Name: 高效液相色谱法测定犬尿氨和 Kynurenic 酸: 对大鼠认知和睡眠的相关生物化学研究 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 4 s
Description: 学习使用高效液相色谱法测定大鼠血浆和脑组织中的犬尿氨酸和Kynurenic酸水平。该方法结合生化与行为学手段，为研究犬尿氨酸代谢通路在精神疾病中的作用提供可靠数据。

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本研究部分由美国国立卫生研究院（R01 NS102209）和克莱尔·E·福布斯信托基金的捐赠资助。

我们的实验方案已获得马里兰大学机构动物照护与使用委员会的批准，并遵循美国国立卫生研究院《实验动物照护与使用指南》。
注意：所有实验均使用成年雄性Wistar大鼠（250–350 g）。生化分析、行为学实验和睡眠-觉醒记录分别使用不同的动物群组。动物饲养于马里兰精神病学研究中心的温度受控设施中，维持12/12小时明暗循环，光照开启时间为昼夜节律时间（ZT）0，关闭时间为ZT 12。实验期间，动物可自由获取食物和饮水。该设施已获得美国实验动物护理认证协会的全面认证。
1. 大鼠腹腔注射犬尿氨酸
注意：在本实验方案中，犬尿氨酸在 ZT 0（光相开始时）给予，组织在 ZT 2 和 ZT 4 采集，以确定犬尿氨酸代谢的时间进程。注射生理盐水的动物作为对照。例如，若一只大鼠体重为 500 g，目标剂量为 100 mg/kg，则应给予该大鼠 5 mL 浓度为 10 mg/mL 的犬尿氨酸溶液注射。
<ol>
	<li>称取L-犬尿氨酸硫酸盐（“犬尿氨酸”），放入20 mL玻璃小瓶中。务必始终将犬尿氨酸置于冰上保存。</li>
	<li>加入生理盐水以达到所需浓度，并使用1 N氢氧化钠（NaOH）将pH值调节至7.6。涡旋并超声处理溶液，直至犬尿氨酸完全溶解。 
	注意：操作NaOH时，请遵循所有推荐的安全防护措施。
	<ol>
		<li>例如，配制10 mg/mL溶液时，称取200 mg犬尿氨酸置于玻璃小瓶中，加入15 mL生理盐水，涡旋并超声处理（20 kHz，5–10 s，1/8英寸直径微探头）以促进溶解。使用NaOH调节溶液pH值。最后，用生理盐水定容至20 mL。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>称量每只实验大鼠的体重，根据动物体重和预期给药剂量计算每次注射的体积。小心将动物从饲养笼中取出，进行腹腔注射，然后将动物放回笼中。</li>
</ol>
2. 使用高效液相色谱法测定犬尿氨酸
<ol>
	<li>组织采集 
	注意：在本实验方案中，于ZT 0（光照期开始时）给予犬尿氨酸，分别在ZT 2和ZT 4采集组织，以确定犬尿氨酸代谢的时间进程。以注射生理盐水的动物作为对照。
	<ol>
		<li>使用二氧化碳对动物实施安乐死。在呼吸停止迹象持续1分钟后，通过断头法实施二次安乐死。</li>
		<li>为采集整段躯干血液，将一次性漏斗插入含有20 μL K3-EDTA（0.5 M）。让血液从体内流入试管中。反复倒置试管，确保EDTA充分混匀。</li>
		<li>使用剪刀沿头部正中线剪开顶部皮肤以暴露颅骨。清除颅骨后部多余的颈部肌肉，并在脊髓开口处从后向前剪开颅骨。
		<ol>
			<li>轻轻拉开颅骨两侧以暴露大脑，然后用镊子小心取出脑组织，避免损伤。用剃刀切除嗅球，并沿中线将脑组织切成两半。使用镊子将半侧脑组织分离成目标区域（即海马体和大脑皮层）</li>
		</ol>
		</li>
		<li>将所有解剖得到的脑组织置于干冰上的铝箔中。待组织完全冻结后，转移至一个20 mL塑料瓶中，并在-80 °C下保存。</li>
		<li>将整段躯干血液在300 x g 10分钟。移除上清液（血浆），转移至新的离心管中，然后于-80 °C保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>样品制备
	<ol>
		<li>血浆：从经处理的动物中采集
		<ol>
			<li>将含有血浆的冷冻管置于湿冰上解冻（组织采集步骤见2.1）。</li>
			<li>在新的离心管中，用超纯水稀释样品（犬尿素为1:2，KYNA为1:10）。向100 μL稀释后的样品中加入25 μL 6%高氯酸。 
			警告：操作高氯酸时，请遵循所有推荐的预防措施。</li>
			<li>涡旋混匀所有样品，然后在12,000 x g 孵育10分钟。结束后，从每管中吸取100 μL上清液，转移至0.25 mL微量离心管中，用于犬尿氨酸（kynurenine）或犬尿喹啉酸（KYNA）的测定。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>脑：从经处理的动物中采集
		<ol>
			<li>将装有冷冻脑组织样本的离心管（组织采集步骤见2.1）置于干冰上。使用精密分析天平对每个脑样本进行单独称重，随后将其放回离心管中，并重新置于干冰上。</li>
			<li>所有样品称重后，将离心管置于湿冰上。用超纯水按1:10（w/v）稀释各样品，并使用超声波破碎仪（20 kHz，5–10 s，1/8英寸直径微尖探头）进行匀浆。例如，对于100 mg脑组织，加入900 μL超纯水。</li>
			<li>将每种稀释后的样品各取 100 μL 加入新离心管中，并加入 25 μL 25% 高氯酸进行酸化。涡旋混匀后，以 12,000 x g 10 分钟</li>
			<li>离心后，移取100 μL上清液，转移至0.25 mL微量离心管中，用于KYNA测定。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>高效液相色谱仪的设置与运行
	<ol>
		<li>配制50 mM乙酸钠流动相。将6.81 g三水合乙酸钠溶于1 L超纯水中，用冰乙酸调节pH至6.2，然后经真空过滤转移至洁净玻璃器皿中。将乙酸钠流动相转移至洁净的1 L玻璃瓶中。</li>
		<li>配制500 mM乙酸锌溶液。将54.88 g乙酸锌溶于500 mL超纯水中，然后进行真空过滤。转移至洁净的500 mL玻璃瓶中。取1 L瓶装入超纯水，另取500 mL瓶装入HPLC级乙腈。</li>
		<li>将高效液相色谱仪的进样管分别置于流动相、超纯水和100%乙腈中。通过蠕动泵将乙酸锌溶液单独泵入，在色谱柱后与流动相混合，并在衍生化反应前加入。</li>
		<li>使用仪器上的控制面板，设置程序以每分钟0.5 mL的流速运行5%乙腈和95%超纯水。运行20–30分钟，直至压力和基线稳定。</li>
		<li>在建立稳定基线后，将溶液组成更换为5%乙腈和95%乙酸钠流动相，平衡30分钟。</li>
		<li>打开荧光检测器的光源并预热。</li>
		<li>同时，打开柱后泵，调节流速至0.1 mL/min。运行约20分钟后，待系统压力稳定在约500 psi。</li>
		<li>制备标准品。
		<ol>
			<li>对于KYNA，首先使用1 mM的储备液，稀释制备5个标准浓度（即10 nM、5 nM、2.5 nM、1 nM 和 500 pM 
			注：这将生成一条标准曲线，范围为每次进样 20 μL 含 200 fmoles 至 10 fmoles。</li>
			<li>对于犬尿氨酸，首先配制1 mM的储备液，然后稀释以制备5个标准浓度即10 μM、5 μM、2.5 μM、1 μM 和 500 nM 
			注意：这将生成一条标准曲线，范围为每次20 μL进样10 pmol至200 pmol。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>设置高效液相色谱系统软件，以控制样品序列参数，并实现多个样品的自动进样。
		<ol>
			<li>当处于 &#34;运行样品&#34; 筛选，点击 &#34;文件&#34; 并向下拖动至 &#34;创建新样本集&#34;新窗口打开后，选择 &#34;空&#34;逐一列出所有标准品（参见步骤2.3.8）或样品的运行顺序。</li>
			<li>在 &#34;功能&#34; 柱，指定标准品和样品。标准品应在序列开始和结束时进行检测。每检测5个样品后注入一次水。</li>
			<li>将每个样品的运行时间设置为15分钟。从标准品和血浆样品中进样20 μL，或从脑匀浆样品中进样30 μL。</li>
			<li>设置激发波长和发射波长（根据所检测化合物而定）：犬尿素（kynurenine）为激发波长365 nm、发射波长480 nm，保留时间约6 min；犬尿喹啉酸（KYNA）为激发波长344 nm、发射波长398 nm，保留时间约11 min。</li>
			<li>所有参数设置完毕且仪器达到平衡后，运行程序序列。</li>
			<li>为了量化数据，导航至 &#34;浏览项目&#34; 屏幕。在 &#34;样本集&#34; 点击标签，双击待定量的样品集。在所有进样的列表中，选中所有标准品并右键单击。在新窗口中选择 &#34;过程&#34;，然后使用下拉菜单选择 &#34;校准与定量&#34; 旁边 &#34;如何&#34;:.</li>
			<li>再次选中所有标准，右键单击并选择 &#34;综述&#34;色谱图打开后，使用顶部的按钮来 &#34;整合&#34; 然后 &#34;校准&#34; 每个标准品；这将自动生成标准曲线。</li>
			<li>返回到 &#34;样本集&#34; 点击样品集并双击。接着，选中所有标准品。重复上述步骤，但此次选择 &#34;定量&#34; 从下拉菜单中。再次选中所有样本，然后单击右键并选择 &#34;综述&#34;色谱图打开后，使用顶部的按钮来 &#34;整合&#34; 然后 &#34;定量&#34; 每个样品 
			注意：这将根据先前创建的标准曲线输出每个样本的浓度。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 被动回避范式
注意：这些行为学实验的设计基于我们关于急性犬尿氨酸处理的生物化学研究结果。为了最大程度地提高脑内KYNA水平，在被动回避实验范式中，于ZT 0时给予犬尿氨酸（100 mg/kg），即在ZT 2时进行的海马依赖性学习训练前2小时给药。实验装置由两个大小相同的隔间（高21.3 cm，宽20.3 cm，深15.9 cm）组成，两个隔间之间由一个滑门隔开，并整体置于一个隔音箱内。测试装置的两个隔间分别称为“明室”和“暗室”。明室的壁面为透明材质，在实验过程中会开启光源以进一步照亮该隔间；暗室的壁面则完全遮蔽，以维持黑暗环境。
<ol>
	<li>第1天：训练试验
	<ol>
		<li>测试前，用70%乙醇清洁仪器。</li>
		<li>将动物带入测试室。</li>
		<li>将实验动物轻轻放入仪器的明亮侧，关闭并扣紧仪器门和隔音箱。</li>
		<li>使用配套软件开始试验。从主界面开始，从下拉菜单中选择 &#34;文件&#34;，然后选择 &#34;打开会话&#34;。在新窗口中，确保已选择正确的程序和仪器，然后点击 &#34;关闭&#34;。接下来，选择 &#34;配置&#34;，然后选择 &#34;信号&#34;。在新窗口中选择正确的仪器，然后点击 &#34;发送&#34;。 
		注：软件将启动仪器明亮侧的灯光，并打开两个隔室之间的闸门。计时器将开始计时。</li>
		<li>当动物完全进入仪器的黑暗侧时，闸门将关闭，并给予一次不可逃避的足底电击（0.56 mA，持续1 s）。</li>
		<li>记录动物进入黑暗隔室前所经过的时间。</li>
		<li>动物接受电击后，让其在仪器中恢复30秒，然后再将其移出。</li>
		<li>将动物放回其原居住笼具中。</li>
		<li>在开始下一只动物的试验前，用湿毛巾彻底擦拭仪器，并清除所有粪便颗粒。</li>
		<li>所有动物完成训练后，将其送回动物饲养设施。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>第2天：测试试验
	<ol>
		<li>在训练试验24小时后，将动物重新带回测试室。将第一只动物放入仪器的明亮侧，关闭并扣紧门和隔音箱，开始测试试验。</li>
		<li>使用与前一天相同的软件指令启动测试试验；仪器明亮侧的灯光将亮起，两个隔室之间的闸门将打开。计时器将开始计时。</li>
		<li>当动物进入黑暗隔室时，闸门将关闭。记录所经过的时间。 
		注：如果动物停留在测试仪器的明亮侧，则软件将在最长300秒后终止试验。</li>
		<li>将动物放回其原居住笼具中，并在开始下一只动物的试验前，按步骤3.1.9所述方法清洁仪器。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 睡眠分析
<ol>
	<li>无线EEG/EMG发射器的手术植入 
	注意：遥测发射器应在手术前进行灭菌和准备。
	<ol>
		<li>使用剃刀刀片轻轻去除塑料涂层的一小段长度，以露出导线引线。将发射器放入装有消毒液的50 mL锥形管中 [例如，Wavecide（2.65%戊二醛）]。
		<ol>
			<li>将发射器在消毒液中浸泡至少12小时。然后在手术前将溶液转移至废液容器中，并用无菌生理盐水冲洗发射器。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>手术当天，在将动物放入麻醉室之前先称重。使用100% O2诱导3–5%异氟烷麻醉。</li>
		<li>成功麻醉后，取出动物，使用电动剃刀小心剃除头部顶部、颈部以及身体背部靠近肋骨下方略偏左侧的一小块毛发。</li>
		<li>皮下注射卡洛芬（5 mg/kg）以提供术后镇痛。</li>
		<li>在动物身下放置设定为37 °C的温控水循环加热垫，以维持手术期间的体温。</li>
		<li>将动物固定于立体定位仪中，通过鼻罩维持麻醉状态，并安装耳杆以稳定头部。交替使用聚维酮碘擦洗液和70%乙醇擦拭剃毛区域进行皮肤消毒。在眼睛上涂抹眼用软膏以润滑角膜。</li>
		<li>在首次切口前，使用脚趾夹捏测试确认麻醉深度是否充分。</li>
		<li>使用无菌手术刀从眼睛后方开始向下沿颈部背侧做一切口，暴露颅骨和颈背部肌肉。</li>
		<li>如有必要暴露颅骨，可用棉签去除任何膜状组织。可使用微型止血钳将皮肤从颅骨上拉开。定位并标记前囟位置。钻两个骨孔，并在相对于前囟2.0 mm前方/+1.5 mm侧方和7.0 mm后方/-1.5 mm侧方的位置植入金属螺钉。旋转2圈以拧紧螺钉。用一块纱布覆盖暴露的颅骨。</li>
		<li>使用无菌手术剪在肋骨下方的体腔处做一切口。</li>
		<li>在手术记录单上务必记录待植入发射器的序列号。</li>
		<li>将无菌发射器插入体腔内，导线引线应仍留在体外。</li>
		<li>使用可吸收缝线缝合肌层，确保所有引线集中于切口的一端。</li>
		<li>从头部移除纱布，并将切口下方的皮肤轻轻提起。将一对长柄无菌止血钳从头部切口经皮下穿至体侧切口。操作时保持对皮肤的压力，以尽量减少损伤。
		<ol>
			<li>当止血钳接近体侧切口时，用手术剪剪开可能覆盖其上的膜组织，并用止血钳夹住四根发射器引线。缓慢拉出止血钳，使导线沿皮下走行至颅骨部位。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>确定哪两根引线将连接至颅骨。用镊子一手夹住导线末端，另一手夹住塑料护套末端稍下方位置，拉伸导线直至可分辨出单个线圈。</li>
		<li>将暴露的导线紧密缠绕在其中一个金属螺钉上3–4圈。固定后拧紧螺钉以防导线松脱，并剪除多余导线。对第二根引线和螺钉重复此操作。</li>
		<li>将两根EEG引线从体腔中拉出，使其紧贴颅骨。</li>
		<li>使用牙科水泥覆盖螺钉和皮层引线，在暴露的颅骨上形成一个保护帽。确保牙科水泥不接触皮肤或肌肉，且不产生锐利边缘。让牙科水泥自然干燥。 
		注意：保护帽应足够小，以便皮肤能够缝合覆盖其上。</li>
		<li>对于EMG引线，按照步骤4.1.15所述方法夹住导线末端和塑料护套。拉伸导线直至单个线圈清晰可见。</li>
		<li>在右侧颈部肌肉下方穿入22 G针头，深入2–3 mm后使其穿出。使用不可吸收缝线在嵌入的针头上打一个单结，保持松散状态。</li>
		<li>将EMG导线穿入针头内，然后将针头拉出，使EMG导线埋入肌肉下方。拉紧缝线以固定导线位置，并剪除从肌肉中穿出的多余导线。</li>
		<li>在第一根EMG引线下方约1 mm处，重复步骤4.1.20和4.1.21，处理第二根EMG引线。</li>
		<li>将两根EMG引线从体腔中拉出，使其紧贴肌肉。</li>
		<li>使用不可吸收缝线缝合头部和颈部切口。将所有多余导线埋入皮下，并使用伤口夹闭合体腔切口。</li>
		<li>在两个切口部位涂抹利多卡因软膏，以帮助动物缓解术后疼痛。</li>
		<li>将动物放回其饲养笼中，并将笼子置于加热垫上，直至动物从麻醉中完全恢复。 
		注意：动物应在开始记录前恢复7–10天。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>EEG/EMG记录 
	注意：在本方案中，我们在ZT 0时间点给予生理盐水或犬尿氨酸，随后连续记录动物24小时的睡眠-觉醒模式。
	<ol>
		<li>所有睡眠记录应在专用房间内完成，确保记录期间动物不受干扰。</li>
		<li>将带有植入式EEG/EMG发射器的动物饲养笼放置在接收器单元上。使用磁铁开启手术植入的发射器。 
		注意：发射器激活时，接收器单元上应出现指示灯。</li>
		<li>使用配套软件设置EEG/EMG数据的记录。
		<ol>
			<li>从下拉菜单中选择 &#34;Experiment&#34;，然后选择 &#34;Create&#34;。命名实验并保存。接着选择 &#34;Hardware&#34;，然后选择 &#34;Edit MX2 Configuration&#34;。</li>
			<li>在新窗口中，选择实验中使用的所有发射器，并标明每个发射器所对应的接收垫。准备就绪后，点击 &#34;Start All Continuous&#34; 开始记录。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>实验结束后，在配套软件中选择 &#34;Stop All Continuous&#34;，并使用磁铁关闭发射器。</li>
		<li>通过CO2窒息法处死动物，随后进行心脏穿刺。使用手术剪沿头部顶部重新打开切口，剪断导线与牙科水泥及颈部肌肉的连接，小心取出发射器。</li>
		<li>接着打开体腔，找到发射器并缓慢将其从体内取出。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>EEG/EMG分析
	<ol>
		<li>使用配套软件分析睡眠-觉醒数据。打开程序并选择 &#34;Add New Location&#34;。在新窗口中选择数据以导入评分软件。 
		注意：这将在软件中创建一个新文件，包含实验期间采集的所有原始波形数据。</li>
		<li>对手动评分目标实验的警觉状态。评分完成后，分析各警觉状态（快速眼动睡眠[REM]、非快速眼动睡眠[NREM]和清醒状态）的总持续时间、发作次数及平均发作持续时间等参数。 
		注意：分析可覆盖整个记录时段，也可缩短至特定兴趣时间点。此处分析的是ZT 0至ZT 2期间的记录数据。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Leklem, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+aspects+of+tryptophan+metabolism+in+humans+and+other+species%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Clinical+Nutrition%22%5BJournal%5D)">Quantitative aspects of tryptophan metabolism in humans and other species: a review.</a> The American Journal of Clinical Nutrition. 24 (6), 659-672 (1971).</li>
<li>Pocivavsek, A., Notarangelo, F. M., Wu, H. Q., Bruno, J. P., Schwarcz, R. Astrocytes as Pharmacological Targets in the Treatment of Schizophrenia: Focus on Kynurenic Acid. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/B9780128009819000250">Modeling the Psychophathological Dimensions of Schizophrenia - From Molecules to Behavior</a>. Pletnikov, M. V., Waddington, J. L. , Elsevier, Academic Press. London, San Diego, Waltham, Oxford. 423-443 (2016).</li>
<li>Hilmas, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+brain+metabolite+kynurenic+acid+inhibits+alpha7+nicotinic+receptor+activity+and+increases+non-alpha7+nicotinic+receptor+expression%3A+physiopathological+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The brain metabolite kynurenic acid inhibits alpha7 nicotinic receptor activity and increases non-alpha7 nicotinic receptor expression: physiopathological implications.</a> Journal of Neuroscience. 21 (19), 7463-7473 (2001).</li>
<li>Perkins, M. N., Stone, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+iontophoretic+investigation+of+the+actions+of+convulsant+kynurenines+and+their+interaction+with+the+endogenous+excitant+quinolinic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">An iontophoretic investigation of the actions of convulsant kynurenines and their interaction with the endogenous excitant quinolinic acid.</a> Brain Research. 247 (1), 184-187 (1982).</li>
<li>DiNatale, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kynurenic+acid+is+a+potent+endogenous+aryl+hydrocarbon+receptor+ligand+that+synergistically+induces+interleukin-6+in+the+presence+of+inflammatory+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Kynurenic acid is a potent endogenous aryl hydrocarbon receptor ligand that synergistically induces interleukin-6 in the presence of inflammatory signaling.</a> Toxicological Sciences. 115 (1), 89-97 (2010).</li>
<li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kynurenic+acid+as+a+ligand+for+orphan+G+protein-coupled+receptor+GPR35%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Kynurenic acid as a ligand for orphan G protein-coupled receptor GPR35.</a> The Journal of Biological Chemistry. 281 (31), 22021-22028 (2006).</li>
<li>Alexander, K. S., Wu, H. Q., Schwarcz, R., Bruno, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+elevations+of+brain+kynurenic+acid+impair+cognitive+flexibility%3A+normalization+by+the+alpha7+positive+modulator+galantamine%5BTitle%5D)+AND+%22Psychopharmacology+%28Berlin%29%22%5BJournal%5D)">Acute elevations of brain kynurenic acid impair cognitive flexibility: normalization by the alpha7 positive modulator galantamine.</a> Psychopharmacology (Berlin). 220 (3), 627-637 (2012).</li>
<li>Chess, A. C., Landers, A. M., Bucci, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((L-kynurenine+treatment+alters+contextual+fear+conditioning+and+context+discrimination+but+not+cue-specific+fear+conditioning%5BTitle%5D)+AND+%22Behavioural+Brain+Research%22%5BJournal%5D)">L-kynurenine treatment alters contextual fear conditioning and context discrimination but not cue-specific fear conditioning.</a> Behavioural Brain Research. 201 (2), 325-331 (2009).</li>
<li>Chess, A. C., Simoni, M. K., Alling, T. E., Bucci, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elevations+of+endogenous+kynurenic+acid+produce+spatial+working+memory+deficits%5BTitle%5D)+AND+%22Schizophrenia+Bulletin%22%5BJournal%5D)">Elevations of endogenous kynurenic acid produce spatial working memory deficits.</a> Schizophrenia Bulletin. 33 (3), 797-804 (2007).</li>
<li>Pocivavsek, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluctuations+in+endogenous+kynurenic+acid+control+hippocampal+glutamate+and+memory%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropsychopharmacology%22%5BJournal%5D)">Fluctuations in endogenous kynurenic acid control hippocampal glutamate and memory.</a> Neuropsychopharmacology. 36 (11), 2357-2367 (2011).</li>
<li>Pocivavsek, A., Baratta, A. M., Mong, J. A., Viechweg, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+Kynurenine+Challenge+Disrupts+Sleep-Wake+Architecture+and+Impairs+Contextual+Memory+in+Adult+Rats%5BTitle%5D)+AND+%22Sleep%22%5BJournal%5D)">Acute Kynurenine Challenge Disrupts Sleep-Wake Architecture and Impairs Contextual Memory in Adult Rats.</a> Sleep. 40 (11), (2017).</li>
<li>Halassa, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytic+modulation+of+sleep+homeostasis+and+cognitive+consequences+of+sleep+loss%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Astrocytic modulation of sleep homeostasis and cognitive consequences of sleep loss.</a> Neuron. 61 (2), 213-219 (2009).</li>
<li>Erhardt, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kynurenic+acid+levels+are+elevated+in+the+cerebrospinal+fluid+of+patients+with+schizophrenia%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Letters%22%5BJournal%5D)">Kynurenic acid levels are elevated in the cerebrospinal fluid of patients with schizophrenia.</a> Neuroscience Letters. 313 (1-2), 96-98 (2001).</li>
<li>Linderholm, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+levels+of+kynurenine+and+kynurenic+acid+in+the+CSF+of+patients+with+schizophrenia%5BTitle%5D)+AND+%22Schizophrenia+Bulletin%22%5BJournal%5D)">Increased levels of kynurenine and kynurenic acid in the CSF of patients with schizophrenia.</a> Schizophrenia Bulletin. 38 (3), 426-432 (2012).</li>
<li>Sathyasaikumar, K. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+kynurenine+pathway+metabolism+in+the+prefrontal+cortex+of+individuals+with+schizophrenia%5BTitle%5D)+AND+%22Schizophrenia+Bulletin%22%5BJournal%5D)">Impaired kynurenine pathway metabolism in the prefrontal cortex of individuals with schizophrenia.</a> Schizophrenia Bulletin. 37 (6), 1147-1156 (2011).</li>
<li>Schwarcz, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+cortical+kynurenate+content+in+schizophrenia%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Increased cortical kynurenate content in schizophrenia.</a> Biological Psychiatry. 50 (7), 521-530 (2001).</li>
<li>Pocivavsek, A., Rowland, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+Neuroscience+Illuminates+Causal+Relationship+Between+Sleep+and+Memory%3A+Translating+to+Schizophrenia%5BTitle%5D)+AND+%22Schizophrenia+Bulletin%22%5BJournal%5D)">Basic Neuroscience Illuminates Causal Relationship Between Sleep and Memory: Translating to Schizophrenia.</a> Schizophrenia Bulletin. 44 (1), 7-14 (2018).</li>
<li>Shibata, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorimetric+micro-determination+of+kynurenic+acid%2C+an+endogenous+blocker+of+neurotoxicity%2C+by+high-performance+liquid+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chromatography%22%5BJournal%5D)">Fluorimetric micro-determination of kynurenic acid, an endogenous blocker of neurotoxicity, by high-performance liquid chromatography.</a> Journal of Chromatography. 430 (2), 376-380 (1988).</li>
<li>Buzsaki, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Memory+consolidation+during+sleep%3A+a+neurophysiological+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Sleep+Research%22%5BJournal%5D)">Memory consolidation during sleep: a neurophysiological perspective.</a> Journal of Sleep Research. 7, 17-23 (1998).</li>
<li>Graves, L. A., Heller, E. A., Pack, A. I., Abel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sleep+deprivation+selectively+impairs+memory+consolidation+for+contextual+fear+conditioning%5BTitle%5D)+AND+%22Learning+%26+Memory%22%5BJournal%5D)">Sleep deprivation selectively impairs memory consolidation for contextual fear conditioning.</a> Learning & Memory. 10 (3), 168-176 (2003).</li>
<li>Yamashita, M., Yamamoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tryptophan+circuit+in+fatigue%3A+From+blood+to+brain+and+cognition%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Tryptophan circuit in fatigue: From blood to brain and cognition.</a> Brain Research. 1675, 116-126 (2017).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

为了在外周给予犬尿氨酸后对脑内KYNA进行可靠评估，关键在于结合并解读生化与功能实验结果。本文提供了一套详细方案，可帮助新用户建立有效的方法，用于测定大鼠血浆中的犬尿氨酸及脑组织中的KYNA。血浆中犬尿氨酸的测定可验证给药的准确性，而代谢产物KYNA的测定则可确认 从头合成 脑内合成。该方法改编自Shibata的荧光检测HPLC法具有若干优势18，以在 Zn 存在下对 KYNA 进行衍生化2+，包括能够精确定量脑内纳摩尔浓度范围内的内源性KYNA。此外，通过调整荧光检测的激发和发射波长（如本方案所述），该方法已适用于检测血浆中微摩尔浓度范围内的生物前体犬尿氨酸。
方案中的关键步骤，例如给药与安乐死之间的特定时间间隔，均被详细描述，以准确确定脑内KYNA形成的时程，并指导行为学及睡眠-觉醒监测实验的设计与分析。采用被动回避范式评估海马依赖性学习能力，并通过脑电图（EEG）和肌电图（EMG）的遥测记录进行睡眠-觉醒分析。由于我们确定脑内KYNA水平在注射后2小时达到最高，因此相应地安排了行为学范式的...

犬尿氨酸通路（KP）负责降解近95%的必需氨基酸色氨酸1。在哺乳动物大脑中，星形胶质细胞摄取犬尿氨酸后，主要通过犬尿氨酸氨基转移酶（KAT）II将其代谢为具有神经活性的小分子KYNA2。KYNA在脑内作为NMDA受体和α7nACh受体的拮抗剂2,3,4，同时也作用于信号传导相关受体，包括芳香烃受体（AHR）和G蛋白偶联受体35（GPR35）5,6。在实验动物中，脑内KYNA水平升高已被证明会损害其在多种行为学检测中的认知表现2,7,8,9,10。一个新兴假说认为，KYNA通过影响睡眠-觉醒行为在调节认知功能中发挥关键作用11，从而进一步支持了星形胶质细胞来源的分子在调节睡眠与认知神经生物学中的重要作用12。
临床上，在精神分裂症患者的脑脊液和死后脑组织中均发现KYNA水平升高13,14,15,16，精神分裂症是一种以认知功能障碍为特征的严重精神疾病。精神分裂症患者还常伴有睡眠障碍，这可能会加重病情17。深入了解犬尿氨酸通路（KP）代谢及KYNA在调节睡眠与认知（特别是学习与记忆之间）关系中的作用，可能有助于开发针对精神分裂症及其他精神疾病不良预后的新型治疗方法。
一种可靠且一致的犬尿氨酸通路（KP）代谢物检测方法对于整合来自不同研究机构的研究成果、推动KP生物学的科学认知至关重要。本文介绍了通过高效液相色谱法（HPLC）测定大鼠血浆中犬尿氨酸（kynurenine）以及大鼠脑组织中犬尿酸（KYNA）的方法。本方案采用在Zn2+存在下的荧光检测技术，最初由Shibata18建立，近期进一步改进并优化了衍生化条件，采用500 mM乙酸锌作为柱后反应试剂，从而实现对脑组织中内源性纳摩尔浓度水平KYNA的检测11。
为了刺激 从头合成 根据本实验方案所述，通过腹腔注射（i.p.）向大鼠给予内源性KYNA的直接生物前体——犬尿氨酸。结合生化检测以确定KYNA生成程度，同时考察犬尿氨酸负荷对海马依赖性记忆（被动回避范式）以及睡眠-觉醒结构（脑电图和肌电图信号）的影响。11这些技术的结合可用于研究犬尿氨酸刺激对生化和功能的影响 体内 在大鼠中。

<table><tbody><tr><td>Wistar 大鼠</td><td>Charles River Laboratories</td><td></td><td>成年雄性，250–350 g</td></tr><tr><td>L-犬尿氨酸硫酸盐</td><td>Sai Advantium</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ReproSil-Pur C18 色谱柱（4 mm × 150 mm）</td><td>Dr. Maisch GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EZ 夹具</td><td>Stoelting Co.</td><td>59022</td><td></td></tr><tr><td>固定材料螺丝</td><td>PlasticsOne</td><td>00-96 X 1/16</td><td></td></tr><tr><td>不可吸收缝合线</td><td>MedRep Express</td><td>699B</td><td>CP Medical Monomid 黑色尼龙缝合线，4-0，P-3，18&quot;，每盒12根</td></tr><tr><td>可吸收缝合线</td><td>Ethicon</td><td>J310H</td><td>4-0 涂层薇乔紫线 1×27'' SH-1</td></tr><tr><td>牙科水泥</td><td>Stoelting Co.</td><td>51458</td><td></td></tr><tr><td>钻头</td><td>Stoelting Co.</td><td>514551</td><td>0.45 mm</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;目录编号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;备注&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Alliance HPLC 系统&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>E2695 分离模块</td><td>Waters</td><td>176269503</td><td></td></tr><tr><td>2475 荧光检测器</td><td>Waters</td><td>186247500</td><td></td></tr><tr><td>柱后试剂管理器</td><td>Waters</td><td>725000556</td><td></td></tr><tr><td>联想计算机</td><td>Waters</td><td>668000249</td><td></td></tr><tr><td>Empower 软件</td><td>Waters</td><td>176706100</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;目录编号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;备注&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;大鼠被动回避箱&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>超高度中密度纤维板隔音箱</td><td>MedAssociates</td><td>ENV-018MD</td><td>内部尺寸：22&quot;（宽）× 22&quot;（高）× 16&quot;（深）</td></tr><tr><td>中央通道调制穿梭箱腔室</td><td>MedAssociates</td><td>ENV-010MC</td><td></td></tr><tr><td>大鼠用不锈钢栅格地板</td><td>MedAssociates</td><td>ENV-010MB-GF</td><td></td></tr><tr><td>自动闸门</td><td>MedAssociates</td><td>ENV-010B-S</td><td></td></tr><tr><td>大鼠用快速断开穿梭栅格地板连接装置</td><td>MedAssociates</td><td>ENV-010MB-QD</td><td></td></tr><tr><td>刺激光源，1&quot; 白色透镜，安装于模块化面板</td><td>MedAssociates</td><td>ENV-221M</td><td></td></tr><tr><td>带音量控制的大鼠腔室蜂鸣器模块</td><td>MedAssociates</td><td>ENV-223AM</td><td></td></tr><tr><td>SmartCtrl 8 输入/16 输出套件</td><td>MedAssociates</td><td>DIG-716P2</td><td></td></tr><tr><td>用于穿梭箱的 8 通道红外控制</td><td>MedAssociates</td><td>ENV-253C</td><td></td></tr><tr><td>红外光源与探测器阵列条</td><td>MedAssociates</td><td>ENV-256</td><td></td></tr><tr><td>台式接口机柜，120 V 60 Hz</td><td>MedAssociates</td><td>SG-6080C</td><td></td></tr><tr><td>双范围恒流厌恶刺激模块</td><td>MedAssociates</td><td>ENV-410B</td><td></td></tr><tr><td>固态栅格地板扰频模块</td><td>MedAssociates</td><td>ENV-412</td><td></td></tr><tr><td>双 A/B 电击控制模块</td><td>MedAssociates</td><td>ENV-415</td><td></td></tr><tr><td>2 英尺 3 针迷你莫列克斯延长线</td><td>MedAssociates</td><td>SG-216A-2</td><td></td></tr><tr><td>10 英尺电击输出电缆，DB-9 公母接头</td><td>MedAssociates</td><td>SG-219G-10</td><td></td></tr><tr><td>15 英尺穿梭电击控制电缆，6 芯</td><td>MedAssociates</td><td>SG-219SA</td><td></td></tr><tr><td>小型台式机柜及电源，120 V 60 Hz</td><td>MedAssociates</td><td>SG-6080D</td><td></td></tr><tr><td>PCI 接口套件</td><td>MedAssociates</td><td>DIG-700P2-R2</td><td></td></tr><tr><td>穿梭箱回避实用程序套件</td><td>MedAssociates</td><td>SOF-700RA-7</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;目录编号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;备注&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;睡眠-觉醒监测设备&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ponehmah 软件</td><td>Data Sciences International (DSI)</td><td>PNP-P3P-610</td><td></td></tr><tr><td>MX2 8 源采集接口</td><td>Data Sciences International (DSI)</td><td>PNM-P3P-MX204</td><td></td></tr><tr><td>Dell 计算机，Optiplex 7020，Windows 7，64 位</td><td>Data Sciences International (DSI)</td><td>271-0112-013</td><td></td></tr><tr><td>Dell 19&quot; 计算机显示器</td><td>Data Sciences International (DSI)</td><td>271-0113-001</td><td></td></tr><tr><td>塑料笼接收器，8 个</td><td>Data Sciences International (DSI)</td><td>272-6001-001</td><td></td></tr><tr><td>Cisco RV130 VPN 路由器</td><td>Data Sciences International (DSI)</td><td>RV130</td><td></td></tr><tr><td>Matrix 2.0</td><td>Data Sciences International (DSI)</td><td>271-0119-001</td><td></td></tr><tr><td>网络交换机</td><td>Data Sciences International (DSI)</td><td>SG200-08P</td><td></td></tr><tr><td>Neuroscore 软件</td><td>Data Sciences International (DSI)</td><td>271-0171-CFG</td><td></td></tr><tr><td>双生物电位通道发射器，型号 TL11M2-F40-EET</td><td>Data Sciences International (DSI)</td><td>270-0134-001</td><td></td></tr></tbody></table>

高效液相色谱法测定犬尿氨酸和犬尿酸：将生物化学与大鼠的认知和睡眠相关联

A High-performance Liquid Chromatography Measurement of Kynurenine and Kynurenic Acid: Relating Biochemistry to Cognition and Sleep in Rats

犬尿氨酸通路（KP）是色氨酸降解的重要途径，已被证实与精神疾病相关。特别是由星形胶质细胞产生的代谢物犬尿喹啉酸（KYNA），其为多种受体的拮抗剂 N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）受体和α7烟碱型乙酰胆碱（α7nACh）受体参与健康与疾病状态下的认知过程。由于精神分裂症患者脑内犬尿氨酸（KYNA）水平升高，谷氨酸能和胆碱能受体功能障碍被认为与该病精神病理学核心领域之一的认知功能障碍存在因果关系。KYNA可能在精神分裂症患者的病理生理过程中发挥重要作用。通过给予啮齿类动物直接生物前体犬尿氨酸，可提高其脑内内源性KYNA水平。大鼠的临床前研究表明，KYNA的急性升高可能影响其学习与记忆过程。本实验方案详细描述了这一研究方法，结合了以下三个方面：a）采用高效液相色谱法对血液中犬尿氨酸水平及脑内KYNA生成进行生化分析；b）利用被动回避范式开展行为学测试，以评估依赖海马的情境记忆；c）通过遥测记录脑电图（EEG）与肌电图（EMG）信号，评估大鼠的睡眠-觉醒行为。综上，本研究旨在探讨KYNA升高与睡眠及认知之间的关系，并详细阐述一种用于理解犬尿氨酸升高及KYNA生成功能后果的实验方法。 体内 在大鼠中。通过本方案的不同变体所获得的结果将验证以下假设：犬尿氨酸通路（KP）和犬尿酸（KYNA）在健康与疾病状态下对睡眠和认知功能的调节具有关键作用。

为了验证腹腔注射犬尿氨酸（kynurenine）作为升高脑内KYNA水平的方法，对组织样本进行了高效液相色谱（HPLC）分析。使用配套软件绘制标准曲线（图1），用于组织样本的定量分析。犬尿氨酸和KYNA的代表性色谱图见图2。犬尿氨酸的保留时间为6分钟，KYNA的保留时间为11分钟。为观察犬尿氨酸通路（KP）的动态变化，本实验采用100 mg/kg剂量的犬尿氨酸进行处理，并在注射后立即、2小时或4小时采集组织样本（图3a）。测定血浆中犬尿氨酸（图3b）以及海马组织中KYNA的含量（图3c）。HPLC检测犬尿氨酸代谢物所用的具体参数详见表1。本方案所得的剂量-效应曲线支持将急性犬尿氨酸注射描述为一种可升高脑内KYNA水平的方法，KYNA水平在注射后...

犬尿氨酸通路（KP）神经活性代谢物的改变与精神疾病相关。研究犬尿氨酸通路代谢异常的功能性后果 体内 在啮齿类动物中可能有助于阐明新的治疗策略。本方案结合生化与行为学方法，研究急性犬尿氨酸刺激对大鼠的影响。

色氨酸降解的犬尿氨酸途径（KP）已被认为与精神疾病相关。具体而言，星形胶质细胞来源的代谢物……

该方法结合了生化与行为学手段，有助于回答神经科学领域中关于急性犬尿氨酸干预对大鼠影响的关键问题。该技术的主要优势在于，它为测定大鼠脑组织和血浆中犬尿氨酸代谢通路的代谢物提供了可靠且一致的方法。本次实验操作将由我实验室的学生研究助理Carly Fabian进行演示。在腹腔注射犬尿氨酸后达到适当的实验终点时，将采集的冷冻血浆置于湿冰上解冻，并用超纯水稀释解冻后的样品。取100 µL稀释后的样品加入含有25 µL 6%高氯酸的各个容器中，涡旋混匀后离心。然后，从每管中取100 µL上清液转移至各自的250 µL微量离心管中，用于测定犬尿氨酸和犬尿酸。从脑组织样本中检测犬尿酸时，将采集后冷冻的脑组织样本置于干冰上解冻，并使用精密分析天平分别称量每个样本。待所有样本称重完毕后，将离心管转移至湿冰上，按照1:10（重量/体积）的比例，用超纯水稀释各组织样本，随后使用超声波破碎仪进行匀浆。取每份样本匀浆液100微升分装至新的离心管中，再加入25微升25%高氯酸，涡旋混匀后离心。然后，取100微升上清液转移至各自的250微升微量离心管中，用于测定犬尿酸。为准备高效液相色谱（HPLC）仪器进行犬尿氨酸分析，首先将HPLC进样管分别插入流动相——超纯水和100%乙腈的容器中。然后，设定仪器程序，以每分钟0.5毫升的流速运行5%乙腈和95%超纯水，使高效液相色谱仪运行20至30分钟。当压力和基线稳定后，将流动相更换为含5%乙腈和95%乙酸钠的溶液，并使仪器再平衡30分钟。在仪器平衡期间，打开荧光检测器的光源。在进行衍生化之前，通过蠕动泵将乙酸锌溶液单独泵入，并在色谱柱后与流动相混合，同时启动柱后泵，流速设为0.1毫升/分钟，持续约20分钟，直至系统压力稳定在约500 psi。当仪器准备就绪进行分析时，设置系统软件以控制样品序列参数，并允许自动进样多个样品。在“运行样品”界面中，点击“文件”，向下拖动并选择“创建新的样品集”，在新窗口中选择“空白”。按照样品应运行的顺序，逐一列出所有标准品和样品，标准品应在序列开始和结束时进行检测。在功能列中，指定标准品和样品，并设置程序以在每五个样品之间注入水。每个样品的运行时间设为15分钟，依次注入20微升标准品溶液，随后根据实验需要注入20微升血浆样品和30微升脑匀浆样品。然后，根据待测化合物设定激发波长和发射波长，并运行序列。为了对数据进行定量，打开“浏览项目”界面，在“样品集”选项卡下，双击需要定量的样品集。在进样列表中，选中所有标准品，右键单击并选择新窗口中的“处理”。然后，使用下拉菜单选择“校准与定量”。再次选中所有标准品，右键单击并选择“查看”。当色谱图打开后，对每个标准品进行积分和校准，以生成标准曲线。然后，返回“样本集”选项卡，双击待定量和审阅的样本集，如演示所示，对每个样本进行积分和定量，根据先前创建的标准曲线输出每个样本的浓度。对给予犬尿氨酸动物所采集的组织样本进行高效液相色谱分析，结果显示犬尿氨酸的保留时间约为6分钟，犬尿喹啉酸的保留时间约为11分钟。血浆中犬尿氨酸和海马组织中犬尿喹啉酸的定量结果表明，急性注射犬尿氨酸可使脑内犬尿喹啉酸水平升高，注射后2小时达到峰值，4小时时恢复至基线水平。尽管在被动回避范式训练试验中未观察到组间差异，但对照组动物在测试试验中进入暗室的潜伏期显著延长，表明存在情境学习能力；而此前24小时注射了犬尿氨酸的动物则未表现出潜伏期的类似延长，提示其学习能力存在缺陷。此外，评估急性犬尿氨酸水平升高对光照期睡眠-觉醒结构的影响显示，在注射犬尿氨酸后的最初两小时内，快速眼动睡眠总时长减少。这一结果同时伴随着在此期间觉醒时长的增加以及非快速眼动睡眠的轻微减少，表明急性犬尿氨酸水平升高也会导致睡眠-觉醒动态的紊乱。采用此方法后，还可进行行为学分析等其他方法，以进一步探究犬尿酸水平升高在调节认知和睡眠中的作用。

a-high-performance-liquid-chromatography-measurement-kynurenine

Research

科研

JoVE Journal

Behavior

行为

高效液相色谱法测定犬尿氨和 Kynurenic 酸: 对大鼠认知和睡眠的相关生物化学研究

本文描述了一种在监测脑电图、肌电图和脑乳酸浓度的同时，利用光遗传学方法调控大脑皮层锥体神经元活性的实验方案。实验记录在带有电缆束缚的小鼠上进行，小鼠处于自然的睡眠/觉醒周期过程中。光遗传学设备由本实验室自行组装，记录设备为 commercially...

同步进行啮齿类动物大脑皮层的脑电图记录、乳酸浓度实时测量与光遗传学神经元活动操控

本视频演示了一种在麻醉小鼠中植入脑电图（EEG）和肌电图（EMG）电极组件的实验方案。该过程包括将小鼠固定于立体定位仪上，在颅骨正中切开皮肤，钻出电极孔位，并固定电极组件以进行信号记录。小鼠苏醒恢复后，利用所记录的信号分析其睡眠-觉醒行为。...

通过脑电图和肌电图记录分析小鼠睡眠行为

在自由活动的小鼠中记录脑电图（EEG）和肌电图（EMG）是将行为与睡眠和觉醒的生理状态相关联的关键步骤。本文所述的实验方案提供了一种基于电缆的系统，用于在小鼠中获取脑电图和肌电图记录。...

用于测量小鼠睡眠的多导生理记录操作流程

突触体多巴胺摄取与高效液相色谱分析是研究小鼠多巴胺稳态的实验工具，分别用于评估多巴胺转运体功能和纹状体组织中多巴胺水平。本文中，我们提供了测定多巴胺组织含量及评估多巴胺转运体功能的实验方案。...

利用高效液相色谱分析和突触体多巴胺摄取评估小鼠多巴胺能稳态

我们提出了一种便捷的固相萃取联合高效液相色谱（HPLC）电化学检测（ECD）方法，用于同时测定婴儿尿液中三种单胺类神经递质及其两种代谢物。我们还鉴定出代谢物MHPG可作为婴儿脑损伤早期诊断的潜在生物标志物。...

一种便捷的儿茶酚胺类神经递质及其代谢物的提取与高效液相色谱分析方法

我们介绍了一种基于活动性监测的高通量睡眠测量方法，该方法通过动物在栖息笼内的活动情况进行睡眠评估。与传统的基于脑电图（EEG）的方法相比，该方法具有多项优势。该方法在总睡眠时间的测定方面已得到充分验证，可作为监测人类疾病啮齿类动物模型中睡眠状况的有力工具。...

非侵入性、高通量测定啮齿类动物睡眠时长

此处，我们介绍一种方法 在体...

在自由活动大鼠脑电图记录期间进行兴奋性氨基酸的微透析

睡眠不足和昼夜节律失调是导致大量操作事故和事件的重要因素。在实际操作环境中，评估旨在减轻疲劳的应对措施和工作排班设计的有效性具有挑战性。本文总结了一种在复杂操作环境中采集睡眠、昼夜节律、疲劳和绩效数据的方法。...

在复杂运行环境中采集睡眠、昼夜节律、疲劳与表现数据

本文介绍了一种方法，通过基于慕尼黑时间型问卷、金标准昼夜节律相位生物标志物及活动记录仪测量结果对受试者进行准确的昼夜节律表型分组，进而研究其行为表现的昼夜节律变化。...

人类昼夜表型分析与真实世界中的日间功能测试

本文介绍了一种检测癌细胞培养上清液中犬尿氨酸通路产生的四种不同色氨酸代谢物（犬尿氨酸、3-羟基犬尿氨酸、黄尿酸、3-羟基邻氨基苯甲酸）的实验方案，该方法采用液相色谱串联单四极杆质谱法进行分析。...

利用液相色谱-质谱法同时定量分析癌细胞培养液中选定的犬尿氨酸类物质

学习使用高效液相色谱法测定大鼠血浆和脑组织中的犬尿氨酸和Kynurenic酸水平。该方法结合生化与行为学手段，为研究犬尿氨酸代谢通路在精神疾病中的作用提供可靠数据。

高效液相色谱法测定犬尿氨酸和犬尿酸：将生物化学与大鼠的认知和睡眠相关联

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