Name: 衣藻中心粒单粒子重建的分离与荧光成像 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 38 s
Description: 了解衣藻中心粒分离与荧光成像技术，通过蔗糖梯度离心和免疫荧光染色实现多角度定位。该方法适用于超分辨显微成像，可推广至人类和草履虫中心粒研究。

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我们感谢瑞士洛桑联邦理工学院（École Polytechnique Fédérale de Lausanne, EPFL）生物成像与光学平台（BioImaging &amp; Optics Platform, BIOP）的 Pierre Gönczy 及其团队，本研究中的中心粒 SIM 图像在此获取。Nikolai Klena 和 Davide Gambarotto 由欧洲研究理事会（European Research Council, ERC）启动基金（StG）715289（ACCENT）资助；Maeva Le Guennec、Paul Guichard 和 Virginie Hamel 由瑞士国家科学基金会（Swiss National Science Foundation, SNSF）项目 PP00P3_157517 资助。Susanne Borgers 由日内瓦大学资助。

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

生物学中的一个挑战是解析蛋白质在结构背景下的精确定位。中心粒是应用这些方法的理想结构，因为其结构已通过冷冻电子断层扫描技术进行了研究，揭示了沿其长度方向有趣的超微结构特征。然而，由于其中心粒的尺寸接近光学显微镜的分辨率极限，使用常规显微镜通过免疫荧光技术将蛋白质精确地定位到中心粒的特定结构亚区域十分困难30。
光学显微镜的分辨率受限于光的衍射效应，其横向最大分辨率约为200 nm24。然而，过去20年光学显微镜领域的一项重大突破——超分辨率成像技术的发明，已经突破了这一限制。这些方法能够在不同分辨率水平上实现超越衍射极限的成像：SIM的分辨率为120 nm，受激发射损耗显微镜（STED）约为50 nm，单分子定位显微镜（SMLM）则达到20–40 nm24。随着超分辨率显微技术的最新发展，中心粒的结构亚区域已可被清晰观察。然而在实际应用中，由于每个细胞中仅存在两个成熟中心粒，且其空间取向随机，导致难以准确判断蛋白质在特定结构元件上的定位。为解决这一问题，本研究建立了一种实验方案，使研究人员能够通过超分辨率成像大量中心粒，从而提高观察到明确取向结构的概率。尤为重要的是，由于该方法依赖于分离的中心粒样本，我们提供了一种纯化完整C. reinhardtii中心粒的方法，其中包含成熟中心粒和前中心粒。
最后，由于本方案能够对多种朝向的中心粒进行成像，因此可利用电子显微镜软件进行单颗粒分析，从而生成特定朝向下中心粒的平均类别图像。重要的是，这些获得的二维图像可用于评估特定蛋白质在中心粒上的定位。事实上，该方法也可应用于双色超分辨率图像，其中一种颜色用于显示中心粒骨架（例如，微管蛋白），另一种颜色则对应于某一特定的中心粒蛋白。通过减去单色或双色获得的平均图像，可以更清晰地判断蛋白质在中心粒上的位置（近端、中央或远端）。需要注意的是，两个通道必须精确对齐，以避免产生误导性解释。此外，顶视图的平均图像有助于解析蛋白质是定位于中心粒腔内、微管壁上，还是中心粒外部。
该方法的优势在于能够确定特定蛋白质的定位，而这些蛋白质可能因标记不均一而难以通过其他方法进行定位。需注意，已有其他方法被用于在中心粒内进行蛋白质定位，例如通过相关联的三维结构光照明显微镜/单分子定位显微镜（3-D SIM/SMLM）技术，利用SIM成像确定围绕中心粒呈环状结构的标记物的椭圆轮廓，从而评估中心粒的特定取向。利用这一参数，可实现精度达4–5 nm的蛋白质定位30。还需注意，本文所述方法使用的是带有完整前中心粒的分离中心粒，这表明中心粒结构很可能在很大程度上得以保留。然而，我们不能排除在纯化过程中某些结构特征受到干扰的可能性，例如中心粒直径可能随二价阳离子浓度变化而改变，这一点在人中心体的分离过程中已被放大证实5。
本方案中的一个关键步骤是获得足够浓度且具有不同取向的分离中心粒，以适用于Fluo-SPA。为此，首先应确保中心粒分离步骤的纯度和效率。若分离得到的中心粒浓度过低，将影响成像质量以及后续的图像处理。为提高每视野内的中心粒数量，我们提供了一种富集方法。根据所用组分中中心粒的数量，应调整加载至浓缩装置中的体积，最大体积不超过250 µL。
重要的是，该方法是针对无细胞壁的 cw15- C. reinhardtii 细胞开发的。在这种品系中，细胞壁的脆弱性使得细胞能够充分裂解，从而释放其内容物。本方案对于野生型 C. reinhardtii 细胞效率较低，因为细胞壁会阻碍有效的细胞裂解。因此，在应用本文所述的分离方案之前，需采用其他策略，例如超声处理或用自溶素（autolysin）对细胞进行预孵育——这是一种能够降解细胞壁的酶31，以预先改变细胞壁结构。
该装置可与多种类型的显微镜联用，从常规共聚焦显微镜到专用于高通量超分辨率成像的显微镜均可适用。需要注意的是，在进行单分子定位显微镜（SMLM）实验时，必须使用特殊的成像缓冲液，因此应采用适用于直径12 mm盖玻片且缓冲液位于盖玻片上方的成像腔室。后续成像将使用倒置显微镜进行。如果显微镜系统不支持12 mm盖玻片，本方案也可通过使用30 mL圆底管以及改进的适配器和浓缩装置应用于18 mm盖玻片。还需特别注意，SMLM最终重建图像的质量取决于染色质量、所用一抗的质量以及固定方法。
总之，我们提供了一种可用于成像大量中心粒的方法，随后通过Fluo-SPA获得不同取向中心粒的平均结构，从而实现对中心粒蛋白的精确定位。重要的是，该方法可更广泛地应用于来自其他物种的分离中心粒、其他细胞器或大型大分子复合物。最后，本文所展示的样品制备方法，结合近期开发的用于荧光单分子定位显微镜（SMLM）数据单颗粒分析的新算法32，有望进一步提升对大型大分子复合物分子图谱的解析能力。

中心粒是一种在进化上保守的细胞器，位于动物细胞中心体的核心位置，在许多真核生物中可作为纤毛或鞭毛的模板，即基体（下文统称为中心粒）1,2。因此，中心粒在从纺锤体组装到细胞信号传导等一系列基本的细胞生物学过程中发挥着关键作用。正因如此，中心粒的组装或功能异常已被证实与多种人类疾病相关，包括纤毛病和癌症3。
中心粒是具有九重对称性的圆柱形结构，由微管三联体构成，通常长约 450 nm，宽约 250 nm4,5,6,7。对来自不同物种的中心粒进行的传统电子显微镜观察和冷冻电子断层扫描显示，中心粒沿其长轴呈极性分布，可分为三个不同的区域：近端区域、中央核心区域和远端区域5,7,8,9,10,11。重要的是，每个区域均表现出特定的结构特征。首先，长约 100 nm 的近端区域腔内含有中心车轮结构，该结构通过钉头元件与微管三联体相连12。其次，长约 300–400 nm 的中央区域腔内存在纤维状密度物质，且在微管内表面具有多种结构特征：Y 形连接体、C 微管尾部和 A 微管残端9。最后，长约 50–100 nm 的远端区域具有亚远端和远端附属结构，环绕在中心粒的远端部分5,13。
过去二十年来，越来越多的中心粒蛋白被发现，目前估计约有100种不同的蛋白质构成中心粒的一部分14,15,16,17。尽管取得了这些进展，这些蛋白质在中心粒内部的精确定位仍不明确，尤其是在结构亚区域中的定位。重要的是，将蛋白质精确定位于中心粒的结构区域，对于更好地理解其功能至关重要。在这方面，C. reinhardtii 的中心粒在两个方面都发挥了关键作用：首先明确了沿中心粒圆柱体分布的不同结构特征9,18,19，随后使研究人员能够通过荧光显微镜将一部分蛋白质的定位与特定亚结构区域相对应。例如，Bld12p 和 Bld10p 蛋白定位于近端区域，特别是定位于中心轮结构20,21,22,23。定位于亚结构的蛋白质列表还包括 POB15 和 POC16，这是两种通过质谱鉴定出的新型蛋白，分布于 C. reinhardtii 中心粒的内侧核心区域17。
本文详细描述了一种用于分离和成像C. reinhardtii中心粒的方法，以便后续进行超分辨率显微镜观察和单颗粒平均分析。为实现这一目标，有必要明确需要克服的技术局限性。首先，中心粒的纯化过程可能影响其整体结构，其中在分离的多个步骤中，车轮状结构（cartwheel structure）常常会丢失9。其次，中心粒的尺寸接近光学显微镜的衍射极限。事实上，共聚焦显微镜的横向分辨率约为200 nm24，与中心粒的直径相近，而z轴方向的分辨率则低约2–3倍，导致成像体积呈现各向异性。第三，抗体标记的异质性以及中心粒取向的多样性可能限制对特定中心粒亚区域中蛋白质定位的准确解析。最后，每个细胞中仅存在两个中心粒，这使得获取大量图像并确定明确的中心粒取向变得困难。为克服这些技术难题，我们开发了一种方法，即对大量具有不同取向的分离中心粒进行超分辨率显微成像。我们将首先介绍一种纯化C. reinhardtii中心粒的方案，该方案能够获得结构完整且包含车轮状结构的中心粒和前中心粒。接着，我们将逐步描述一种将中心粒富集于盖玻片上的方法，以便通过常规或超分辨率荧光显微镜进行成像。这一关键步骤有助于增加在多种取向下成像的中心粒数量。最后，我们将介绍一种在荧光显微镜获取的数据上进行单颗粒平均分析的操作流程，以促进对不同取向中心粒的识别。总体而言，该方法可广泛应用于成像来自不同物种的中心粒或其他大型大分子复合物。

<table><tbody><tr><td>小鼠单克隆抗α微管蛋白抗体（克隆 DM1A）</td><td>Abcam</td><td>ab7291&amp;nbsp;</td><td>稀释比例 1:300</td></tr><tr><td>DNaseI</td><td>Roche</td><td>10104159001</td><td></td></tr><tr><td>12 mm 盖玻片</td><td>Roth</td><td>YX03.1</td><td></td></tr><tr><td>18 mm 盖玻片</td><td>Roth</td><td>LH23.1</td><td></td></tr><tr><td>K&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Fluka</td><td>60355</td><td></td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Fluka</td><td>60230</td><td></td></tr><tr><td>Tris 碱</td><td>Biosolve Chimie SARL</td><td>0020092391BS</td><td></td></tr><tr><td>乙酸</td><td>Carlo Erba Reagents</td><td>524520</td><td></td></tr><tr><td>NH&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;Cl</td><td>Sigma</td><td>A-4514</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>C-7902</td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>63140-500G-F</td><td></td></tr><tr><td>无菌滤器</td><td>Millipore</td><td>SCGPT05RE</td><td></td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>Sigma</td><td>S7903-1KG</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>AppliChem PanReac</td><td>A3724,0250</td><td></td></tr><tr><td>PIPES</td><td>Sigma</td><td>P6757-500G</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>ACROS ORGANICS</td><td>197530010</td><td></td></tr><tr><td>NP-40</td><td>AppliChem PanReac</td><td>A1694,0250</td><td></td></tr><tr><td>圆底（Kimble）离心管 15 mL</td><td>Fisherscientific</td><td>09-500-34</td><td></td></tr><tr><td>圆底（Kimble）离心管 30 mL</td><td>Fisherscientific</td><td>09-500-37</td><td></td></tr><tr><td>盖玻片染色架</td><td>Thomas scientific</td><td>8542E40</td><td></td></tr><tr><td>透明聚苯乙烯透射实验盒</td><td>FISHERS</td><td>11712944</td><td></td></tr><tr><td>甲醇</td><td>VWR</td><td>20864.32</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Roche</td><td>10735086001</td><td></td></tr><tr><td>Triton X100</td><td>Roth</td><td>3051.3</td><td></td></tr><tr><td>与 Alexa 488 偶联的山羊抗小鼠二抗&amp;nbsp;</td><td>invitrogen</td><td>A11029</td><td>稀释比例 1:1,000</td></tr><tr><td>与 Alexa 568 偶联的山羊抗兔二抗</td><td>invitrogen</td><td>A11036</td><td>稀释比例 1:1,000</td></tr><tr><td>封片剂</td><td>abcam</td><td>ab188804</td><td></td></tr><tr><td>薄壁聚丙烯离心管</td><td>Beckman Coulter</td><td>326823</td><td></td></tr><tr><td>聚-D-赖氨酸 1 mg/mL</td><td>SIGMA&amp;nbsp;</td><td>A-003-E</td><td></td></tr><tr><td>小鼠单克隆抗多聚谷氨酰化修饰抗体（GT335）</td><td>Adipogen</td><td>AG-20B-0020</td><td>稀释比例 1:1,000</td></tr><tr><td>含 DAPI 和 DABCO 的甘油封片剂</td><td>Abcam</td><td>ab188804</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 锥形离心管</td><td>Falcon</td><td>14-432-22</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf 5810R 离心机</td><td>Eppendorf</td><td>5811000622</td><td></td></tr><tr><td>Beckman JS-13.1 摆动桶转子</td><td>Beckman Coulter</td><td>346963</td><td></td></tr><tr><td>Beckman SW 32Ti 转子</td><td>Beckman Coulter</td><td>369694</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm 封口膜</td><td>Bemis&amp;nbsp;</td><td>13-374-10</td><td></td></tr><tr><td>Leica TCS SP8 共聚焦显微镜（配备 Hyvolution 模式）</td><td>Leica&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>OSRAM L18W/954 LUMILUX&amp;nbsp;</td><td>Luxe Daylight/ OSRAM</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Whatman 滤纸</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>WHA1001325</td><td></td></tr><tr><td>CrSAS-6/Bld12 抗体</td><td></td><td></td><td>稀释比例 1:300（Hamel &lt;em&gt;等&lt;/em&gt;, 2014）</td></tr><tr><td>Scipion</td><td>http://scipion.i2pc.es/</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EM CCD 相机（Andor iXON DU897）</td><td>Andor</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

衣藻中心粒的单颗粒重构分离与荧光成像

Isolation and Fluorescence Imaging for Single-particle Reconstruction of Chlamydomonas Centrioles

中心粒是大型大分子复合物，在细胞分裂、细胞运动或细胞信号传导等基本细胞生物学过程中发挥重要作用。Chlamydomonas reinhardtii（一种绿色藻类）已被证明是研究中心粒结构、功能及蛋白质组成的有力模型。尽管在理解中心粒结构方面已取得显著进展，当前的一个挑战仍是确定中心粒组分在中心粒结构区域内的精确定位，以更深入地阐明其在中心粒生物发生中的作用。一个主要限制因素在于荧光显微镜的分辨率，由于中心粒的尺寸接近衍射极限，使得对其内蛋白质定位的解释变得复杂。为解决这一问题，我们提供了一种方法，利用超分辨率显微镜对大量不同取向的C. reinhardtii中心粒进行纯化和成像。由于获取的中心粒数量众多，该技术可通过荧光单颗粒平均法（Fluo-SPA）对数据进行进一步处理。Fluo-SPA可生成不同取向的染色C. reinhardtii中心粒的平均图像，从而有助于将不同蛋白质定位至中心粒的亚结构区域。重要的是，该方法也可应用于成像其他物种的中心粒或其他大型大分子复合物。

C. reinhardtii 中心粒的分离： 
为了分离中心粒，将 cw15- C. reinhardtii 细胞在光照条件下液体培养数天，随后以 600 × g 离心 10 分钟收集细胞沉淀。将细胞沉淀用 PBS 洗涤一次，并重悬于去鞭缓冲液中，通过加入 0.5 M 乙酸将 pH 值调节至 4.5–4.7，进行 2 分钟的 pH 冲击以诱导去鞭（图 1A）。随后加入 1 N KOH 将 pH 恢复至 7.0。为了将脱落的鞭毛与细胞体分离，先将去鞭后的细胞进行离心，以去除大部分鞭毛。将沉淀用 PBS 洗涤两次，并重悬于 30 mL PBS 中，然后缓慢加至 25% 蔗糖垫上（图 1B）。在 4 °C 下以 600 × g 离心 15 分钟，以去除大部分脱落的鞭毛。离心后，细胞体分布在蔗糖垫中（图 1C），通过移除约 30 mL 上清液（至 图 1C 中红色箭头处）回收细胞体。将所得的 20 mL 洗涤后细胞重悬于 20 mL 冷 PBS 中，并以 600 × g 离心 10 分钟。弃去上清液后，将细胞完全重悬于 10 mL PBS 中。将细胞转移至 250 mL 瓶中，并立即向重悬的细胞中加入裂解缓冲液。加入 DNase 后于 4 °C 孵育 1 小时。随后进行一次离心以去除细胞碎片（见 图 1D 中白色沉淀），收集上清液并小心地加至 2 mL 60% 蔗糖垫上，于 4 °C 以 10,000 × g 离心 30 分钟。注意，对于 100 mL 裂解液，该步骤使用了 8 个 15 mL 离心管，每管加载 12.5 mL 裂解液和 2 mL 蔗糖垫。离心后，移除上清液至距蔗糖垫上方 1 mL 处。将剩余的 1 mL 上清液与 2 mL 蔗糖垫一同收集，混合并合并，最终获得 24 mL 混合液。将此混合液加至 40%、50%、70% 蔗糖梯度中，并于 4 °C 以 68,320 × g 离心 1 小时 15 分钟。最后，通过用针在离心管底部打孔的方式收集分离的中心粒，逐滴收集并分装为 12 份，每份 500 µL。由于不同浓度蔗糖密度较高，初始阶段液滴形成非常缓慢（70% 蔗糖），随后逐渐加快（40% 蔗糖）。
分离中心粒的免疫荧光染色 
为了评估分离步骤的质量，将每份收集的梯度组分各取 10 µL，使用盖玻片支撑适配器离心至盖玻片上（图 2A-2D）。重要的是，为安全移除盖玻片，专门设计了一种带钩的定制工具（图 2B）。随后，通过免疫荧光对盖玻片进行分析。本研究中使用了针对 CrSAS-6(Bld12p) 的抗体以指示中心粒车轮结构的存在，以及针对 α-微管蛋白（DMA1）的抗体以标记中心粒壁。通过计数每个视野中同时表达 CrSAS-6 和 α-微管蛋白的中心粒数量，并计算各组分中的中心粒总数，可确定哪些组分富含分离的中心粒（图 2F-2H）。有趣的是，有 6 个组分富含中心粒（图 2F 和 2G，组分 #1–6），其中组分 #3 达到峰值，而最后几个组分则无此富集现象，表明纯化过程成功。需注意，在本实验中，组分 #3 中 95% 的总中心粒均对 CrSAS-6 和 α-微管蛋白呈阳性反应，说明大多数分离得到的中心粒保留了其车轮结构。若在前几个组分中未观察到中心粒的富集，则表明分离步骤失败，需重复实验。需注意，部分鞭毛碎片主要出现在不含中心粒的组分中。
接下来，为了计算每 µL 中的中心粒总数，应将每个视野中的中心粒数量乘以 图 2H 所示的比例。然后将所得数值除以用于免疫荧光的组分体积，以获得每 µL 中的中心粒数量。在此特定分离步骤中，富集程度最高的组分在 0.00846 mm2 面积内含有约 37 个中心粒（视野为 92 × 92 µm2）。管段表面半径为 7.5 mm，总表面积为 176 mm2。因此对应的比例为 176 / 0.00846 = 20,803.8，即在 10 µL 中共有 769,740 个中心粒（37 × 20,803.8）。因此，每 1 µL 中的中心粒数量为 76,974。
在盖玻片上浓缩分离的中心粒： 
增加每个视野中的中心粒数量，可提高检测到明确中心粒取向的概率，同时也有助于发现相似取向的中心粒，用于后续的颗粒平均分析。由于来自浓缩组分的中心粒在盖玻片上仍然较为稀疏，我们开发了一种离心辅助装置，用于将中心粒富集到盖玻片中央（图3A），该装置称为浓缩器。请注意，本文随附提供了用于3D打印的精确尺寸.stl文件。
首先，将一个直径为12 mm的盖玻片安装在浓缩装置上（图3B）。将适配器置于盖玻片上方，倒置圆底管并套在已组装好的适配器和浓缩装置上。随后轻轻翻转圆底管，以便加入样品（方案步骤4.2）。接着在4 °C条件下以10,000 × g 离心10分钟，使中心粒沉淀。之后对中心粒进行免疫荧光染色，标记CrSAS-6/Bld12p和α-微管蛋白（图3C-3E）。重要的是，未使用浓缩装置时，每个视野中约可见30个中心粒（图3C），而使用浓缩装置后，每个视野中可见约183个中心粒（图3D-3F）。需要注意的是，中心粒仅集中在盖玻片中央直径为4 mm的圆形区域内。该结果表明，浓缩步骤有效，可在盖玻片的特定区域实现中心粒约6倍的富集，从而显著提高其检测与成像的便利性。
分离的C. reinhardtii中心粒的荧光单颗粒平均成像： 
本实验中，使用可达到约120 nm分辨率的SIM显微镜，对中心粒微管中存在的微管蛋白单聚谷氨酰化修饰（GT335抗体标记，图4）进行成像24。C. reinhardtii中心粒长约500 nm，通常成对存在，并常伴有新复制的前基体（下文称为前中心粒）以及条纹状微管相关纤维19。因此，该完整组装结构的尺寸约为1 µm。鉴于此，并为了完整成像整个中心粒结构，我们建议对分离的中心粒采集Z轴层扫图像。
采集图像后，使用 ImageJ28 进行最大强度投影生成最终图像（图像/堆栈/Z 投影/最大强度投影，图 4B）。基于此类图像，利用冷冻电子显微镜软件对单颗粒进行分析，将具有相似取向的中心粒归类，随后进行平均化处理。具体操作中，首先对图像颜色进行反转，以便更清晰地观察目标结构（图 4C）。使用免费开源的 Scipion 软件29 手动选取颗粒，每个颗粒以中心点为基准划定选区框，该软件集成了包括 Xmipp3 在内的多种电子显微镜分析程序（图 4D）。需注意，选区框的尺寸需由用户自行设定。本研究中，采用的选区框大小为 50 × 50 像素，对应像素尺寸为 31.84 nm。随后，提取所有颗粒（图 4E），并使用 Xmipp3 进行对齐（图 4F）。接着，应用半径为 12 像素的圆形掩膜，以将各个中心粒从中心粒成对结构中分离出来（图 4G）。然后利用 Xmipp3 对颗粒进行分类，生成多个平均图像。仅保留均一性良好的类别平均图像，即手动剔除与类别平均图像差异较大的颗粒。该步骤重复进行，以针对每种选定取向生成接近完美的平均图像。经过五次迭代后，最终获得两类平均图像：一类为 63 个对象的单谷氨酰化中心粒顶面视图（图 4H），另一类为 98 个颗粒的侧面视图（图 4I）。通过测量单谷氨酰化信号强度分布曲线中峰之间的距离，确定目标结构的尺寸。
重要的是，侧视图类别平均长度为 260 nm，直径为 250 nm，与单谷氨酰化微管蛋白信号的测量结果相当，后者被证明定位于中心粒核心区域内长度为 286 ± 33 nm 的区域17。
<img alt="使用蔗糖梯度进行蛋白质纯化的离心过程示意图；方法与结果" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58109/58109fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图1"> 
图1: 纯化 C. reinhardtii 中心粒 (A这是获得分离产物的每一步的示意图 C. reinhardtii 中心粒。它包含该方案的代表性步骤（B) 之前和（C) 经离心后在25%蔗糖梯度中的位置。图中红色箭头指示 C 表示离心后应保留的最小体积。D此图显示离心后裂解细胞的白色沉淀，黑色箭头指示沉淀物位置。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58109/58109fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="离心过程示意图及结果；梯度定量图表；显微镜设置。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58109/58109fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 2"> 
图 2： 对分离的中心粒进行免疫荧光的离心装置。（A）收集的每种组分各取 10 µL，首先在 100 µL 的 10 mM K-PIPES（pH 7.2）中稀释。（B）此为离心装置的示意图，包括一个 15 mL 圆底管、一个 12 mm 盖玻片、一个盖玻片适配器以及一个自制的带钩装置，用于在离心后回收盖玻片。图 C 和 D 展示了离心后回收盖玻片的操作示意图。（C）将带钩工具插入适配器槽边上的孔中，并（D）轻轻拉出。（E）这些是进行免疫荧光成像所需湿室的图片。箭头指示 12 mm 盖玻片的位置。（F）这些是在纯化过程中收集的梯度组分 #1–8 的代表性共聚焦图像（63X，放大倍数 2），染色显示 CrSAS-6（红色）和 α-微管蛋白（绿色）。插图对应于低倍镜图像中白色方框所示区域。比例尺 = 10 µm。（G）此图为各组分中每视野内同时表达 CrSAS-6 和 α-微管蛋白的中心粒数量的统计图。注意组分 #1–6 中的富集情况。各组分每视野平均中心粒数量：#1 = 16.3 ± 4.7，#2 = 24.0 ± 4.6，#3 = 37.0 ± 17.0，#4 = 23.3 ± 11.4，#5 = 14.3 ± 2.1，#6 = 13.7 ± 9.3，#7 = 2.7 ± 1.2，#8 = 1.0 ± 0.0，#9 = 1.0 ± 0.0，#10 = 0.0 ± 0.0，#11 = 0.3 ± 0.6，#12 = 0.0 ± 0.0。对每个组分随机选取 3 个视野进行成像。注意，在计数最富集的组分 #3 时，发现 95% 的中心粒同时表达 CrSAS-6 和 α-微管蛋白（n = 205 个中心粒）。（H）通过显微图像测量区域中的中心粒数量比例，可计算出整个管壁区域中存在的中心粒总数。根据最初离心的 10 µL 组分，可进一步计算每 µL 中的中心粒数量。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58109/58109fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="离心机示意图显示浓缩装置设置、显微镜图像、蛋白质分析和数据图表。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58109/58109fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 3"> 
图 3：使用浓缩装置对分离的中心粒进行离心浓缩。（A）本图显示了在免疫荧光染色前将中心粒浓缩至盖玻片所需的离心装置，包括一个15 mL圆底管、一个浓缩装置、一个12 mm盖玻片以及一个支撑适配器装置。（B）本图显示了离心装置的组装步骤。图C-E展示了中心粒的共聚焦显微图像，其中中心粒经CrSAS-6（红色）和α-微管蛋白（绿色）染色：（C）未使用浓缩装置，或（D-E）使用浓缩装置。插图为低倍镜图像中白色方框所示区域的放大。比例尺为10 µm。请注意，中心粒在盖玻片中央区域富集（虚线表示浓缩区域的边界）。（F）该图显示了使用与未使用浓缩装置时每视野中心粒数量的比较。共分析了五个随机视野。未使用浓缩装置时，每个视野平均中心粒数为29.8 ± 2.9；使用浓缩装置时为182.6 ± 11.5，P &lt;0.0001。统计学显著性通过非配对t检验进行评估。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58109/58109fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="单谷氨酰化过程示意图，包含颗粒提取、比对、掩模和分类平均。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58109/58109fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 4"> 
图 4：对分离的C. reinhardtii中心粒进行单颗粒平均分析。（A）本图显示使用SIM显微镜获取的经GT335染色的中心粒Z轴层扫图像。（B）这些图显示堆叠图像的最大强度Z轴投影。比例尺 = 1 µm。（C）这些图显示一幅具有反差反转的代表性图像。插图为放大视图，以便更清晰地观察中心粒。（D）这些图显示颗粒挑选结果。插图说明颗粒的挑选方式。（E）这些是5个提取出的颗粒示例。（F）本图显示颗粒比对后的结果。（G）本图显示应用掩模后的颗粒图像。图H和I显示两个分类平均结果：（H）顶视图（63个颗粒），（I）侧视图（98个颗粒）。双箭头指示GT335信号的尺寸。比例尺 = 250 nm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58109/58109fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
补充文件 1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58109/Adaptor_coverslip.stl" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充文件 2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58109/concentrator.stl" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>

我们开发了一种策略，可用于纯化并成像大量处于不同取向的中心粒，适用于超分辨率显微镜和单颗粒平均法分析。

中心粒是大型大分子复合物，在细胞分裂、细胞极性等基本细胞生物学过程的正常执行中具有重要作用……

该方法有助于解答中心粒研究领域中的关键问题，例如将蛋白质定位到中心粒的特定区域。本技术的主要优势在于，我们提供了使中心粒富集并获得其多种取向的手段。尽管该方法可为衣藻中心粒生物学提供见解，也可应用于其他体系，如分离的人源和四膜虫中心粒。演示该实验步骤的人员为博士生 Nikolai Klena、另一位博士生 Maeva Le Guennec 以及实验室的博士后 Davide Gambarotto。开始此操作前，首先按照文本方案中所述准备所有培养基并培养衣藻细胞。将制备好的细胞转移至 50 毫升锥形管中，并在 600 × g 条件下离心 10 分钟。用50毫升1×PBS清洗沉淀一次，然后以600 × g离心10分钟。用移液器将沉淀在100毫升室温去鞭毛缓冲液中重新悬浮。将烧杯置于磁力搅拌器上，缓慢加入0.5摩尔乙酸，调节最终pH至4.5至4.7。将此混合物在室温下孵育两分钟。随后缓慢滴加一当量的氢氧化钾，将 pH 恢复至 7.0，将细胞转移至 50 毫升离心管中，并在 600 × g 条件下离心 10 分钟，以去除任何脱落的鞭毛。弃去上清液，将沉淀物置于冰上保存，待洗涤时使用。准备就绪后，每次使用 50 毫升 4°C 的 1x PBS 洗涤沉淀物，共洗涤两次。在 4°C 条件下以 600 × g 离心 10 分钟，收集洗涤后的沉淀物。将沉淀物重悬于 30 毫升 1x PBS 中。然后，缓慢将悬液加至20毫升25%蔗糖垫上，避免混合。在4°C条件下以600 × g离心15分钟，以去除残留的鞭毛并将细胞分散于蔗糖中。使用抽吸装置小心抽去上清液，仅保留最底部的20毫升。加入20毫升预冷的1×PBS缓冲液洗涤残留的蔗糖。在4°C条件下以600 × g离心10分钟。将沉淀物重悬于4°C的10毫升1×PBS缓冲液中，确保溶液中无任何团块。将重悬的沉淀转移至一个新的250毫升瓶中，向含有细胞的瓶中加入裂解缓冲液，并补充5,000单位的DNase。在4°C下孵育1小时，每隔15分钟轻轻倒置瓶子混匀。将裂解后的细胞转移至50毫升锥形管中，在4°C、600 × g条件下离心10分钟。使用移液器收集上清液，并将其加入预冷的含有2毫升60%蔗糖垫的30毫升圆底管中，置于冰上。在4°C条件下，以10,000 × g离心30分钟。随后，吸除蔗糖垫上方约1毫升处以上的上清液。注意一毫升残留上清液与两毫升蔗糖垫之间的黄色界面。使用剪去尖端的 P1000 吸头，轻轻将残留上清液与蔗糖混合。合并所有蔗糖垫，并置于冰上保存。接下来，按照文本方案中的说明，在薄壁的 38.5 毫升聚丙烯管中制备 40% 至 70% 的蔗糖梯度。将合并的界面缓慢加样至梯度中。用 10 毫摩尔 K-PIPES 缓冲液平衡离心管，并在 4 摄氏度条件下以 68,320 ×g 离心 75 分钟。此后，使用0.8毫米针头在离心管底部打孔，注意不要扰动不同的蔗糖层。通过此孔在4°C下收集12份500微升的组分。使用剪切过的P200吸头，从每份组分中额外制备10微升等分试样，用于免疫荧光实验。然后，用液氮速冻各组分。首先，将无菌的12毫米盖玻片放置在浓缩器凹陷的底端，确保将PDL包被面朝下。将适配器直接放置在盖玻片上方，以封住盖玻片。然后，将圆底管倒置，套在浓缩器、盖玻片和适配器上。用镊子轻轻下压整个组件，直至其到达管底，再将管子翻转。加入10毫摩尔的K-PIPES缓冲液，直至液面升至浓缩器顶部。确保浓缩器的中央圆柱体内无气泡。用P200移液器将100 µL的10 mmol/L K-PIPES缓冲液轻轻加入一份富集的中心粒组分中，并充分混匀。接着，从浓缩器的中空中心区域移除100 µL K-PIPES缓冲液，再加入100 µL缓冲液与组分的混合物，确保内容物始终保留在浓缩器的中空中心区域。在预冷至 4 °C 的离心机中以 10,000 × g 离心 10 分钟。随后使用镊子移除浓缩器。将自制的带钩装置插入适配器槽口边缘的孔中，轻轻上提以回收盖玻片。当移至管子顶部后，用戴着手套的手指固定适配器边缘，并使用镊子小心取下盖玻片，注意辨识盖玻片上含有中心粒的一侧。随后，对浓缩的中心粒进行固定和免疫荧光染色。首先，将带有中心粒的盖玻片放入预先准备好的晶体聚苯乙烯透射实验盒中，加入100%甲醇，在-20°C条件下孵育5分钟。用镊子将盖玻片转移至一个装有 50 毫升 1× PBS 的透明实验盒中。在室温下让载玻片在 PBS 中洗涤 5 分钟。然后，在湿化室内的实验室封口膜上滴加 60 微升一抗混合液。将盖玻片小心地放置在抗体混合液上，使中心粒正对液滴。让盖玻片孵育45分钟。随后，取下盖玻片，并在含有PBS的容器中清洗5分钟。将洗涤后的盖玻片置于含1% BSA和0.05% Tween-20的PBS中，加入二抗，孵育45分钟。取出盖玻片，在含有PBS的盒子中洗涤5分钟。使用常规的抗荧光淬灭封片剂将盖玻片封固于载玻片上。然后，使用63倍油镜（数值孔径为1.4）在共聚焦显微镜上对分离的中心粒进行成像，同时应用去卷积。分别在中心粒信号的上方和下方设置Z轴层扫的顶部和底部位置，并采集包含完整中心粒信号的大尺寸图像层栈。对层栈进行投影，并按照文本方案中所述进行单颗粒平均分析。代表性免疫荧光结果显示，六个组分中均富集了分离的中心粒，其中第三组分富集程度最高，而最后两个组分则无明显富集，表明纯化过程成功。未使用浓缩装置时，每个视野仅约可见30个中心粒，而使用浓缩装置后可见183个。这表明浓缩步骤成功实现了中心粒在特定区域内的六倍富集，从而更易于检测和成像。随后使用超分辨率显微镜对单谷氨酰化微管蛋白染色的中心粒进行成像，并利用软件为每个选定取向生成接近完美的平均图像。经过五次迭代后，得到了两类单谷氨酰化中心粒的平均图像：来自63个对象的顶视图和来自98个颗粒的侧视图。侧视图类别平均图像的长度为260纳米，直径为250纳米，与观测到的定位于中心粒核心区域的单谷氨酰化微管蛋白信号的实际测量值相当。在进行此操作时，重要的是要记住将分离的中心粒保持在冰上，并在分离后迅速冷冻。完成此操作后，可采用其他方法，如冷冻电子显微镜和质谱分析，以回答更多问题，例如中心粒的天然结构或中心粒的蛋白质组成。

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衣藻中心粒单粒子重建的分离与荧光成像

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用于精确细胞表征与精准蛋白定位的细菌细胞三维成像

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通过共聚焦显微镜重建单细胞固有荧光特征

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同时干涉反射与全内反射荧光显微镜技术用于成像动态微管及其相关蛋白

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以裂殖酵母作为靶向细菌细胞骨架蛋白的抗菌药物筛选平台

该工作流程利用低温三重共定位成像平台，能够针对尺寸微小（轴向尺寸&lt;1...

使用低温荧光、电子与离子束联用显微镜对细胞进行靶向切割的工作流程

了解衣藻中心粒分离与荧光成像技术，通过蔗糖梯度离心和免疫荧光染色实现多角度定位。该方法适用于超分辨显微成像，可推广至人类和草履虫中心粒研究。

衣藻中心粒的单颗粒重构分离与荧光成像

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