衣藻中心粒的单颗粒重构分离与荧光成像

该方法有助于解答中心粒研究领域中的关键问题，例如将蛋白质定位到中心粒的特定区域。本技术的主要优势在于，我们提供了使中心粒富集并获得其多种取向的手段。尽管该方法可为衣藻中心粒生物学提供见解，也可应用于其他体系，如分离的人源和四膜虫中心粒。

演示该实验步骤的人员为博士生 Nikolai Klena、另一位博士生 Maeva Le Guennec 以及实验室的博士后 Davide Gambarotto。开始此操作前，首先按照文本方案中所述准备所有培养基并培养衣藻细胞。将制备好的细胞转移至 50 毫升锥形管中，并在 600 × g 条件下离心 10 分钟。

用50毫升1×PBS清洗沉淀一次，然后以600 × g离心10分钟。用移液器将沉淀在100毫升室温去鞭毛缓冲液中重新悬浮。将烧杯置于磁力搅拌器上，缓慢加入0.5摩尔乙酸，调节最终pH至4.5至4.7。

将此混合物在室温下孵育两分钟。随后缓慢滴加一当量的氢氧化钾，将 pH 恢复至 7.0，将细胞转移至 50 毫升离心管中，并在 600 × g 条件下离心 10 分钟，以去除任何脱落的鞭毛。弃去上清液，将沉淀物置于冰上保存，待洗涤时使用。

准备就绪后，每次使用 50 毫升 4°C 的 1x PBS 洗涤沉淀物，共洗涤两次。在 4°C 条件下以 600 × g 离心 10 分钟，收集洗涤后的沉淀物。将沉淀物重悬于 30 毫升 1x PBS 中。

然后，缓慢将悬液加至20毫升25%蔗糖垫上，避免混合。在4°C条件下以600 × g离心15分钟，以去除残留的鞭毛并将细胞分散于蔗糖中。使用抽吸装置小心抽去上清液，仅保留最底部的20毫升。

加入20毫升预冷的1×PBS缓冲液洗涤残留的蔗糖。在4°C条件下以600 × g离心10分钟。将沉淀物重悬于4°C的10毫升1×PBS缓冲液中，确保溶液中无任何团块。

将重悬的沉淀转移至一个新的250毫升瓶中，向含有细胞的瓶中加入裂解缓冲液，并补充5,000单位的DNase。在4°C下孵育1小时，每隔15分钟轻轻倒置瓶子混匀。将裂解后的细胞转移至50毫升锥形管中，在4°C、600 × g条件下离心10分钟。

使用移液器收集上清液，并将其加入预冷的含有2毫升60%蔗糖垫的30毫升圆底管中，置于冰上。在4°C条件下，以10,000 × g离心30分钟。随后，吸除蔗糖垫上方约1毫升处以上的上清液。

注意一毫升残留上清液与两毫升蔗糖垫之间的黄色界面。使用剪去尖端的 P1000 吸头，轻轻将残留上清液与蔗糖混合。合并所有蔗糖垫，并置于冰上保存。

接下来，按照文本方案中的说明，在薄壁的 38.5 毫升聚丙烯管中制备 40% 至 70% 的蔗糖梯度。将合并的界面缓慢加样至梯度中。用 10 毫摩尔 K-PIPES 缓冲液平衡离心管，并在 4 摄氏度条件下以 68,320 ×g 离心 75 分钟。

此后，使用0.8毫米针头在离心管底部打孔，注意不要扰动不同的蔗糖层。通过此孔在4°C下收集12份500微升的组分。使用剪切过的P200吸头，从每份组分中额外制备10微升等分试样，用于免疫荧光实验。

然后，用液氮速冻各组分。首先，将无菌的12毫米盖玻片放置在浓缩器凹陷的底端，确保将PDL包被面朝下。将适配器直接放置在盖玻片上方，以封住盖玻片。

然后，将圆底管倒置，套在浓缩器、盖玻片和适配器上。用镊子轻轻下压整个组件，直至其到达管底，再将管子翻转。加入10毫摩尔的K-PIPES缓冲液，直至液面升至浓缩器顶部。

确保浓缩器的中央圆柱体内无气泡。用P200移液器将100 µL的10 mmol/L K-PIPES缓冲液轻轻加入一份富集的中心粒组分中，并充分混匀。接着，从浓缩器的中空中心区域移除100 µL K-PIPES缓冲液，再加入100 µL缓冲液与组分的混合物，确保内容物始终保留在浓缩器的中空中心区域。

在预冷至 4 °C 的离心机中以 10,000 × g 离心 10 分钟。随后使用镊子移除浓缩器。将自制的带钩装置插入适配器槽口边缘的孔中，轻轻上提以回收盖玻片。

当移至管子顶部后，用戴着手套的手指固定适配器边缘，并使用镊子小心取下盖玻片，注意辨识盖玻片上含有中心粒的一侧。随后，对浓缩的中心粒进行固定和免疫荧光染色。首先，将带有中心粒的盖玻片放入预先准备好的晶体聚苯乙烯透射实验盒中，加入100%甲醇，在-20°C条件下孵育5分钟。

用镊子将盖玻片转移至一个装有 50 毫升 1× PBS 的透明实验盒中。在室温下让载玻片在 PBS 中洗涤 5 分钟。然后，在湿化室内的实验室封口膜上滴加 60 微升一抗混合液。

将盖玻片小心地放置在抗体混合液上，使中心粒正对液滴。让盖玻片孵育45分钟。随后，取下盖玻片，并在含有PBS的容器中清洗5分钟。

将洗涤后的盖玻片置于含1% BSA和0.05% Tween-20的PBS中，加入二抗，孵育45分钟。取出盖玻片，在含有PBS的盒子中洗涤5分钟。使用常规的抗荧光淬灭封片剂将盖玻片封固于载玻片上。

然后，使用63倍油镜（数值孔径为1.4）在共聚焦显微镜上对分离的中心粒进行成像，同时应用去卷积。分别在中心粒信号的上方和下方设置Z轴层扫的顶部和底部位置，并采集包含完整中心粒信号的大尺寸图像层栈。对层栈进行投影，并按照文本方案中所述进行单颗粒平均分析。

代表性免疫荧光结果显示，六个组分中均富集了分离的中心粒，其中第三组分富集程度最高，而最后两个组分则无明显富集，表明纯化过程成功。未使用浓缩装置时，每个视野仅约可见30个中心粒，而使用浓缩装置后可见183个。这表明浓缩步骤成功实现了中心粒在特定区域内的六倍富集，从而更易于检测和成像。

随后使用超分辨率显微镜对单谷氨酰化微管蛋白染色的中心粒进行成像，并利用软件为每个选定取向生成接近完美的平均图像。经过五次迭代后，得到了两类单谷氨酰化中心粒的平均图像：来自63个对象的顶视图和来自98个颗粒的侧视图。侧视图类别平均图像的长度为260纳米，直径为250纳米，与观测到的定位于中心粒核心区域的单谷氨酰化微管蛋白信号的实际测量值相当。

在进行此操作时，重要的是要记住将分离的中心粒保持在冰上，并在分离后迅速冷冻。完成此操作后，可采用其他方法，如冷冻电子显微镜和质谱分析，以回答更多问题，例如中心粒的天然结构或中心粒的蛋白质组成。