Functional Characterization of Carboxylesterases in Insecticide Resistant House Flies, Musca Domestica

这种方法可以帮助解决昆虫毒理学领域的关键问题，例如，是否所有表达代谢解毒的基因都参与了杀虫剂耐药性？该技术的主要优点是它允许产生更大规模的蛋白质，并表征这些蛋白质在体外代谢杀虫剂的功能。演示这些程序的是 Xuechun Feng，我实验室的一名研究生。

Xuechen 的博士研究重点是羧基酯酶在家蝇寄生虫抗性中的功能表征。首先，在 250 μL PCR 管中混合 1 μL GFP 入门血浆 DNA 和 5 μL 市售 C 端线性 DNA。接下来，向每个 PCR 管中加入 2 微升市售 lambda 重组混合物。

轻轻混合试管，并在 25 摄氏度下孵育过夜。将两毫升对数期生长昆虫 SF9 细胞培养物均匀接种到细胞培养板的孔中。然后让细胞在室温下在通风橱中附着至少三个小时。

使用 250 倍的倒置相位显微镜检查细胞附着。然后，去除细胞培养基，并用两毫升 Grace 昆虫培养基替换。在此之后，根据文本方案制备转染混合物 A 和 B 溶液。

然后轻敲试管，将转染混合物 A 和 B 轻轻混合在一起。在室温下，在通风橱中孵育混合物 35 分钟。接下来，将混合物逐滴添加到接种的细胞上。

用胶带密封孔，并在 27 摄氏度下孵育细胞过夜。用 2 毫升完全生长培养基替换 2 毫升 Grace 昆虫培养基。然后，向每个孔中加入 100 微摩尔更昔洛韦。

用胶带密封孔，并在 27 摄氏度下孵育细胞 72 小时。感染后 72 小时，从每个孔中收集培养基，并将其转移到 1.5 毫升离心管中。然后将试管以 1500 倍 G 离心，在 4 摄氏度下离心 5 分钟。

向孔中加入 1 毫升完全生长培养基，并使用荧光显微镜，观察 P1 杆状病毒扩增阶段细胞的感染迹象。将上清液转移到新的 1.5 ml 离心管中，并在 4 摄氏度的避光条件下储存。在此之后，在细胞培养板的孔中均匀接种 2 毫升对数期生长昆虫 SF9 细胞培养物。

让细胞在室温下在通风橱中附着至少三个小时。将 5 微升 P1 病毒原液接种到细胞接种的孔中，然后向每个孔中加入 100 微摩尔更昔洛韦。密封孔，并在 27 摄氏度下孵育细胞 72 小时。

首先，在 T25 未处理的培养瓶中培养 5 毫升对数期生长昆虫 SF9 细胞，含完全生长培养基。然后，加入 25 μL P1 病毒原液，在 27 摄氏度下轻轻摇晃，感染细胞培养物 48 小时。使用乙腈制备 100 毫摩尔氯菊酯的梯度稀释液。

然后，将 200 微升补充有 300 微升完全生长培养基的感染细胞培养物接种到 24 孔板中。确保氯菊酯完全溶解在乙腈中，并均匀地输送到板的每个孔中。添加氯菊酯后，轻轻摇动板，使培养基中的氯菊酯充分混合。

之后，用胶带密封板，并在 27 摄氏度下在黑暗条件下孵育板 48 小时。从板中取出细胞培养基，而不会干扰底部附着的细胞层。向每个孔中加入 200 微升 MMT 试剂。

然后，将板在 37 摄氏度下孵育 4 小时，直到每个孔中形成深紫色的甲臜沉淀物。向每个孔中加入 500 μL DMSO，以完全溶解沉淀物。然后将 200 μL 溶解溶液转移到 96 孔板的每个孔中。

将沉淀物完全溶解到 DMSO 中对于结果的准确性至关重要。将 DMSO 添加到板中的样品中后，使用移液器洗涤样品数次，直到沉淀物完全溶解。最后，使用酶标仪测量板在 540 纳米处的吸光度值。

在 P1 阶段，感染率较低。P2 期感染率显著提高。在 P3 感染期，几乎所有细胞都表现出从细胞培养板脱离、细胞直径增加以及细胞生长停止的症状。

根据检测到的吸光度值，与对照 CAT 细胞相比，表达 Md α E7 的细胞显示出显著更高的活力。在进行此程序时，重要的是在所有步骤中防止细胞污染，方法是在进行细胞实验之前用 70% 的乙醇擦拭瓶子和试管等物品的表面。按照此程序，可以执行一些其他方法，如同源建模和暗分析，以回答其他问题，如羧基酯酶蛋白和氯菊酯配体之间的相互作用。

这项技术为昆虫毒理学的研究人员铺平了道路，以探索昆虫杀虫剂耐药性基因的功能特征和机制。不要忘记，使用杀虫剂可能非常有害，在执行这些程序时应始终采取预防措施，例如手套和实验室外套。