用 RNA原位杂交法对形态学组织环境中的遗传变异、短靶点和突变进行可视化
2018年8月14日
在这里, 我们描述了原位杂交检测, 使敏感和特定的检测序列短于50核苷酸的单核苷酸分辨率在单细胞水平。该检测可以手动或自动执行, 可以在组织上下文中实现拼接变体、短序列和突变的可视化。
这种方法可以解决神经科学、肿瘤学等领域的关键研究问题，例如细胞类型特异性表达和大脑和肿瘤微环境中剪接变体的空间映射。该技术的主要优点是它可以在组织环境中以非常高的灵敏度和特异性检测组织环境中的外显子连接、短序列和点突变。演示该程序的是我们实验室的副科学家 Hell Pimentel。
为了制备组织，在解剖后立即在室温下用 10% 中性缓冲福尔马林固定 16 至 32 小时。随后，使用标准程序对样品进行处理并包埋在石蜡中。使用切片机将包埋的组织切成五个正负 1 微米的切片。
将切片安装在静电胶粘剂载玻片上，并在室温下风干过夜。在进行 RNA NC2 杂交测定前一小时，将封固的组织载玻片放在载玻片架上，并在 60 摄氏度的循环空气烘箱中烘烤。在开始 RNA NC2 杂交测定之前，确保将杂交炉设置为 40 摄氏度。
彻底弄湿加湿纸，去除残留的水，然后将盖子放在湿度控制托盘上。将 20 mL 10X 靶标修复试剂添加到 180 mL 水中，制备 200 mL 市售的 1X 靶标修复试剂。将两个载玻片架放入蒸笼中。
用200 mL 1X 靶标修复试剂填充一个载玻片架，用 200 mL 水填充另一个载玻片架。使用蒸笼，将两种溶液加热至沸腾。将 50X 洗涤缓冲液加热至 40 摄氏度 10 至 20 分钟。
然后用 2.94 升水稀释 60 毫升预热的 50X 洗涤缓冲液，制备 3 升 1X 洗涤缓冲液。在通风橱中，将 100 毫升 Gill's 苏木精加入 100 毫升水中，制备 50% 的 Gill 苏木精复染溶液。将 1.43 毫升 20 至 30% 氢氧化铵加入 250 毫升水中，制备蓝化试剂。
在探针杂交之前，将目标探针在 40 摄氏度下预热 10 分钟。将 Amp 0 至 6 的 7 种扩增试剂置于室温下。从柱箱中取出切片，将封固的组织玻片浸入二甲苯中搅拌 5 分钟，开始样品脱磷化。
在新鲜的二甲苯中再次脱去 5 分钟。在 100% 乙醇中脱水，搅拌 2 分钟。在新鲜的 100% 乙醇中再次重复 2 分钟。
将玻片在循环空气烘箱中以 60 摄氏度风干 5 分钟，直至完全干燥。接下来，在室温下将切片与约 4 滴即用型过氧化氢一起孵育 10 分钟，以淬灭内源性过氧化物酶活性。从载玻片中倒出溶液，然后用水冲洗两次。
将切片片短暂浸入预热的水中，然后将切片放入 200 毫升 100 摄氏度的目标修复试剂中，在蒸笼中放置 15 至 30 分钟。从靶标检索中取出载玻片，用水冲洗两次。在 100% 乙醇中浸泡 3 分钟。
然后在循环空气烘箱中以 60 摄氏度干燥载玻片，直至完全干燥。载玻片干燥后，使用疏水笔在切片周围绘制大约 0.75 x 0.75 英寸的疏水屏障。让屏障在室温下完全干燥 1 分钟。
将玻片放在玻片架中，并将玻片架放入预热的湿度控制托盘中。向每张玻片中加入约 4 滴蛋白酶 3，并在 40 摄氏度下在杂交炉中孵育 15 至 30 分钟。从载玻片中倒出溶液，然后用水冲洗两次。
要开始探针杂交程序，请添加约四滴适当的即用型探针溶液以覆盖整个切片。在 40 摄氏度的杂交炉中杂交探针 2 小时。从玻片中倒出溶液，并在室温下用 200 mL 1X 洗涤缓冲液洗涤玻片，偶尔搅拌 2 分钟。
重复洗涤程序。下一步是通过在一系列扩增试剂中孵育切片来放大信号。加入约 4 滴 Amp 0 以覆盖每张玻片上的整个切片，并在 40 摄氏度下在杂交炉中孵育 30 分钟。
然后倒出溶液，并在室温下用 200 mL 1X 洗涤缓冲液洗涤玻片，偶尔搅拌 2 分钟。重复洗涤程序。以同样的方式，将 Amp 1 到 Amp 6 中的部分在此示意图中指示的温度和时间下孵育。
用一系列扩增试剂处理玻片后，制备 Fast Red 染料工作溶液。将适当体积的 Fast Red-B 染料和 Fast Red-A 染料加入试管中并充分混合。倒出载玻片中多余的液体，并将 Fast Red 染料工作溶液添加到载玻片中。
将玻片放入带盖的托盘中，在室温下孵育 10 分钟。10 分钟后，倒出固红溶液，并用自来水上下浸泡冲洗玻片两次。为了对组织切片进行复染，将载玻片在室温下浸入 50% Gill 苏木精溶液中 2 分钟。
用自来水清洗玻片，重复几次，直到玻片透明，切片保持紫色。将玻片浸入 02% 氨水中 2 到 3 次以发蓝。用自来水代替氨水，并清洗载玻片 3 到 5 次。
将玻片放入 60 摄氏度的循环空气烘箱中干燥 15 分钟，直至完全干燥。将 1 到 2 滴封固剂滴在盖玻片上，然后将玻片放在盖玻片上，同时避免气泡滞留。将玻片风干至少 5 分钟。
最后，在标准明场显微镜下观察载玻片。双 Z 外显子连接探针设计用于测定两个福尔马林固定石蜡包埋或 FFPE 胶质母细胞瘤样本中的 EGFRvIII 状态。两种野生型探针在两个样品中均检测到信号，表明两个样品都表达野生型 EGFR。
然而，突变探针仅在 EGFRvIII 阳性样品中检测到信号，而不在 EGFRvIII 阴性样品中检测到信号。阳性和阴性对照探针均包含在测定中。当对使用反义探针或正义探针制备为 FFPE 细胞沉淀的 Jurkat 细胞进行短靶标测定时，以红色靶向序列，使用反义探针对 CDR3-α 和 CDR3-β 观察到稳健染色，而正义探针几乎未检测到信号。
使用 dapB 作为阴性对照。该检测还能够检测点突变。在这个例子中，设计了两个探针，一个用于检测 L858R 突变的 EGFR 序列，另一个用于检测 EGFR L858 野生型序列。
突变探针在 H1975 细胞系中检测到信号，H1975 细胞系是 EGFR L858R 突变的杂合子，但在 H2229 细胞系中未检测到信号，H2229 细胞系仅表达 EGFR L858 野生型。野生型探针在两种细胞系中均检测到信号。在尝试此程序时，请务必记住正确固定组织，运行阳性和阴性对照探针，并在杂交烘箱中使用玻片处理系统。
按照此程序，可以执行其他方法，例如使用细胞标记物的 IHC，以回答其他问题，例如识别剪接变体的细胞类型特异性表达或短靶序列。开发后，这项技术为神经科学、肿瘤学等领域的研究人员在组织环境中探索可变剪接事件、识别空间映射的点突变以及原位可视化高度同源和短序列铺平了道路。不要忘记，使用中性缓冲福尔马林和二甲苯可能非常危险，因此在执行此程序时应始终采取预防措施，例如在通风橱中工作和佩戴个人防护设备。
概述
本文介绍了一种原位杂交检测法，可在单细胞水平上灵敏且特异性地检测长度短至50个核苷酸的RNA序列。该方法适用于多个领域，包括神经科学和肿瘤学，有助于在组织环境中可视化剪接变体和突变。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 肿瘤学
- 分子生物学
背景
- 原位杂交是一种用于研究基因表达的强大技术。
- 单细胞分辨率允许对细胞异质性进行详细分析。
- 剪接变体和突变的检测对于理解疾病机制至关重要。
- 该检测可以手动或自动进行，提高了其可及性。
研究目的
- 开发一种高灵敏度检测短RNA序列的方法。
- 实现对组织样本中基因表达模式的可视化。
- 促进在各种生物学背景下细胞类型特异性表达的研究。
使用的方法
- 使用福尔马林固定和石蜡包埋法准备组织样本。
- 将组织切片成薄片以进行杂交。
- 使用目标检索试剂和杂交探针。
- 使用一系列试剂来放大信号以增强检测。
主要结果
- 该检测成功检测到外显子接头和点突变。
- 在单细胞分析中实现了高特异性和灵敏度。
- 在脑和肿瘤组织中展示了剪接变体的可视化。
- 该方法显示了在各种研究领域的广泛应用潜力。
结论
- 这种原位杂交检测法是分子生物学研究的有价值工具。
- 它提供了单细胞水平上基因表达的洞察。
- 该技术可以帮助理解复杂的生物过程和疾病。
常见问题
Executive Industry Relevance
Accurate detection of RNA biomarkers in their native tissue context is critical for target validation and biomarker-driven drug development in oncology and neuroscience. This RNA in situ hybridization assay enables sensitive and specific visualization of splice variants, short sequences, and point mutations at single-cell resolution, supporting mechanistic de-risking and translational biomarker alignment. By preserving spatial information lost in grind-and-bind methods, it enhances predictive confidence in preclinical target selection and portfolio triage decisions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by visualizing exon junction-specific splice variants like EGFRvIII and METΔ14 in tissue context.
- Operational Value: Provides single-cell resolution data to clarify pathway activation and cellular heterogeneity in tumor microenvironments.
- Scientific Value: Supports functional target validation by distinguishing mutant from wild-type alleles at single-nucleotide resolution (e.g., EGFR L858R, KRAS G12A).
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Detects RNA targets as short as 50 nucleotides, enabling CDR3 sequence profiling in immune repertoires for immuno-oncology target discovery.
- Operational Value: Compatible with automated staining platforms, supporting assay standardization and scalability across preclinical programs.
- Scientific Value: Generates quantitative, spatially resolved readouts that aid in assay optimization and reproducibility assessment.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Demonstrates disease relevance through detection of clinically actionable variants in FFPE glioblastoma and cell line models.
- Operational Value: Enables continuity from discovery to preclinical validation by maintaining morphological context during molecular analysis.
- Scientific Value: Facilitates biomarker alignment by linking genetic variants to cellular phenotypes in tissue sections.
Pipeline & Workflow Integration
The assay fits within the discovery continuum from target identification through lead optimization, particularly where spatial validation of genetic alterations informs target confidence and de-risking.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of splice variant functionality and mutation impact in native tissue architecture.
- Screening: Enables preparation of validated biological systems for downstream compound screening via spatially resolved target confirmation.
- Analytics: Delivers quantitative, single-cell measurements of RNA variants that help compare experimental conditions and allelic ratios.
- Translational Research: Connects molecular findings to histopathological context, supporting biomarker-driven patient stratification models.
- Enterprise Reuse: Represents a reusable platform for longitudinal monitoring of target expression across models and therapeutic interventions.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity from bulk RNA methods.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized protocols compatible with manual and automated workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing spatially resolved evidence of target engagement and variant prevalence.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on co-expression with phenotypic markers in tissue.
Implementation Considerations
- Requires expertise in immunohistochemistry, molecular pathology, and nucleic acid hybridization techniques.
- Dependent on access to hybridization ovens, slide processing systems, and automated stainers for high-throughput use.
- Necessitates cross-team standardization between histology, molecular biology, and bioinformatics for consistent probe design and data interpretation.
- Must account for tissue fixation variables (e.g., formalin penetration time) that may affect accessibility of short or structured RNA targets.
- Limited by target availability; efficacy depends on probe specificity and accessibility of epitopes in FFPE sections.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
0:41
Tissue Preparation
1:30
Equipment and Reagent Preparation
3:24
Sample Deparaffinization, Dehydration, and Pre-treatment
5:26
Probe Hybridization, Signal Amplification, and Detection
7:18
Counterstaining, Slide Mounting, and Visualization
8:18
Results: Detection of Splice Variants, Short Sequences, and Point Mutation In Situ
10:00
Conclusion
