Name: 小鼠骨髓基质树突状细胞诱导 CD4 T 细胞活化、增殖和 Th1 分化的体外模型研究 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 39 s
Description: 学习利用GM-CSF骨髓来源树突状细胞诱导CD4 T细胞活化、增殖及Th1分化的体内研究方法。该方案结合体外细胞操作与体内免疫反应评估，为适应性免疫研究提供可靠工具。

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感谢 Simon Bartlett 博士在英文编辑方面提供的帮助。本研究获得了卡洛斯三世健康研究所（Instituto de Salud Carlos III，ISCIII）基金（PI14/00526；PI17/01395；CP11/00145；CPII16/00022）、Miguel Servet 计划和拉蒙·阿雷塞斯基金会（Fundación Ramón Areces）的资助，并由欧洲区域发展基金（Fondo Europeo de Desarrollo Regional，FEDER）共同资助。国家心血管研究中心（CNIC）由经济、工业和竞争力部（Ministerio de Economía, Industria y Competitividad，MEIC）、Pro CNIC 基金会支持，并被认定为 Severo Ochoa 卓越研究中心（SEV-2015-0505）。RTF 由拉蒙·阿雷塞斯基金会和 CNIC 资助，VZG 由 ISCIII 资助，BHF 由 12 de Octubre 医院健康研究研究所（Instituto de Investigación Sanitaria Hospital 12 de Octubre，imas12）资助，JMG-G 由 ISCIII Miguel Servet 计划和 imas12 资助。

实验方案经卡洛斯三世国家心血管研究中心基金会（CNIC）和马德里自治区政府批准，符合西班牙及欧洲的指导方针。小鼠在特定无病原体（SPF）条件下饲养，并通过吸入二氧化碳（CO2）实施安乐死。
1. 从小鼠胫骨和股骨中分离骨髓细胞
注意：C57BL/6 同源近交小鼠品系携带差异性白细胞标记 Ptprca，通常称为 CD45.1 或 Ly5.1；而野生型 C57BL 品系携带 Ptprcb 等位基因，即 CD45.2 或 Ly5.2。可通过流式细胞术利用特异性抗体区分 CD45.1 与 CD45.2 亚型。CD45.1、CD45.2 以及 CD45.1/CD45.2 小鼠均可作为细胞供体或过继性转移的受体，从而利用流式细胞术追踪不同细胞群体。建议优先选用年龄和性别匹配、且年龄小于 12 周的雄性或雌性小鼠。
<ol>
	<li>股骨和胫骨的制备
	<ol>
		<li>按照机构动物护理委员会批准的方案对小鼠实施安乐死。</li>
		<li>用70%乙醇喷洒动物体表，对后肢进行消毒。</li>
		<li>使用无菌剪刀、镊子和手术刀。用手术刀在皮肤上切开，并去除包括后肢覆盖皮肤在内的小鼠远端皮肤。剥离小腿肌肉周围的皮肤，并完全将皮肤从腿部去除（图2A，2B）。</li>
		<li>用手术刀将股四头肌与股骨分离，解离髋关节时避免破坏股骨头。用手术刀去除胫骨上的肌肉（图2C，2D）。分离股骨与胫骨时，避免破坏骨端。</li>
		<li>将骨骼置于含有10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素/链霉素的冰冻1×Roswell Park Memorial Institute（RPMI）1640培养基的培养皿中保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>细胞分离 
	注意：所有后续步骤均须在培养罩内使用无菌材料进行，以避免污染。
	<ol>
		<li>在无菌培养皿中，用手术刀小心切除每根骨骼的近端和远端末端。</li>
		<li>用总共10 mL温热的完全RPMI培养基（RPMI + 10% FBS、2 mM EDTA、1%青霉素/链霉素、20 mM HEPES、55 µM 2-巯基乙醇、1 mM丙酮酸钠和2 mM L-谷氨酰胺）反复冲洗骨骼。使用连接1 mL注射器的25 G针头从骨骼两端进行冲洗。</li>
		<li>将冲洗液转移至配有70 µm尼龙滤网的50 mL锥形管中。通过轻柔搅拌和移液小心去除碎片和细胞团块。</li>
		<li>将细胞悬液在室温（RT）下以250 × g 离心10分钟。</li>
		<li>将细胞沉淀重悬于1 mL冰冷的红细胞裂解缓冲液（0.15 M NH4Cl + 1 mM KHCO3 + 0.1 mM EDTA，用1 N HCl调节pH至7.2，经0.4 µm无菌过滤后，储存于4 °C）中。冰上孵育5分钟，期间手动轻轻振荡。</li>
		<li>加入10 mL冰冷缓冲液（1×磷酸盐缓冲液（PBS）+ 2 mM EDTA + 2%牛血清白蛋白（BSA）），以中和并洗去红细胞裂解缓冲液。</li>
		<li>将细胞悬液在4 °C下以250 × g 离心5分钟。</li>
		<li>用25 mL完全RPMI培养基洗涤细胞，并在4 °C下以250 × g 离心5分钟。</li>
		<li>将细胞重悬于5 mL完全RPMI培养基中。取50 µL细胞悬液与等体积台盼蓝混合。在显微镜下使用计数板确定细胞数量。按以下公式计算细胞浓度：细胞数/mL = [（未染色细胞计数/4）× 2 × 10,000]12。 
		注意：该方法可从每只未感染的8至12周龄C57BL/6小鼠获得约40 × 106 至60 × 106 个骨髓细胞。</li>
		<li>将细胞悬液在4 °C下以250 × g 离心5分钟。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 树突状细胞的分化、成熟与抗原负载
<ol>
	<li>骨髓细胞收获
	<ol>
		<li>将完全培养基接种于6孔超低吸附表面培养板中，每毫升培养基接种106个细胞，通常每孔5 mL。分化后的巨噬细胞会贴附于培养板上。12小时后，将主要含有单核细胞的上清液转移至新的6孔板中，弃去含有贴壁巨噬细胞的旧6孔板。</li>
		<li>为促进细胞分化，将非贴壁细胞以每毫升5 × 105个细胞的密度接种于完全RPMI培养基中，通常每孔5 mL，培养基中含20 ng/mL商品化重组小鼠GM-CSF，在37 °C、5%二氧化碳（CO2）条件下培养，并每日观察。</li>
		<li>每隔3天，离心收集悬浮细胞，并用含5 mM EDTA的PBS收集贴壁细胞，随后离心。将两部分细胞合并后，重悬于含20 ng/mL rm-GM-CSF的新鲜培养基中，调整细胞密度为5 × 105个/mL。</li>
		<li>第8天，按上述方法收集贴壁及脱落细胞，重悬于含20 ng/mL GM-CSF和20 ng/mL脂多糖（LPS）的培养基中，终浓度为5 × 105个/mL，在未经组织培养处理的无菌培养皿中继续培养24小时，以诱导高表达MHC-II、CD80和CD86。</li>
		<li>按步骤2.2所述方法，通过流式细胞术检测树突状细胞（DC）的分化情况。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>流式细胞术分析细胞分化与成熟状态
	<ol>
		<li>在4 °C条件下，以250 × g离心细胞悬液5分钟。重复此步骤两次。</li>
		<li>根据制造商说明书，将重悬的细胞沉淀与小鼠Fc受体阻断剂（纯化的抗小鼠CD16/CD32 IgG2b抗体）在4 °C孵育15分钟，以阻断Fc受体。</li>
		<li>在4 °C条件下，以250 × g离心细胞悬液5分钟。</li>
		<li>每种检测样本中，将250,000个细胞重悬于300 µL流式细胞术缓冲液（1× PBS + 2 mM EDTA + 2% BSA）中，置于4 °C。</li>
		<li>将每孔30 µL细胞溶液转移至96孔板中。</li>
		<li>在4 °C条件下，以250 × g离心细胞悬液5分钟。</li>
		<li>弃去上清液，根据制造商说明，向每孔加入含抗体的缓冲液30 µL。在4 °C条件下，将细胞与抗体孵育20分钟。 
		注：通常用于树突状细胞、单核细胞和巨噬细胞的标记物包括CD11b、CD64、CD115、CD11c、MHCII、CD80和CD86（图3）。</li>
		<li>在4 °C条件下，以250 × g离心样本5分钟，然后每孔重悬于200 µL冷流式细胞术缓冲液中，缓冲液中加入用于排除死细胞的标记物（例如，碘化丙啶、4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）或胺反应性染料），浓度按制造商推荐使用13。</li>
		<li>将样本转移至流式细胞术管中，在第0、3、6和9天进行流式细胞术分析，并排除死细胞，以监测细胞分化过程。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>树突状细胞抗原负载
	<ol>
		<li>第8天，在4 °C条件下，以250 × g离心样本5分钟，将细胞沉淀重悬于200 µL培养基（RPMI + 10% FBS，不含抗生素）中。重复此步骤两次。</li>
		<li>将树突状细胞与OVAp肽（323-339；ISQAVHAAHAEINEAGR）在1 mL培养基（RPMI + 1% FBS）中于37 °C孵育至少30分钟，每1 × 107个树突状细胞使用10 µg/mL OVAp。以未负载OVAp的树突状细胞作为阴性对照。</li>
		<li>在4 °C条件下，以250 × g离心样本5分钟，将细胞沉淀重悬于200 µL完全RPMI培养基中。重复此步骤两次。</li>
		<li>在4 °C条件下，以250 × g离心样本5分钟，将细胞沉淀重悬于200 µL培养基（RPMI + 10% FBS）中，调整细胞密度为2 × 106个/mL。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 从OTII小鼠中分离初始型CD4 T细胞
注意：该方法可从每只未感染的8至12周龄C57BL/6小鼠获得约100 × 106个脾细胞。可使用雄性和雌性小鼠。CD4 T细胞可从脾脏或淋巴结中分离；在这两种器官中，CD4 T细胞分别约占细胞总数的25%和50%。以下步骤均需在无菌条件下进行。
<ol>
	<li>从OTII转基因小鼠中分离腹股沟、腋窝、臂部、颈部及肠系膜淋巴结以及脾脏图4）并转移至含有10 mL完全RPMI培养基的塑料培养皿中。</li>
	<li>用 2 mL 完全 RPMI 培养基冲洗细胞滤筛，并将其从 50 mL 离心管中移除。将淋巴结和脾脏转移至置于 50 mL 离心管中的 70 µm 细胞滤筛中。使用注射器活塞进行匀浆处理（图5）并加入培养基至15 mL。</li>
	<li>将样品在 250 x g 4 °C下离心5分钟，将沉淀重悬于15 mL完全RPMI培养基中。重复此步骤两次。</li>
	<li>对于脾脏细胞悬液，将细胞沉淀重悬，并按照步骤1.2.5中的说明裂解红细胞。</li>
	<li>将细胞悬液在250 x g 4 °C下离心5分钟。</li>
	<li>用 25 mL 完全 RPMI 培养基洗涤细胞，于 250 x g 离心 g 室温下孵育5分钟。</li>
	<li>将细胞重悬于5 mL培养基中。取50 µL细胞悬液，与台盼蓝按1:1比例混合。在显微镜下使用计数板对细胞进行计数。按以下公式计算细胞浓度：细胞/mL = [（未染色细胞数/4）× 2 × 10,000]12.</li>
	<li>重复步骤 2.2.2。</li>
	<li>根据制造商说明书，将细胞与CD8α、IgM、B220、CD19、MHCII（I-Ab）、CD11b、CD11c、CD44、CD25和DX5的生物素化抗体以1:800稀释度在冰上孵育30分钟，用于后续CD4 T细胞的阴性筛选。</li>
	<li>根据制造商说明书，结合细胞数量和磁珠容量，计算所需链霉亲和素包被的磁性微珠用量，并使用磁性细胞分选仪及相应的分离柱分离CD4 T细胞。</li>
	<li>将细胞重悬于5 mL完全RPMI培养基中，置于冰上保存，并按照步骤3.7所述计数活细胞。</li>
	<li>提取 2 x 105 细胞，并使用流式细胞仪结合抗CD4、CD3、B220和CD8荧光抗体（按制造商推荐的抗体稀释比例）检测所收集细胞的纯度。</li>
	<li>为了染色分离的初始型CD4/OTII T细胞，重悬106 将细胞重悬于500 µL缓冲液（1x PBS + 2 mM EDTA + 2% BSA）中。配制500 µL含双倍终浓度（按制造商推荐）的活细胞示踪染料的缓冲液（1x PBS + 2 mM EDTA + 2% BSA）。将细胞示踪染料溶液缓慢加入细胞悬液中，轻轻混匀。37 °C孵育5分钟。</li>
	<li>用 5 mL 完全 RPMI 培养基洗涤细胞，在 4 °C 下以 250 × g 离心 5 分钟。重复此步骤两次。将细胞重悬于 1 mL 完全 RPMI 培养基中，浓度为 1 × 107cells/mL</li>
</ol>
4. 体内 活化、增殖与Th1分化检测
注意：活细胞示踪染料羧基荧光素二乙酸盐琥珀酰亚胺酯（CFSE）以及其他基于琥珀酰亚胺酯、在不同波长被激发并发射荧光的染料，因其荧光强度高、持续时间长、变异性低且毒性小，被广泛用于通过流式细胞术评估淋巴细胞增殖14。
<ol>
	<li>通过静脉注射（i.v.）将 1 × 106 个经活细胞示踪染料标记的活体初始 CD4/OTII T 细胞以每只小鼠 100 µL PBS 悬浮液的形式过继转移。标记的 T 细胞可通过尾静脉或眶后注射方式进行过继转移15；在这两种情况下，细胞均会归巢至淋巴器官（图 6A）。</li>
	<li>在过继转移后一天，通过皮下注射（s.i.）将 100,000 个经 LPS 成熟并负载 OVAp 的树突状细胞（DC）注入受体小鼠足垫，以进行免疫攻击（图 6B）。</li>
	<li>在免疫后第 2 天取受体小鼠的腘窝淋巴结，用于检测 CD4/OTII T 细胞的活化；在第 5 天取材以检测增殖及 Th1 分化。将淋巴结组织处理成单细胞悬液，操作步骤同前文 3.1 和 3.2 所述。</li>
	<li>为在第 2 天分析 T 细胞活化情况，使用针对 CD4、CD69 和 CD25 的荧光标记抗体（可选 CD45.1 和 CD45.2）对细胞进行染色，并通过流式细胞术测定 CD4 细胞群中 CD69+CD25+ T 细胞的比例（图 7）。</li>
	<li>为在第 5 天检测 T 细胞增殖情况，使用针对 CD4 的适当荧光抗体（可选 CD45.1 和 CD45.2）对细胞进行染色，并通过流式细胞术分析 CD4 细胞群中活细胞示踪染料信号的衰减情况（图 8）。此类研究中可测定多个参数，例如被活细胞示踪染料标记的细胞所经历的细胞分裂次数、各荧光峰中分裂细胞的百分比，以及总细胞群体中分裂细胞的百分比。</li>
	<li>为在第 5 天测定 Th1 分化情况，将 400,000 个细胞接种至 96 孔板中每孔 200 µL 完全 RPMI 培养基，培养基中含 1 µM 离子霉素和 10 ng/mL 佛波酯 12-肉豆蔻酸酯 13-乙酸酯（PMA），在 37 °C 培养箱中孵育 6 小时。在最后 4 小时加入 3–10 µg/mL 莫能霉素 A（brefeldin A），以阻断细胞因子向培养基中的分泌。</li>
	<li>在 4 °C 条件下以 250 × g 离心 5 分钟。通过快速倒置 96 孔板弃去上清液。</li>
	<li>重复步骤 2.2.2。</li>
	<li>在 4 °C 条件下，将细胞在含推荐稀释比例抗体的 30 µL 缓冲液（1× PBS + 2 mM EDTA + 2% BSA）中孵育 15 分钟，以染色细胞膜表面抗原（CD4，可选 CD45.1 和 CD45.2）。加入 150 µL 缓冲液（1× PBS + 2 mM EDTA + 2% BSA）洗涤细胞，4 °C 下以 250 × g 离心 5 分钟，弃去上清液。</li>
	<li>加入 100 µL 含 2% 多聚甲醛和 1% 蔗糖的固定液，在室温下固定 20 分钟。在 4 °C 条件下以 1,000 × g 离心 5 分钟，弃去上清液。</li>
	<li>加入 50 µL 胞内通透缓冲液（1× PBS + 0.1% BSA, 0.01 M HEPES, 0.3% 皂苷），在 4 °C 条件下孵育 30 分钟。</li>
	<li>加入 150 µL PBS，在室温下以 1,000 × g 离心 5 分钟，弃去上清液。</li>
	<li>在缓冲液（PBS + 0.1% 皂苷）中加入 30 µL 荧光素偶联的抗 IFNγ 抗体，室温孵育 30 分钟，以染色胞内细胞因子。</li>
	<li>加入 150 µL 缓冲液（PBS + 0.1% 皂苷）洗涤细胞，在室温下以 1,000 × g 离心 5 分钟，弃去上清液。重复此步骤两次。</li>
	<li>通过流式细胞术分析细胞群体（图 8）。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露

本方案可用于表征骨髓来源树突状细胞（BM-derived DCs）调控初始CD4 T细胞活化、增殖和分化的潜能。此外，该方案也可用于评估CD4 T细胞对骨髓来源树突状细胞调控作用的敏感性。利用本方案，可体内（in vivo）检测上述事件的变化。
根据所研究的假设，可以使用多种T细胞与树突状细胞（DC）的组合。例如，可分析特定基因的敲入或敲除对CD4 T细胞活化、增殖或Th1分化的效应，或评估特定刺激诱导CD4 T细胞反应的效率。这些操作可在DC、CD4 T细胞或两种细胞上分别进行。因此，可将来自野生型或基因修饰小鼠的CD4 T细胞与来自野生型小鼠的DC相结合，反之亦然。
本方案可通过流式细胞术和抗CD45.1与CD45.2抗体来区分不同细胞群体的来源。实际上，CD45.1/CD45.1和CD45.2/CD45.2小鼠可作为所用任何细胞类型的供体，或作为过继转移实验中的受体，二者可任意组合使用。例如，CD4 T细胞可来源于CD45.1/CD45.1/OTII小鼠，而CD45.2/CD45.2小鼠则可作为树突状细...

CD4 T细胞和树突状细胞（DCs）等抗原呈递细胞（APCs）是介导针对微生物病原体免疫反应所必需的成分1,2。在外周淋巴器官中，CD4 T细胞通过识别APC呈递的特异性抗原而被激活3,4,5。活化的CD4 T细胞增殖并分化为具有特定功能的效应性Th细胞，这些细胞对于正确适应性免疫应答的建立至关重要6,7。对这些过程的调控对于产生有效的适应性免疫防御至关重要，既能清除病原体，又避免造成有害的组织损伤8。Th细胞根据其表面分子、转录因子和效应细胞因子的表达或产生情况进行分类，并在应对病原体时发挥必要且精确的功能1。Th1细胞亚群表达转录因子T-bet和细胞因子干扰素γ（IFNγ），参与宿主对胞内病原体的防御1。对初始CD4 T细胞的活化、增殖及Th1分化进行定量分析，是评估T细胞在免疫应答中作用的有效手段。
本方案可实现 体内 分析……的能力 体外-诱导骨髓来源的树突状细胞（BM-derived DCs）以调控初始CD4 T细胞的活化、增殖及Th1分化。该方案也可用于评估初始CD4 T细胞被活化、诱导增殖以及Th1分化的潜能。图1）。这种多功能方案克服了在纯化细胞群体中无法特异性操控或筛选目标研究细胞的局限性。 体内 通过使用基因修饰小鼠的骨髓，可研究不同分子和处理方法对树突状细胞的影响。5 或通过处理或基因操控分离的骨髓细胞9同样，可以通过从不同来源获取T细胞或经过多种处理后获得T细胞，用于过继性转移，从而研究T细胞应答。3,8,10.
该方案的主要优势有两点：采用流式细胞术分析T细胞的活化、增殖及Th1分化；并将其与 体内 研究，从而避免可能发生的变化 体外 并包含完整器官中才存在的细胞类型及其他因素11.
活体染料的使用是一种广泛采用的技术，可用于追踪细胞增殖，同时避免放射性物质的使用。这些试剂对细胞增殖的检测基于细胞分裂后的染料稀释原理。此外，这些染料可在多个波长下被检测，并可与多种荧光抗体或标记物联合，通过流式细胞术进行便捷分析。我们通过展示如何利用流式细胞术分析T细胞活化、增殖以及Th1分化，突出了本实验方案的应用价值。

<table><tbody><tr><td>乙醇</td><td>VWR Chemicals</td><td>20,824,365</td><td>5 L</td></tr><tr><td>剪刀</td><td>Fine Science Tools (F.S.T.)</td><td>14001-12</td><td></td></tr><tr><td>镊子</td><td>Fine Science Tools (F.S.T.)</td><td>11000-13</td><td></td></tr><tr><td>精细镊子</td><td>Fine Science Tools (F.S.T.)</td><td>11253-20</td><td></td></tr><tr><td>手术刀</td><td>Fine Science Tools (F.S.T.)</td><td>10020-00</td><td>100片装刀片</td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>SIGMA</td><td>F7524</td><td></td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>LONZA</td><td>DE17-602E</td><td></td></tr><tr><td>罗斯韦尔帕克纪念研究所培养基（RPMI）</td><td>GIBCO</td><td>21875-034</td><td></td></tr><tr><td>无菌培养皿</td><td>Falcon</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>25号针头</td><td>BD Microlance 3</td><td>300600</td><td></td></tr><tr><td>1 ml 注射器</td><td>Novico</td><td>N15663</td><td></td></tr><tr><td>15 ml 锥形管</td><td>Falcon</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>50 ml 锥形管</td><td>Falcon</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>70 &amp;mu;m 尼龙网滤器</td><td>BD Falcon</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>红细胞裂解缓冲液</td><td>SIGMA</td><td>R7757</td><td>100 ml</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>SIGMA</td><td>ED2SS-250</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>SIGMA</td><td>A7906</td><td>100 g</td></tr><tr><td>台盼蓝</td><td>SIGMA</td><td>302643-25G</td><td></td></tr><tr><td>培养板</td><td>Falcon</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸（HEPES）</td><td>Cambrex</td><td>BE17-737E</td><td></td></tr><tr><td>β-巯基乙醇</td><td>Merck</td><td>8-05740-0250</td><td></td></tr><tr><td>丙酮酸钠</td><td>LONZA</td><td>BE13-115E</td><td></td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺</td><td>LONZA</td><td>BE17-605E</td><td></td></tr><tr><td>重组小鼠粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）</td><td>Prepotech</td><td>315-03</td><td></td></tr><tr><td>脂多糖（LPS）</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>L2018</td><td></td></tr><tr><td>96孔板</td><td>Costar</td><td>3799</td><td></td></tr><tr><td>v450 标记抗小鼠 CD11b 抗体</td><td>BD Biosciences</td><td>560455</td><td></td></tr><tr><td>PE 标记抗小鼠 CD64 抗体</td><td>BioLegend</td><td>139303</td><td></td></tr><tr><td>PE 标记抗小鼠 CD115 抗体</td><td>BioLegend</td><td>135505</td><td></td></tr><tr><td>FITC 标记抗小鼠 CD11c 抗体</td><td>BioLegend</td><td>117305</td><td></td></tr><tr><td>FITC 标记抗小鼠 MHCII 抗体</td><td>BioLegend</td><td>125507</td><td></td></tr><tr><td>APC 标记抗小鼠 CD86 抗体</td><td>BioLegend</td><td>105011</td><td></td></tr><tr><td>APC 标记抗小鼠 CD80 抗体</td><td>BioLegend</td><td>104713</td><td></td></tr><tr><td>流式细胞仪管</td><td>Zelian</td><td>300800-1</td><td>PS 12×75 5 mL</td></tr><tr><td>OTII 卵清蛋白肽</td><td>InvivoGen</td><td>323-339</td><td></td></tr><tr><td>生物素化抗小鼠 CD8&amp;alpha; 抗体</td><td>Tonbo Biosciences</td><td>30-0081-U500</td><td></td></tr><tr><td>生物素化抗小鼠 IgM 抗体</td><td>BioLegend</td><td>406503</td><td></td></tr><tr><td>生物素化抗小鼠 B220 抗体</td><td>Tonbo Biosciences</td><td>30-0452-U500</td><td></td></tr><tr><td>生物素化抗小鼠 CD19 抗体</td><td>Tonbo Biosciences</td><td>30-0193-U500</td><td></td></tr><tr><td>生物素化抗小鼠 MHCII (I-Ab) 抗体</td><td>BioLegend</td><td>115302</td><td></td></tr><tr><td>生物素化抗小鼠 CD11b 抗体</td><td>Tonbo Biosciences</td><td>30-0112-U500</td><td></td></tr><tr><td>生物素化抗小鼠 CD11c 抗体</td><td>BioLegend</td><td>117303</td><td></td></tr><tr><td>生物素化抗小鼠 CD44 抗体</td><td>BioLegend</td><td>103003</td><td></td></tr><tr><td>生物素化抗小鼠 CD25 抗体</td><td>Tonbo Biosciences</td><td>30-0251-U100</td><td></td></tr><tr><td>生物素化抗小鼠 DX5 抗体</td><td>BioLegend</td><td>108903</td><td></td></tr><tr><td>链霉亲和素包被的磁珠</td><td>MACS Miltenyi Biotec</td><td>130-048-101</td><td></td></tr><tr><td>磁性细胞分选仪</td><td>MACS Miltenyi Biotec</td><td>130-090-976</td><td>QuadroMACS 分选仪</td></tr><tr><td>分离柱</td><td>MACS Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>PE 标记抗小鼠 CD4 抗体</td><td>BioLegend</td><td>100408</td><td></td></tr><tr><td>APC 标记抗小鼠 CD3 抗体</td><td>BioLegend</td><td>100235</td><td></td></tr><tr><td>FITC 标记抗小鼠 CD8 抗体</td><td>Tonbo Biosciences</td><td>35-0081-U025</td><td></td></tr><tr><td>Cell Violet 示踪剂</td><td>Thermofisher</td><td>C34557</td><td></td></tr><tr><td>APC 标记抗小鼠 CD25 抗体</td><td>Tonbo Biosciences</td><td>20-0251-U100</td><td></td></tr><tr><td>Alexa647 标记抗小鼠 CD69 抗体</td><td>BioLegend</td><td>104518</td><td></td></tr><tr><td>PerCP-Cy5.5 标记抗小鼠 CD45.1 抗体</td><td>Tonbo Biosciences</td><td>65-0453</td><td></td></tr><tr><td>APC 标记抗小鼠 CD45.1 抗体</td><td>Tonbo Biosciences</td><td>20-0453</td><td></td></tr><tr><td>PE-Cy7 标记抗小鼠 CD45.1 抗体</td><td>Tonbo Biosciences</td><td>60-0453</td><td></td></tr><tr><td>FITC 标记抗小鼠 CD45.2 抗体</td><td>Tonbo Biosciences</td><td>35-0454</td><td></td></tr><tr><td>离子霉素</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>I0634</td><td></td></tr><tr><td>佛波醇-12-十四烷酸酯-13-乙酸酯（PMA）</td><td>SIGMA</td><td>P8139</td><td></td></tr><tr><td>Brefeldin A（BD GolgiPlug）</td><td>BD</td><td>555029</td><td></td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>Millipore</td><td>8-18715-02100</td><td></td></tr><tr><td>细胞内透化缓冲液</td><td>eBioscience</td><td>00-8333</td><td></td></tr><tr><td>APC 标记抗小鼠 IFNγ 抗体</td><td>Tonbo Biosciences</td><td>20-7311-U100</td><td></td></tr><tr><td>Fc阻断剂（抗小鼠 CD16/CD32）</td><td>Tonbo Biosciences</td><td>70-0161-U100</td><td></td></tr><tr><td>B6.SJL CD45.1 小鼠</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>002014</td><td></td></tr><tr><td>BD LSRFortessa&amp;trade; 细胞分析仪</td><td>BD Biosciences</td><td>649225</td><td></td></tr><tr><td>DAPI 溶液</td><td>Thermofisher</td><td>62248</td><td></td></tr></tbody></table>

一个 在体 内 用于测量骨髓来源树突状细胞诱导的初始cd4 t细胞活化、增殖及th1分化的 小鼠模型

An In Vivo Mouse Model to Measure Na&#239;ve CD4 T Cell Activation, Proliferation and Th1 Differentiation Induced by Bone Marrow-derived Dendritic Cells

初始CD4 T细胞活化、增殖及其向辅助性T细胞1（Th1）分化的定量分析是评估T细胞在免疫应答中作用的有效方法。本方案描述了 体外 骨髓（BM）前体细胞分化为粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）诱导的树突状细胞（DCs）。该方案还描述了将负载卵清蛋白肽（OVAp）的GM-CSF来源DCs及来自OTII转基因小鼠的初始CD4 T细胞进行过继转移，以分析 体内 活化、增殖及转输的CD4 T细胞向Th1的分化。该方案克服了单纯 体内 因无法特异性地操控或筛选目标细胞群体而受到限制的方法。此外，本方案还允许在 体内 环境，从而避免可能发生的功能性因素改变 体外 并包含完整器官中特有的细胞类型及其他因素的影响。该方案是研究树突状细胞（DCs）和T细胞变化的有力工具，可调节适应性免疫应答，有望为理解多种免疫相关疾病的起源或发展提供重要结果。

图1 展示了本方案中所述的步骤。 图2 展示了小鼠骨髓细胞的分离与培养。在这些培养物中加入GM-CSF和LPS可使 体外 树突状细胞的生成与成熟 图3 展示了所获得的树突状细胞（DCs）分化与成熟的流式细胞术分析。将负载OVAp的GM-CSF诱导的骨髓来源DCs与经活细胞示踪染料标记的CD4/OTII T细胞过继转移至小鼠体内。 图4 显示用于分离CD4/OTII T细胞的淋巴结位置。 图5 显示一个配有 70 µm 尼龙滤膜和注射器活塞用于匀浆淋巴结和脾脏。 图6 显示将CD4/OTII T细胞经尾静脉注射至眶后丛，以及将负载OVAp的GM-CSF诱导的骨髓来源树突状细胞（DC）皮下注射至足垫。CD...

在此，我们介绍一种实验方案 体内 GM-CSF诱导的骨髓来源树突状细胞（DC）对初始CD4 T细胞（T细胞）活化、增殖及Th1分化的检测。此外，本方案还描述了骨髓及T细胞的分离、树突状细胞的生成，以及树突状细胞与T细胞的过继性转移。

一个 在体 内 用于测量骨髓来源树突状细胞诱导的初始CD4 T细胞活化、增殖及Th1分化的 小鼠模型

naïve CD4 T细胞活化、增殖及分化为辅助性T细胞1（Th1）的定量分析是评估其在免疫应答中作用的有效方法...

该方法有助于解答免疫学领域中关于T细胞活化、增殖和Th1分化，以及抗原提呈细胞对适应性免疫的刺激作用等关键问题。该技术的主要优势在于，它能够在允许体外细胞操作的同时，研究体内环境中的免疫反应。本方法的可视化演示至关重要，因为器官和骨组织的分离以及过继性转移步骤仅通过文字说明难以掌握。分离骨髓细胞时，用70%乙醇对成年小鼠的后肢进行消毒，并使用剪刀在后肢侧面做皮肤切口。将剪刀插入腿部内侧，沿剪刀剪开皮肤直至后肢起始处。然后用镊子将皮肤与腿部分离。使用剪刀将肌肉从股骨和胫骨上分离，并用剪刀解离髋关节，折断股骨头。然后在不破坏骨端的情况下将股骨与胫骨分开，将骨骼置于含有完全培养基的培养皿中，并放在冰上。当所有骨骼采集完毕后，用手术刀仔细切除每根骨骼的近端和远端末端，使用配备25号针头的1毫升注射器，以总共10毫升的预热完全RPMI培养基反复冲洗骨骼。当所有骨骼均完成冲洗后，将培养皿中的全部内容转移至一个配有70微米孔径尼龙网滤器的50毫升锥形管中，通过轻柔搅拌和移液小心去除任何碎片和细胞团块。通过离心收集骨髓细胞。用移液器将沉淀重悬于1毫升4摄氏度的红细胞裂解缓冲液中，并将混合物置于冰上孵育5分钟。孵育结束后，加入10 mL PVS终止裂解，并将沉淀重悬于25 mL完全培养基中进行第二次离心。然后将细胞重悬于5 mL新鲜完全培养基中计数，并再次离心细胞。对于次级淋巴组织细胞的分离，从OT-II转基因小鼠中收集腹股沟、腋窝、臂部、颈部及肠系膜淋巴结以及脾脏，并将次级淋巴组织转移至含有10 mL完全RPMI培养基的塑料培养皿中。当所有组织采集完毕后，将淋巴结和脾脏转移至装有70微米细胞筛的50毫升锥形管中，使用注射器活塞匀浆组织。用最多15毫升培养基冲洗细胞筛，并通过离心沉淀细胞。随后根据标准操作流程，利用磁珠分选法分离CD4阳性T细胞。为了在体内激活初始的OT-II CD4阳性T细胞，根据标准方案使用活细胞示踪染料对磁珠分离的T细胞进行标记，并将标记后的细胞重悬于PBS中，浓度为每100微升含10的6次方个细胞。随后通过尾静脉向每只动物过继转移100微升细胞悬液。注射前需预先温育小鼠，以确保尾静脉充分扩张，便于完全注入细胞悬液。24小时后，通过皮下注射，将10的5次方个经LPS成熟的负载OVA肽的树突状细胞注入每只已注射T细胞的动物足垫中。在过继性攻击后的第2天和第5天，按照所示方法，采集受体动物的腘窝淋巴结用于组织处理和T细胞分离。为分析T细胞活化情况，使用针对CD4、CD69和CD25的荧光标记抗体对第2天分离的细胞进行染色，通过流式细胞术确定受体动物CD4阳性细胞群中CD69阳性、CD25阳性T细胞所占的百分比。为了评估T细胞增殖，使用针对CD4的适当荧光标记抗体对第5天分离的细胞进行染色，并通过流式细胞术分析供体CD4阳性T细胞群体中活细胞示踪染料信号的衰减

an-vivo-mouse-model-to-measure-nave-cd4-t-cell-activation

Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

小鼠骨髓基质树突状细胞诱导 CD4 T 细胞活化、增殖和 Th1 分化的体外模型研究

本视频展示了从小鼠骨髓中分化髓系树突状细胞的操作流程。视频中演示了小鼠胫骨和股骨的分离以及骨髓的处理过程。同时展示了细胞在分化前后形态学特征的图片，以及使用CpG诱导成熟后细胞表型和IL-12分泌情况的图示。...

从骨髓前体细胞培养髓系树突状细胞

树突状细胞在次级淋巴器官中进行抗原提呈，对于启动T细胞介导的适应性免疫应答至关重要。本文中，我们展示了小鼠骨髓来源树突状细胞的培养、活化及用于双光子成像的标记方法。...

用于双光子成像的小鼠骨髓来源树突状细胞的制备

小鼠骨髓移植是一种广泛使用的技术，用于研究调控人类移植物抗宿主病的免疫学机制。体内监测T细胞迁移模式的能力，使得能够对移植物抗宿主病过程中T细胞反应的发生与发展进行详细分析。...

移植物抗宿主病的诱导 在体 内 使用MHC匹配的小鼠模型监测T细胞

本视频介绍了一种从小鼠成年小鼠骨髓中生成树突状细胞的实验方案——树突状细胞是激活T细胞的关键抗原呈递细胞。...

骨髓来源树突状细胞的制备：一种从小鼠骨髓生成树突状细胞的方法

单核细胞是先天免疫的关键调节因子，在外周单核吞噬细胞系统的更新以及炎症发生时发挥重要作用。本文描述了对小鼠颅骨骨髓进行实时成像以研究单核细胞动员机制的实验步骤。...

追踪小鼠骨髓单核细胞 体内

初始CD4+ T细胞在激活时会根据所处环境极化为不同的亚群。体外诱导初始CD4+...

小鼠初始型CD4+ T细胞分离与 体外 T细胞亚群的分化

本文描述了实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）模型的诱导与评分方法，以及在疾病不同阶段，通过流式细胞术和定量PCR分别检测淋巴结、脾脏、血液和脊髓中免疫细胞分布和mRNA细胞因子水平的评估方法。...

小鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎的诱导及疾病依赖性免疫细胞在不同组织中分布的评估

本文介绍了一种用于开发和表征耐受性树突状细胞（TolDCs）并评估其免疫治疗效用的实验方案。...

小鼠耐受性树突状细胞的开发与功能表征

移植物抗宿主病是异基因骨髓移植后的主要并发症。树突状细胞在移植物抗宿主病的发病机制中起着关键作用。本文介绍了一种新型骨髓移植平台，用于研究树突状细胞在移植物抗宿主病发生以及移植物抗白血病效应中的作用。...

用于研究树突状细胞在移植物抗宿主病中作用的骨髓移植平台

本文介绍一种经济高效的方法，通过在含10 ng/mL...

从小鼠骨髓分离和培养树突状细胞的经济高效方案

本方案描述了初始CD4+ 将T细胞转化为致病性Th17细胞 体外特别是当与基于多参数流式细胞术的方法相结合时，可从初始CD4细胞中获得纯度达90%的致病性Th17细胞+...

小鼠初始CD4+ T细胞体外分化为致病性Th17细胞

学习利用GM-CSF骨髓来源树突状细胞诱导CD4 T细胞活化、增殖及Th1分化的体内研究方法。该方案结合体外细胞操作与体内免疫反应评估，为适应性免疫研究提供可靠工具。

一个在体内用于测量骨髓来源树突状细胞诱导的初始CD4 T细胞活化、增殖及Th1分化的小鼠模型

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一个 在体 内 用于测量骨髓来源树突状细胞诱导的初始CD4 T细胞活化、增殖及Th1分化的 小鼠模型

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