评估感染寨卡病毒的Ifnar1^-/-小鼠免疫豁免器官中病毒特异性T细胞应答

在寨卡病毒感染过程中，T细胞可浸润免疫豁免器官以清除病毒，但也可能引起免疫病理损伤，例如吉兰-巴雷综合征或睾丸损伤。该技术的主要优势在于，它能够通过四聚体法检测免疫豁免器官中针对寨卡病毒的抗原特异性T细胞，无论是在寨卡病毒感染期间还是疫苗免疫后均可实现。在此模型中，寨卡病毒感染始于干扰素α/β受体基因敲除小鼠，从而可在脑、睾丸和脾脏中追踪寨卡病毒特异性T细胞。

采用四聚体染色方法，可专门研究免疫特免器官中浸润的寨卡病毒特异性T细胞的特征，以探讨T细胞在免疫保护和免疫病理过程中的作用。对于寨卡病毒感染，通过眶后注射途径，向6至8周龄的干扰素α/β受体敲除小鼠注射100微升含1×10⁴个蚀斑形成单位的寨卡病毒。随后，连续15天每日监测感染动物的体重及临床症状。

接种后第7天，将感染的动物仰卧固定于手术泡沫板上，使用无菌手术刀沿腹部正中线做皮肤切口。用剪刀剪开腹肌，轻柔取出肝脏。随后取出脾脏，并用PBS冲洗组织三次，以去除血液。

最后一次洗涤后，将脾脏置于冰上、1.5 毫升预冷的 RPMI 培养基中，直至所有脾脏收集完毕。为制备单细胞悬液，将脾脏放入置于 50 毫升离心管上方的无菌 40 微米细胞筛网中，并向筛网中加入 2 毫升含 10% 胎牛血清（FBS）的预冷 RPMI 培养基。然后，使用 5 毫升注射器的推杆将组织研磨穿过滤膜，并用新鲜培养基冲洗，使释放的细胞通过筛网。

将单细胞悬液转移至15毫升锥形管中进行离心，并将沉淀重悬于5毫升红细胞裂解缓冲液中。室温裂解5至6分钟后，加入10毫升预冷的含FBS的RPMI培养基终止裂解，再次离心，然后将沉淀重悬于10毫升完全培养基中进行细胞计数。接种后第7天，将一只已安乐死的感染雄性小鼠俯卧固定在切板上，并使用直型一齿对二齿镊固定头皮。

使用虹膜剪在头皮正中做一纵向切口，暴露颅骨，并用尖头镊子夹住两侧眼眶，固定脑组织。将尖头虹膜剪的一侧刀尖插入枕骨大孔，向两侧横向剪开颅骨。从同一开口处沿正中线小心向上（朝向鼻部）剪开，操作时应尽量保持剪刀尖部贴近颅骨表面，避免损伤脑组织。

用镊子提起脑组织，使用锋利的虹膜剪小心分离颅神经纤维。然后用镊子将脑组织转移至含有5毫升冰冻RPMI加FBS的15毫升离心管中。为分离睾丸，用镊子提起腹部皮肤，用虹膜剪沿体表和腹壁纵向剪开，暴露腹部最下部区域。

将睾丸推至切口处，用镊子轻轻牵拉脂肪层，以暴露两侧的球形睾丸。使用虹膜剪仔细分离脂肪层和附睾，并将睾丸转移至含有5毫升冰冻RPMI加FBS的15毫升离心管中。为从所获取的组织中制备单细胞悬液，将器官置于置于50毫升离心管上方、孔径为100微米的无菌细胞筛网上，并向筛网中加入2毫升冰冻RPMI加FBS。

使用5毫升注射器的推杆研磨组织，并用新鲜培养基冲洗滤膜，直至器官完全通过滤网。将单细胞悬液转移至15毫升离心管中进行离心，然后将沉淀重悬于5毫升30%密度梯度介质中。在新的15毫升离心管中，将细胞悬液小心地铺加到2毫升70%密度梯度介质上方，通过密度梯度离心法分离细胞。

随后，将细胞从两个密度梯度之间的界面转移至一个新的15毫升离心管中，该离心管内含有10毫升冷的RPMI加FBS，进行另一次离心，并将沉淀重悬于10毫升冰预冷的RPMI/FBS中用于细胞计数。为通过流式细胞术分析细胞，用FACS缓冲液将细胞稀释至每100微升含5×10⁶个细胞的浓度，每份样品加入10微升抗小鼠CD16/CD32封闭抗体，室温孵育10分钟。之后，根据实验流式细胞术染色方案，将20微升细胞加入96孔圆底板中相应数量的孔内，每孔加入20微升E蛋白四聚体混合物，在室温避光条件下孵育30分钟。

孵育结束后，将感兴趣的细胞表面抗体加入细胞中，在4°C避光条件下孵育30分钟。接着，每次用200 µL FACS缓冲液洗涤细胞两次，每次洗涤后轻轻将每孔中的细胞重悬于200 µL新鲜FACS缓冲液中。然后将样品置于4°C避光保存，直至在流式细胞仪上进行分析。

在接种寨卡病毒7天后，干扰素α/β受体1基因敲除小鼠中可观察到脊髓麻痹和运动性截瘫等病理症状和体征。对感染的干扰素α/β受体1基因敲除动物在15天内进行体重变化监测，感染后第4天首次观察到体重下降，感染后第7天开始体重恢复。感染小鼠脑组织的代表性图像显示，接种寨卡病毒7天后出现明显的脑水肿和充血。

小鼠感染寨卡病毒后睾丸的代表性图像显示，从感染后第7天到第30天，睾丸逐渐缩小。对感染寨卡病毒的脑组织和睾丸组织切片进行组织病理学分析，也显示出与未感染对照组相比，其破坏性病理变化的影响。正如大体和组织病理学分析所预期的那样，通过免疫染色法也在寨卡病毒感染小鼠的脑和睾丸中检测到高病毒载量。

伴随寨卡病毒感染后，脑组织中出现强烈的CD3阳性T细胞浸润。通过E蛋白四聚体染色，在寨卡病毒感染小鼠及疫苗免疫小鼠中均可检测到寨卡病毒特异性的CD3阳性、CD8阳性T淋巴细胞。在接种寨卡病毒7天后，亦可在脑组织和睾丸中检测到E蛋白四聚体特异性的CD8阳性T细胞。

该技术建立后，为研究人员在动物模型自然感染过程中研究免疫高发器官内病原体特异性T细胞的特征开辟了道路。该方法还可应用于其他免疫高发器官，如胎盘或眼睛，以及病毒性感染和肿瘤的研究。通过本方案，可利用MHC-I四聚体进行免疫组织化学或免疫荧光检测，以分析浸润至脑组织或睾丸的病原体特异性T细胞的分布情况。