小鼠骨髓基质树突状细胞诱导 CD4 T 细胞活化、增殖和 Th1 分化的体外模型研究

这种方法可以帮助回答免疫学领域关于 T 细胞活化、增殖和 Th1 分化以及抗原呈递细胞刺激适应性免疫的关键问题。该技术的主要优点是它允许研究体内环境，同时允许在体外进行细胞作。这种方法的视觉演示至关重要，因为仅通过文本说明很难掌握器官和骨骼的分离以及过继转移步骤。

对于骨髓细胞分离，用 70% 乙醇对成年小鼠的后肢进行消毒，并使用剪刀在后肢上做一个横向皮肤切口。将剪刀插入腿部内侧，用剪刀剪开皮肤，直到后肢的起点。然后用镊子将皮肤与腿部分开。

使用剪刀将肌肉与股骨和胫骨分开，并使用剪刀分离髋关节，折断股骨头。然后在不折断骨端的情况下将股骨与胫骨分开，并将骨头放入冰上完全培养基的培养皿中。收获所有骨头后，用手术刀小心地切掉每块骨头的近端和远端，并使用配备有 25 号针头的 1 毫升注射器用总体积为 10 毫的温热完全 RPMI 培养基反复冲洗骨头。

冲洗完所有骨头后，将培养皿中的所有内容物转移到装有 70 微米孔径尼龙网过滤器的 50 毫升锥形管中，然后通过轻轻搅拌和移液小心地去除任何碎屑和细胞团。通过离心收集骨髓细胞。用移液将沉淀重悬于一毫升的 4 摄氏度红细胞裂解缓冲液中，并在冰上孵育混合物 5 分钟。

孵育结束时，用 10 毫升 PVS 停止裂解，并将沉淀重悬于 25 毫升完全培养基中进行第二次离心。然后将细胞重悬于 5 毫升新鲜完全培养基中进行计数，并再次离心细胞。对于次级淋巴组织细胞分离，收集 OT-II 转基因小鼠的腹股沟、腋窝、臂、宫颈和中淋巴结和脾脏，并将次级淋巴组织转移到含有 10 毫单位完全 RPMI 培养基的塑料培养皿中。

收获所有组织后，将淋巴结和脾脏转移到 50 毫升锥形管中的 70 微米细胞过滤器中，并使用注射器柱塞使组织匀浆。用最多 15 毫单位的培养基冲洗过滤器，然后离心使细胞离心。然后根据标准方案，通过磁珠分选分离 CD4 阳性 T 细胞。

对于初始 OT-II CD4 阳性 T 细胞的体内活化，根据标准方案，用活细胞示踪染料标记磁珠分离的 T 细胞，并以每 100 微升 PBS 浓度 10 至 6 个细胞重悬标记的细胞。然后通过尾静脉过继转移每只动物 100 μL 细胞。注射前预热小鼠，以确保尾静脉充分扩张以允许输送整个细胞体积。

24 小时后，通过皮下注射到每个 T 细胞注射动物的脚垫中，将 10 个到第五个 LPS 成熟的 OVA 肽负载树突状细胞。如图所示，在收养激发后 2 天和 5 天，从受体动物身上收获瘟立淋巴结用于组织处理和 T 细胞分离。为了分析 T 细胞活化，用针对 CD4、CD69 和 CD25 的荧光抗体对第二天分离的细胞进行染色，以通过流式细胞术确定受体 CD4 阳性群体中 CD64 阳性、CD25 阳性 T 细胞的百分比。

为了评估 T 细胞增殖，用适当的抗 CD4 荧光抗体对第 5 天分离的细胞进行染色，并通过流式细胞术分析供体 CD4 阳性 T 细胞群中重要细胞示踪染料信号的衰减。为了评估 Th1 分化，在 96 孔板中，在 200 微升完全培养基中，每 10 天到 5 天接种 5 个分离的 T 细胞，每孔 5 个分离的 T 细胞。然后将板置于 37 摄氏度的细胞培养箱中 6 小时，向每个孔中加入布雷菲德菌素 A 以阻断刺激的最后 4 小时内细胞因子分泌。

孵育结束时，离心板，快速倒置弃去上清液。用抗 CD4 抗体对细胞进行染色，然后在室温下用 100 μL 2% 多聚甲醛和 1% 蔗糖固定 20 分钟。在 4 摄氏度下用 50 μL 透化缓冲液透化细胞 30 分钟，然后用每孔 150 μL PBS 离心洗涤。

接下来，根据标准方案，在室温下对感兴趣的细胞内细胞因子进行 30 分钟染色，然后每孔用 150 μL 补充有 1% 皂苷的 PBS 离心洗涤两次。然后，通过流式细胞术分析细胞。LPS 刺激后 GM-CSF 骨髓来源的树突状细胞的流式细胞术分析显示，成熟标志物（如 MHCII、CD80 和 CD86）上调。

幼稚 CD4 阳性 OT-II T 细胞在过继转移到受体动物后通过上调 T 细胞活化标志物、表面表达和多轮细胞分裂而被激活。激活后，增殖的 CD 阳性 OT-II T 细胞表现出 Th1 表型，如其细胞内干扰素 γ 表达所示。一旦掌握，如果执行得当，这项技术可以在 8 小时内完成。

在尝试此程序时，请务必记住在实验前一天准备好所有试剂和材料。开发后，这项技术为免疫学研究人员研究小鼠的树突状细胞和 T 细胞铺平了道路。看完这个视频，你应该对如何从小鼠的股骨和胫骨中分离骨髓，以及如何将 T 细胞和树突状细胞转移到受体动物有一个很好的了解。

不要忘记，使用针头、手术刀或剪刀等锋利的工具可能非常危险，因此在执行这些程序时应始终采取预防措施，例如使用适当的手指保护装置。