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.8</td>
			<td>6.3 ± 0.3</td>
			<td>0.005 ± 0.004</td>
			<td>46.0 ± 3.3</td>
			<td>23.7 ± 0.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.3</td>
			<td>8.8 ± 0.1</td>
			<td>0.009 ± 0.005</td>
			<td>27.8 ± 9.1</td>
			<td>24.0 ± 0.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.55</td>
			<td>10.6 ± 0.2</td>
			<td>0.021 ± 0.008</td>
			<td>53.2 ± 1.2</td>
			<td>23.2 ± 0.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.8</td>
			<td>12.4 ± 0.3</td>
			<td>0.061 ± 0.073</td>
			<td>51.3 ± 1.1</td>
			<td>24.2 ± 0.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3.2</td>
			<td>15.8 ± 0.6</td>
			<td>0.065 ± 0.013</td>
			<td>56.6 ± 2.3</td>
			<td>23.1 ± 0.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3.7</td>
			<td>23.3 ± 0.6</td>
			<td>0.741 ± 0.417</td>
			<td>51.2 ± 5.5</td>
			<td>23.6 ± 0.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4.8</td>
			<td>40.4 ± 1.3</td>
			<td>0.823 ± 0.198</td>
			<td>25.4 ± 7.7</td>
			<td>23.7 ± 0.5</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1. 在5 L暴露室中使用0.5 Ω线圈雾化器测试的电子烟设备参数及暴露条件 2小时暴露的地形图谱：70 mL 吸入体积，3秒吸入持续时间，1分钟间隔，仅使用溶剂载体电子烟液基础成分 即，50/50比例的PG和VG。所有电压均进行三次重复测试（n = 3）。数据表示为均值 ± 标准差（SD）。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td rowspan="2">电子烟电压 (V)</td>
			<td rowspan="2">电子烟功率 (W)</td>
			<td rowspan="2">电子烟液尼古丁含量 (mg/mL)</td>
			<td rowspan="2">电子烟液口味</td>
			<td rowspan="2">每口质量 (mg)</td>
			<td>腔室</td>
			<td rowspan="2">腔室温度 (oC)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>相对湿度 (%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3.2</td>
			<td>16.6 ± 0.2</td>
			<td>0</td>
			<td>无</td>
			<td>0.273 ± 0.184</td>
			<td>47.4 ± 3.9</td>
			<td>23.6 ± 0.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3.2</td>
			<td>15.9 ± 1.3</td>
			<td>36</td>
			<td>肉桂</td>
			<td>0.102 ± 0.078</td>
			<td>59.6 ± 3.1</td>
			<td>22.7 ± 0.2</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表2. 在5 L暴露室中使用0.5 Ω线圈雾化器测试的电子烟设备参数及暴露条件 2小时暴露的地形图谱：55 mL 吸入体积，3秒吸入持续时间，30秒间隔，使用1）仅含溶剂的电子烟液基础成分， 即50/50比例的PG和VG，以及2）电子烟液基础成分+尼古丁（36 mg/mL）和肉桂香料。两种电子烟液均进行三组重复实验（n = 3）。数据以均值±标准差表示。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>电子烟气溶胶中化合物列表</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-丙烯醛（丙烯醛）</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7-五三十一碳烯</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10-十八碳烯醛</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>苯并噻唑</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>邻苯二酚</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>肉桂醛</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>乙氧基乙酸</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>香兰素</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表3. 电子烟气溶胶中检测到的部分化合物（非穷尽列表）。 使用电子烟设备，在3.2 V电压下，采用0.5 Ω线圈雾化器，按照每次55 mL吸气量、3秒吸气时长、30秒间隔的抽吸轮廓，对由丙二醇（PG）与植物甘油（VG）按50/50比例混合、含36 mg/mL尼古丁及肉桂香精的电子烟液进行雾化以生成气溶胶。收集82次呼出的电子烟气溶胶样品，通过冷凝器后立即截留在硅基滤膜上，随后采用气相色谱-质谱联用技术（GC/MS）进行化学分析。

全球使用电子烟（e-cig）的人数正在增加。然而，关于吸入电子烟气溶胶所引起的健康影响，目前知之甚少。本文介绍一种适用于动物暴露及后续毒理学研究的电子烟气溶胶生成技术。建立可实验重复且标准化的电子烟暴露系统，需要此类实验方案。

电子烟（e-cig）设备通过加热一种主要由保湿剂、尼古丁和…组成的液体（e-液体），产生可吸入的气溶胶。

该方法有助于解答电子烟气溶胶暴露效应连续谱这一电子烟吸入毒理学领域中的关键科学问题。本技术的主要优势在于，其采用计算机控制的电子烟气溶胶暴露方案，并整合了自动化的代表性抽吸行为轮廓曲线。在通风良好的区域安装设备后，称量一张新的洁净25毫米滤膜并记录其重量。将滤膜放入样品盒中，再将样品盒与个人采样泵连接，并使用合适的流量计调节气流速度至每分钟一升。开始准备电子烟装置时，将雾化器旋入储液罐底部，向雾化器中加入两到三滴电子烟液，确保棉芯充分浸润，以避免干烧。将储液管套插入储液罐中，然后将装有雾化器的储液罐底座拧入储液管套内。将组装好的储液罐拧到电子烟主机上。确保储液罐开口朝上，并将顶盖安装到储液罐顶部。将底板上的电子烟单元轻轻放置在电磁阀下方。使用双向阀接头和一段管路，将电子烟单元的末端连接至冷凝器的下部。确保冷凝器的上端正确连接至气溶胶发生系统和气溶胶暴露室。确认气溶胶浓度测量仪器已放置在气溶胶暴露室的出口处。取下储液罐盖，向储液罐中加入 10 毫升由等量丙二醇和植物甘油组成的电子烟液，然后重新盖上储液罐盖。实验当天，打开计算机和气溶胶浓度测量仪器，启动操作软件。点击实验会话，选择相应的研究项目。选择电子烟实验的模板。在新建实验窗口中，输入实验会话的名称。在实验属性窗口中，在操作员栏输入操作员姓名缩写，然后点击“确定”。之后，启动校准向导。在通道校准窗口中，确认气溶胶浓度测量仪器框内有勾选标记，然后点击下一步。在应用数值窗口中，点击下一步。输入目标值为0克/立方米。将T形校准插件插入插槽，以完成校准过程。然后按“下一步”进入下一个窗口。输入气溶胶浓度测量仪器的数值，然后点击下一步。查看校准结果窗口，点击下一步。要完成校准，请点击完成。接下来，按照用户手册中的说明测试泵一和泵二。当系统提示确认开始记录连续数据时，点击“是”。当系统提示启动默认程序时，点击“是”。若进行体内吸入实验，将小鼠放入全身暴露室中。立即进入配置文件窗口，右键单击所需配置文件，向下滚动并选择启动任务，以在暴露室内启动新鲜空气的偏置气流。当准备启动电子烟气溶胶生成与暴露实验时，在配置文件窗口中右键单击所需配置文件。向下滚动至“启动配置文件”，然后单击左键以选择该配置文件。记录气溶胶浓度测量仪器测得的浓度。确保在整个暴露期间储液罐中有电子烟液可供使用。您将能够看到电子烟气溶胶进入暴露室。达到所需的暴露时间后，通过右键单击实验程序来停止实验。向下滚动以停止程序，并单击鼠标左键进行选择。确保在暴露程序结束后立即启动偏置气流。将受试对象从暴露舱中取出，并放回其饲养笼具和饲养室中。然后将带有滤膜的滤盒从泵上取下，并记录取下的时间。将滤膜放入干燥器中，使其干燥至少48小时。称量附着有电子烟气溶胶颗粒的滤膜，并记录重量。计算总颗粒物浓度后，记录滤膜上累积的质量。将电子烟储液罐中的电子烟液倒出，并使用附带的注射器排空冷凝器。确保实验过程中雾化器线圈未发生烧灼。拆下泵头并取下连接器和阀门。使用棉签或纸巾擦去多余的电子烟液或积聚的水分。然后根据制造商的说明清洁全身暴露室。务必清除腔室表面的任何冷凝电子烟液。本研究中，通过生成电子烟气溶胶以研究其毒理学影响。此处显示的数据是在仅使用溶剂载体的电子烟液基质进行两小时暴露实验后记录的。正如预期，当使用较高的电子烟电压时，暴露室中气溶胶的总颗粒物浓度随之增加。随后，基于当前关于电子烟消费者个人偏好的信息建立了一个实验性电子烟暴露环境，并对其进行了表征。在两小时的暴露期内，该暴露方案比先前采用的方案具有更多的抽吸次数，并允许采集更大的总体积样本。根据不同电子烟液在此吸入轮廓下获得的平均值，似乎表明尼古丁在肉桂味电子烟液中的存在可能对每口吸入的颗粒物质量产生负面影响。对该吸入轮廓下产生的电子烟气溶胶进行化学分析显示，除了预期的尼古丁和肉桂醛外，还存在丙烯醛、儿茶酚和苯并噻唑等其他化合物。这些化学物质是已知的呼吸道刺激物，表明电子烟液在加热和雾化后，其气溶胶成分具有复杂性。一旦掌握，若操作得当，可在两个半小时内完成该暴露过程。在实施该程序时，必须至少每30分钟使用气溶胶浓度测量装置记录一次气溶胶浓度。按照此方法操作后，可采集其他空气样品，以进一步探究电子烟气溶胶的物理和化学特性相关问题。该暴露系统开发完成后，为吸入毒理学领域的研究人员探索电子香烟气溶胶对啮齿类动物引起的毒理学反应提供了重要途径。观看本视频后，您应能够充分掌握如何通过具备自动 vaping 人体工学轮廓的暴露系统，对啮齿类动物进行电子香烟气溶胶的吸入暴露。请务必注意，操作电子烟液和电子香烟气溶胶可能存在危害，在执行该操作时，必须采取包括实验服、手套和护目镜等个人防护装备在内的安全防护措施。

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科研

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Chemistry

化学

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