心脏外免疫细胞的分离与鉴定
2018年8月23日
该协议提出了一种简便、有效的方法, 用于分离、鉴定和量化在小鼠心肌中的免疫细胞在稳态或炎症状态下的存在。该协议结合酶和机械消化的生成单细胞悬浮, 可以进一步分析的流式细胞术。
这种方法可以帮助回答有关稳定和疾病状态下心脏内免疫细胞亚群组成的关键问题。该技术的主要优点是可用于心脏免疫细胞群的准确免疫表型分析，包括非常罕见的亚群。这个协议相对简单。
然而，尾静脉注射可能很困难，因此在使用实验动物之前练习这种技术直到您感到舒适是很重要的。为了标记循环中的白细胞，将 200 微升新鲜制备的小鼠荧光团偶联的抗 CD45 抗体（溶于 PBS）中放入 28.5 号胰岛素注射器中，并在设置为 35 至 41 摄氏度的循环水毯上预热 8 只 12 周龄的小鼠 5 至 10 分钟。当尾静脉扩张时，用适当的约束装置将第一只动物约束在胸骨位置。
如果尾脉没有充分扩张，请将尾巴浸入 36 至 40 摄氏度的水中 1 至 2 分钟。当尾静脉准备好时，用 70% 乙醇浸泡的纱布擦拭注射区域，并用食指和中指固定尾巴的根部，用拇指和无名指固定尾巴的中远端区域。握住针头斜面向上并平行于静脉，将针头插入扩张的尾静脉并静脉注射整个体积的抗体。
然后让抗体循环 5 分钟，然后进行人道安乐死。为了收获心脏，用 70% 乙醇喷洒小鼠并提起腹部皮肤，沿着从臀部到胸骨的腹侧中线打开腹部。打开腹膜并移动肝脏以露出隔膜。
切开中线两侧的横膈膜和肋骨，注意避免刺穿肺部和心脏。剥开肋骨以露出心脏，然后切开左右心房。用镊子轻轻抓住心脏底部，将连接到 60 毫升注射器的 21 号针头插入心尖附近的左心室，然后用 15 至 20 毫升冷 PBS 灌注心脏。
心脏的适当灌注对于避免血管内污染物至关重要。因此，安乐死后要注意快速解剖和灌注心脏，以避免因血液凝固而造成污染。如前所述，在灌注右心室后，应观察白色的肺和苍白的肝脏。
用镊子握住心脏底部，轻轻地将心脏向上拉，切开主要肺动脉和静脉、主动脉和心包囊，以分离心脏组织。用拇指和食指轻轻握住心脏，用干净的无绒纸巾仔细清洁心脏，并使用镊子去除心房和任何主要动脉和静脉的任何残留物或其他污染物。将清洁后的心脏放入 5 厘米长的塑料皿中，加入 50 微升冷 PBS。
使用弯曲的解剖剪刀将心脏切碎，直到没有可见的碎片并且组织具有光滑、厚实的稠度。使用弯曲的镊子将组织转移到含有 800 微升冷 DMEM 的 2 毫升微量离心管中。补充胶原酶、DNase 和透明质酸酶，并在 45 摄氏度和 60 rpm 下孵育 37 至 50 分钟。
在消化结束时，将样品涡旋 20 秒，然后立即将它们放在冰上。除非另有说明，否则样品应始终保持在 4 摄氏度，因为如果放在室温下，一些表面抗原可能会被内化。然后用 1 毫升冷 HBB 预湿每个样品在 50 毫升锥形管中的 140 μL 细胞过滤器。
使用 1 毫升移液器移液样品，直到组织悬液均匀且不会堵塞移液器吸头，并将均质化样品添加到过滤器中。用每个样品 12 至 14 mL 的冷 HBB 通过过滤器缓慢洗涤样品，然后将过滤后的样品转移到加有标签的 15 mL 冰锥形管中。过滤器中没有心脏残留物证明消化良好。
通过离心收集样品并去除上清液。向每个样品中加入 1 毫升氯化铵钾裂解缓冲液。通过短暂涡旋重悬样品，然后在室温下孵育 5 分钟。
然后用 5 到 8 毫升冷 HBSS 停止溶血。通过离心收集样品，并将沉淀重悬于 1 毫升荧光激活细胞分选或 FACS 缓冲液中，然后转移到单独的 1.5 毫升微量离心管中进行另一次离心。要通过流式细胞术分析样品，请将沉淀重悬于 50 μL 抗 CD16/CD32 抗体和单核细胞阻滞剂中，以减少非特异性抗体结合，在室温下孵育 15 分钟。
不洗涤，向每个样品中加入 50 μL 抗体预混液，混合，在 4 摄氏度避光孵育 30 分钟。在孵育结束时，用每管 600 微升 FACS 缓冲液洗涤样品，并将沉淀重悬于 300 微升新鲜 FACS 缓冲液或 1% 多聚甲醛中。然后根据标准流式分析方案通过流式细胞术分析心脏白细胞。
通过流式细胞术分析心脏单细胞悬液需要用 CD45 预设门，以区分心脏的免疫细胞和非免疫细胞，然后进行单细胞和小尺寸排阻设门。巨噬细胞通过其 CD64 表达来识别，是心脏的主要免疫细胞群，占所有免疫细胞的 60% 至 70%。传统的心脏树突状细胞是 CD64 阴性细胞，表达高水平的 MHC II 类和 CD11c。
这些细胞可以根据它们对 CD103 或 CD11b 的表达进一步分裂，并且与巨噬细胞相比，它们代表的心脏亚群要小得多。使用心肌单细胞悬液的流式细胞术可以研究心脏内的小白细胞亚群。例如，使用流式细胞术分析比较野生型心肌免疫细胞与 Batf3 缺陷小鼠，可以确认基因敲除动物中缺乏 CD103 阳性树突状细胞。
此外，该分析揭示了 Batf3 缺陷动物中其他心脏群体的组成没有显着改变，证明了使用这种酶和机械消化的组合方法实现单细胞悬液可以达到的灵敏度程度。在尝试此过程时，请务必始终考虑细胞分离物的活力。因此，我们建议您根据您的实验条件优化消化的时间和酶浓度。
在此程序之后，可以执行其他方法，例如单细胞 RNA 测序、功能测定和磁珠分离，以回答有关分离细胞功能的其他问题。
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概述
本协议提供了一种简单高效的方法来分离、识别和定量小鼠心肌中的免疫细胞，无论是在稳态还是炎症状态下。该方法可以帮助回答关于心脏内免疫细胞亚群组成的关键问题，既包括稳态，也包括疾病状态。
关键研究组成部分
科学领域
- 免疫学
- 心脏病学
- 流式细胞术
背景
- 心脏包含各种免疫细胞群体。
- 理解这些群体对心脏健康至关重要。
- 准确的免疫表型分析对于研究罕见的免疫亚群至关重要。
- 尾静脉注射是标记循环白细胞的常用方法。
研究目的
- 分离和定量心肌中的免疫细胞。
- 分析不同生理状态下的免疫细胞亚群。
- 改进研究心脏免疫反应的技术。
使用的方法
- 酶解和机械消化以创建单细胞悬液。
- 流式细胞术用于分析免疫细胞群体。
- 尾静脉注射荧光素结合的抗CD45抗体。
- 预热小鼠以便于尾静脉接触。
主要结果
- 成功从小鼠心肌中分离免疫细胞。
- 识别各种免疫细胞亚群。
- 证明了该技术在稳态和炎症状态下的有效性。
- 强调了成功进行尾静脉注射的练习的重要性。
结论
- 该协议提供了一种可靠的方法来研究心脏免疫细胞。
- 它增强了对心脏免疫反应的理解。
- 该技术对于经过适当培训的研究人员来说是可行的。
常见问题
Executive Industry Relevance
Accurate profiling of cardiac immune cell subsets enables mechanistic de-risking in cardiovascular target validation by clarifying inflammatory pathways and immune-mediated mechanisms of action. This method supports predictive confidence in preclinical models by providing quantitative, reproducible immunophenotyping data that informs go/no-go decisions in early discovery. The approach addresses a critical gap in studying rare but functionally significant immune populations during steady-state conditions, enhancing translational relevance for immuno-cardiology programs.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by quantifying immune cell composition and functional compartmentalization in the myocardium.
- Operational Value: Provides a reliable method to distinguish true tissue-resident immune signals from intravascular contamination, improving data integrity.
- Strategic Value: Supports target de-risking through precise identification of macrophage and dendritic cell subsets implicated in cardiac inflammation and fibrosis.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates a standardized single-cell suspension suitable for high-dimensional flow cytometry panels, enabling consistent immunophenotyping across experiments.
- Operational Value: Combines enzymatic and mechanical digestion with vascular labeling to achieve high viability and purity, reducing assay variability.
- Strategic Value: Establishes a reproducible workflow for immune cell isolation that can be adapted across disease models and screening campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Facilitates longitudinal immune monitoring from steady state to inflammatory conditions, supporting biomarker discovery and mechanistic insight.
- Operational Value: Outputs are compatible with downstream applications such as FACS sorting, magnetic bead separation, and single-cell RNA sequencing for functional validation.
- Strategic Value: Enables risk-adjusted advancement by confirming target engagement and immune modulation in relevant preclinical models.
Pipeline & Workflow Integration
This method fits within the discovery continuum from target validation through lead optimization, providing immune profiling data that informs mechanism of action and safety assessment in cardiovascular drug development.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by enabling quantification of key immune subsets like CD64+ macrophages and CD11c+ MHC-IIhi dendritic cells in the heart.
- Screening: Delivers quantitative, flow-cytometry-ready single-cell suspensions that allow comparison of immune composition across genetic or pharmacological conditions.
- Analytics: Generates multi-parametric immune phenotypes (e.g., CD103+ vs CD11b+ dendritic cell ratios) that help de-risk targets by revealing subset-specific responses.
- Translational Research: Connects immune cell dynamics to disease progression, supporting biomarker alignment in models of cardiac inflammation and remodeling.
- Enterprise Reuse: The core isolation and labeling strategy is adaptable to other organs and disease areas, promoting cross-platform standardization.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by enabling confident identification of rare immune subsets that drive cardiac pathophysiology.
- Operational Value: Standardizes immune cell isolation through defined enzymatic digestion, vascular labeling, and flow cytometry gating strategies.
- Strategic Value: Improves portfolio prioritization by providing immune-mediated mechanism data that informs combination therapy and patient stratification strategies.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted decision-making through reproducible quantification of immune cell changes in preclinical efficacy and safety studies.
Implementation Considerations
- Requires expertise in murine handling, tail vein injection techniques, and aseptic tissue dissection to ensure sample quality.
- Dependent on access to flow cytometry equipment, fluorescence-conjugated antibodies, and enzymatic reagents (collagenase, hyaluronidase, DNAse).
- Necessitates standardization of perfusion, digestion, and lysis timing across operators to minimize variability in immune cell yield and viability.
- Requires optimization of enzyme concentration and incubation time based on heart size, age, and disease state to preserve epitope integrity.
- Limited by the need for immediate processing post-excision to prevent surface antigen internalization and maintain staining fidelity.
