利用CRISPR/Cas9在人类诱导性多能干细胞中进行内源性蛋白标记

本实验方案的目的是生成表达内源性融合蛋白的人诱导性多能干细胞，该融合蛋白与内源阅读框的N端或C端荧光标签相融合。为实现目标基因敲入，我们采用CRISPR-Cas9系统，通过基于核糖核蛋白（RNP）的方法，使用野生型S. pyogenes Cas9蛋白以及合成的两部分CRISPR RNA和tracrRNA。该RNP通过电穿孔与作为供体质粒的荧光标签序列共同递送至细胞中。

通过荧光标记蛋白的表达，利用流式细胞术富集可能已编辑的细胞。随后建立单克隆细胞系，以分析精确的编辑结果。该基因编辑方案相较于传统的过表达载体具有多种优势。

由于荧光标签被引入基因组中，因此可以在内源性调控条件下研究所形成的融合蛋白的亚细胞定位和动态变化。本研究采用诱导性多能干细胞作为模型系统，因为它使我们能够在二倍体、非转化细胞中研究带标签蛋白。此外，由于这些细胞可分化为多种细胞类型（例如此处展示的心肌细胞），该方法为我们提供了在多种同基因背景的细胞环境中构建并研究带标签蛋白的机会。

然而，通过仔细优化，该方案也可适用于其他哺乳动物细胞类型的基因组编辑。大家好，我是 Amanda Haupt，来自艾伦细胞科学研究所的干细胞与基因编辑团队。目前，我们已利用这一方法成功构建了超过 35 种不同的细胞系，用于表达内源性融合蛋白。

我们利用这些方法研究多种独特的细胞结构和过程。迄今为止，本课题组尝试的基因位点中，已有高达95%获得成功。该方法对于希望深入了解活细胞中蛋白质动态变化的细胞生物学家而言，将尤为有用。

然而，一旦获得经过编辑的单克隆细胞系，其研究前景将无限广阔。利用该方法，我们能够稳定地鉴定出仅在单等位基因上带有荧光蛋白标签、且基因组序列中无其他任何干扰的克隆。我们有时还能获得双等位基因均被编辑的克隆。

在本视频中，我们将展示转染、FACS 富集以及分离表达内源性调控荧光融合蛋白的单克隆细胞系过程中的几个关键步骤。转染前两到三小时，向培养基中添加十微摩尔的 ROCK 抑制剂处理 hiPSCs。这将有助于提高电穿孔后的细胞存活率。

经过此处理后，细胞将呈现棘状外观。应在转染前使用单细胞解离区域从组织封闭板中取出细胞，并将细胞悬液收集至锥形管中。每种需要转染的实验条件，准备一份含有1.84 × 10⁶个细胞的等分试样。

通过向一个1.5毫升离心管中加入2.88 µL的10 µM向导RNA和2.88 µL的10 µM Cas9，为每次转染制备核糖核蛋白复合物管。在室温下孵育，时间不少于10分钟，最长不超过1小时。将前一步骤中制备的细胞等分试样在室温下以211 × g离心3分钟。

然后吸除上清液，并将细胞沉淀重悬于220微升电穿孔缓冲液中，立即离心。将220微升重悬的细胞加入先前准备好的1.5毫升级RNP复合物管中。加入4.6微升浓度为1微克/微升的供体质粒。

使用核转染枪头和移液器将两种组分混合两到三次，然后将一百微升悬浮液转移至准备好的电穿孔装置中。避免在枪头中引入气泡。施加1300伏电压，持续30毫秒脉冲一次。

轻轻将悬液转移至已准备好的六孔板中，并以旋转动作混匀。通过轻轻左右、前后移动培养板来分散细胞。在完成所有实验条件和对照组的操作后，将转染的细胞在37摄氏度、5% CO2条件下培养24小时，并在24小时时更换为不含ROCK抑制剂的常规生长培养基。

随后每24小时继续培养hiPSCs，持续72至96小时，并监测其融合度。当hiPSCs达到68%至80%融合度时，进行FACS富集。转染前2至3小时，在生长培养基中添加10 µM ROCK抑制剂处理hiPSCs，以促进FACS富集后的细胞存活。

为了分选细胞，使用单细胞解离试剂将细胞从培养板上分离，随后将hiPSC悬液通过35微米孔径的滤膜过滤至聚苯乙烯圆底试管中。利用前向散射光和侧向散射光进行细胞分选，包括：高度对宽度、三联体碎片和双联体。使用仅含活细胞缓冲液的对照细胞设定FP阳性门控，使少于1.1%的仅缓冲液对照细胞落入该门控范围内。

分选干细胞时，应根据讨论部分的建议调整仪器设置以促进细胞存活。通过流式细胞术测定的典型基因敲入效率（以荧光蛋白阳性细胞百分比计）通常在0.1%至5%之间。将细胞分选至含有0.5至2毫升室温培养基的1.5至15毫升聚丙烯管中，培养基中需添加10 µM ROCK抑制剂。在室温下以211 × g离心收集的细胞3分钟。

小心吸除上清液，并将细胞沉淀重悬于 200 µL 添加了 10 µM ROCK 抑制剂的生长培养基中。将最多三千个混合细胞转移至一个新制的、经基质胶（Matrigel）包被的 96 孔板的单个孔中。将分选后的细胞在 37 °C、5% CO2 条件下培养 24 小时，并在 24 小时时更换为添加了 5 µM ROCK 抑制剂的生长培养基。

然后在48小时后，每隔24小时更换为常规生长培养基，继续培养72至96小时，并监测细胞融合度，期间不再添加ROCK抑制剂。当细胞生长成熟，可从96孔板中传代时，建议逐步将其转移至更大的培养板中。例如，将96孔板中的一个孔的细胞传代至24孔板中的1至2个孔。

然后将其接种至6孔板等容器中，直至获得足够数量的细胞用于后续实验，通常至少需要三百万至四百万个细胞。为了从经FACS富集的基因编辑细胞群体中建立单克隆细胞系，需将细胞重悬为单细胞悬液，并将一万个细胞接种到直径10厘米的培养皿中，培养5至7天，使细胞形成克隆集落。

当菌落肉眼可见时，其大小已足以进行分离。在解剖显微镜下，使用P200移液器轻轻刮取并吸取平板表面的单个菌落。将含有菌落的液体转移至96孔板中的一个单独孔中。

所有克隆转移完成后，将培养板置于37摄氏度、5%CO2的组织培养孵箱中孵育24小时。24小时后更换为不含ROCK抑制剂的常规生长培养基。随后每24小时换液一次，持续72至96小时，直至克隆大小增长至约原来的三倍。

为了获得足够用于基因组DNA提取的细胞，需要在96孔板中培养并传代细胞。更多细节请参见书面实验方案。在96孔板中进行传代时，使用八通道移液器移除并弃去第一列的培养基。

使用多通道P200移液器向培养板第一列中加入约200 µL DPBS，以洗涤细胞。然后使用八通道吸液器移除并弃去第一列中的DPBS洗涤液。随后向第一列中加入40 µL解离试剂。

依次对 96 孔板的每列进行上述步骤，最多处理六列。每次更换移液枪头，以避免孔间交叉污染。从向第一列加入解离试剂时起，将培养板放入培养箱中孵育三至五分钟。

当培养板第一列的细胞开始从底部脱落时，使用 P200 多通道移液器向第一列加入 160 微升 DPBS，并轻轻吹打每孔的 12 点、3 点、6 点和 9 点位置处的细胞。将含有细胞悬液的全部液体转移至 V 型底 96 孔板中。对其他含有解离试剂的列重复上述步骤，每次更换吸头以避免孔间交叉污染。

将V型底培养板在离心机中以385 ×g的转速在室温下离心3分钟。至此展示的96孔板传代操作步骤，适用于以该板型进行细胞传代的任何情况。接下来，我们将介绍当您准备以96孔板格式冻存细胞时的操作方法。

有关更多信息，请参见书面实验方案。在上一部分所示的离心步骤后，使用 P200 多通道移液器吸除上清液，然后将沉淀重悬于 60 µL 含 10 µM ROCK 抑制剂的生长培养基中。对所有孔重复此操作，每次更换吸头以避免交叉污染。

将30微升细胞悬液转移至未经Matrigel包被的96孔组织培养板中。将剩余的30微升悬液转移至配对培养板中，然后迅速向每孔加入170微升冻存缓冲液，无需混匀。请注意，该过程需在两块配对培养板中重复进行，以便在其中一块培养板解冻使用后，仍有备用的细胞群体。

将冻存的细胞仅加入96孔板的每隔一列，可实现更快的解冻。用封口膜包裹该板，并将其放入带有盖子的室温聚苯乙烯泡沫盒中。将整个盒子置于-80摄氏度的冰箱中。

24 小时后，可将培养板从泡沫箱中取出，并在零下 86 摄氏度条件下分装保存，最长可保存四周。以 96 孔板形式对人诱导性多能干细胞进行冷冻保存，可在细胞培养过程中实现时间上的中断。研究人员可对克隆株进行基因组验证检测，以鉴定出具有理想遗传特性的克隆，用于后续研究的复苏培养。

在将靶向特异性引导RNA、Cas9蛋白以及精心设计的供体质粒转染至WTC hiPSC细胞系四天后，观察到0.95%的细胞表达GFP。通过FACS分选所有GFP阳性细胞，获得富集的细胞群体。初步显微镜研究表明，mEGFP与核纤层蛋白B1融合蛋白定位于核膜，符合预期结果。

在约95%的细胞中观察到荧光标记的蛋白质，荧光强度各异。经过克隆系生成后，获得了mEGFP荧光强度均一的克隆，并进一步进行精确编辑分析。综上所述，我们展示了一种用于基因编辑人诱导性多能干细胞的转染方法，以实现内源性调控的荧光融合蛋白的表达。

由于典型的敲入效率较低，因此需要采用富集策略（例如此处展示的FACS方法），以获得一群假定已编辑并表达融合蛋白的细胞。经富集的细胞群体可直接用于生物学研究，或按照本方法所述建立单克隆细胞系，从而能够鉴定出实现精确基因编辑的细胞系。需要注意的是，尽管在目标位点成功插入了标签，Cas9在基因组中诱导的双链断裂仍常常通过非精确修复方式进行修复。

此外，在单等位基因编辑的克隆中，未标记的等位基因通常含有插入缺失（indel），这极有可能是由非同源末端连接修复所导致。这些发现强调了在CRISPR Cas9敲入后进行遗传学验证的重要性，而这种验证只能通过克隆细胞系基因组分析才能揭示。仅表达预期的融合蛋白并不能保证编辑的精确性。

在使用本方案编辑人类诱导多能干细胞时，请务必遵循书面方案中详述的建议，以确保细胞得到轻柔处理，从而实现最佳的细胞存活率并最大限度地减少自发分化。希望本视频以及相关的方案和材料清单能帮助您在自己的实验室中对您感兴趣的蛋白质开展类似的实验。感谢观看。