Endogenous Protein Tagging in Human Induced Pluripotent Stem Cells Using CRISPR/Cas9

该方案的目标是生成人诱导的多能干细胞，这些干细胞表达与末端框架 N 或 C 末端荧光标签融合的内源性融合蛋白。为了实现所需的敲入，我们使用 CRISPR-Cas9 系统和基于核糖核蛋白的方法，该方法使用野生型化脓性链球菌 Cas9 蛋白和合成的两部分 CRSPR RNA 和 tracrRNA。该 RNP 通过电穿孔作为供体质粒与所需的荧光标签序列共同递送。

表达荧光标记蛋白的推定编辑细胞被 FACS 富集。然后生成克隆系以分析精确的编辑结果。与传统的过表达构建体相比，这种基因编辑方案具有许多优势。

由于荧光标签被引入基因组中，因此可以在内源性调控下研究所得融合蛋白的亚细胞定位和动力学。在这里，我们使用诱导多能干细胞作为模型系统，因为它允许我们研究二倍体未转化细胞中的标记蛋白质。此外，由于细胞可以分化成多种细胞类型，如此处所示的心肌细胞，这种方法提供了在各种同基因细胞环境中创建和研究标记蛋白的机会。

然而，通过仔细优化，该方案可以适用于编辑其他哺乳动物细胞类型的基因组。大家好，我是 Amanda Haupt，我是 Allen Institute for Cell Science 干细胞和基因编辑团队的一员。今天，我们已经使用这种方法生成了超过 35 种不同的表达内源性融合蛋白的细胞系。

我们使用这些来研究各种独特的细胞结构和过程。迄今为止，这种方法在我们小组尝试的多达 95% 的基因座中取得了成功。该方法对于有兴趣更好地了解活细胞中蛋白质动力学的细胞生物学家特别有用。

然而，一旦生成了编辑的克隆系，研究的可能性就无穷无尽了。通过这种方法，我们能够一致地识别具有单等位基因荧光蛋白标签的克隆，而不会对基因组序列造成任何其他破坏。我们偶尔也能够获得双等位编辑的克隆。

在本视频中，我们将展示转染、FACS 富集和分离表达内源性调节荧光融合蛋白的克隆细胞系的一些关键步骤。转染前 2 至 3 小时，用补充到生长培养基中的 10 微摩尔 ROCK 抑制剂处理 hiPSC。这将促进电穿孔后的存活。

这种处理后细胞会出现尖刺。转染前，应使用单细胞解离区从组织封闭板中取出细胞，并将细胞悬液收集在锥形管中。为要转染的每种实验条件准备 1.84 x 10 的等分试样到 6 个细胞中。

向 1.5 mil 试管中加入 2.88 μL 10 μmol 向导 RNA 和 2.88 μL 10 μmol Cas9，制备用于每次转染的核糖核蛋白复合物试管。在室温下孵育至少 10 分钟，最多一小时。将上一步中制备的细胞等分试样以 211 倍 G 的浓度在室温下沉淀 3 分钟。

然后吸出上清液，并在 220 μL 电穿孔缓冲液中争分夺秒地旋转细胞沉淀。将 220 μL 重悬细胞添加到先前制备的 1.5 mil RNP 复合物管中。每微升供体质粒添加 4.6 微升 1 微克。

使用成核吸附吸头和移液管将两种内容物混合 2 到 3 次，然后将 100 微升悬浮液转移到准备好的电穿孔装置中。避免在尖端引入任何气泡。施加 1300 伏特，一个脉冲 30 毫秒。

以旋转运动将悬浮液轻轻转移到制备的六孔板中。通过轻轻地左右和前后移动板来分散细胞。对所有实验条件和对照重复此作后，将转染的细胞在 37 摄氏度和 5%CO 2 下孵育 24 小时，并在 24 小时时将培养基更换为不含 ROCK 抑制剂的常规生长培养基。

然后继续每 24 小时补料一次 hiPSC，持续 72 至 96 小时，监测它们的汇合度。当 hiPSCs 达到 68% 至 80% 汇合时，继续进行 FACS 富集。转染前 2 至 3 小时，用补充到生长培养基中的 10 微摩尔 ROCK 抑制剂处理 hiPSC，以促进 FACS 富集后的存活。

要对细胞进行分选，请使用单细胞解离试剂将其从板中取出，然后通过 35 微米网状过滤器将 hiPSC 悬浮液过滤到聚苯乙烯圆底管中。使用前向散射和侧向散射对细胞进行排序，包括：高度与宽度、三联体碎片和双峰。使用仅实时缓冲液对照单元设置 FP 正门，以便不到 1.1% 的仅缓冲液单元落在门内。

分选干细胞时，如讨论部分所述，调整仪器设置以促进细胞存活。由 FACS 确定的 FP 阳性细胞百分比确定的典型敲除效率范围为 0.1% 至 5%将细胞分选到 1.5 至 15 mil 聚丙烯管中，该管含有 0.5 至 2 mil 室温生长培养基，并补充有 10 微摩尔 ROCK 抑制剂。在室温下以 211 倍 G 离心收集的细胞 3 分钟。

小心吸出上清液，并将细胞沉淀重新悬浮在 200 微升补充有 10 微摩尔 ROCK 抑制剂的生长培养基中。将多达 3000 个各种细胞转移到新鲜基质胶包被的 96 孔板的单个孔中。将分选的细胞在 37 摄氏度下在 5% CO2 中孵育 24 小时，在 24 小时时将培养基更换为补充有 5 微摩尔 ROCK 抑制剂的生长培养基。

然后在 48 小时时，继续给细胞喂食常规生长培养基，无 ROCK 抑制剂每 24 小时一次，持续 72 至 96 小时监测汇合度。一旦细胞成熟到足以从 96 孔板中传代，我们建议将它们逐渐传代到更大的板中。因此，例如，从 96 孔板的一个孔中，将它们向上移动到 24 孔板的一到两个孔中。

然后从那里进入 6 孔板，依此类推，直到您有足够的细胞用于下游目的。通常最少 3 到 400 万个单元格。为了从富含 FACS 的惩罚性编辑细胞群中产生克隆系，传代到单细胞悬液中，将一万个细胞接种在 10 厘米的平板上，让菌落生长 5 到 7 天。

当菌落在肉眼上可见时，它们大到足以被分离出来。在解剖显微镜上，使用 P200 移液器轻轻地从板表面刮擦和吸出单个菌落。将含有菌落的体积转移到 96 孔板的单个孔中。

转移所有菌落后，将板在 37 摄氏度和 5% CO2 的组织培养箱中孵育 24 小时。在 24 小时时将培养基更换为不含 ROCK 抑制剂的常规生长培养基。然后继续每 24 小时补料一次细胞，持续 72 至 96 小时，直到菌落大小增加约三倍。

细胞需要在 96 孔板中生长和传代，以便有足够的细胞来冷冻保存抗转录用于基因组 DNA 提取。有关更多详细信息，请参阅书面协议。要在 96 孔板中传代，请使用八通道吸液器从第一柱中去除和丢弃培养基。

使用 P200 多通道移液器，向板的第一列添加约 200 微升 DPBS 以洗涤细胞。然后使用八通道吸液器，然后从第一根色谱柱中取出并丢弃 DPBS 洗涤液。然后向第一柱中加入 40 μL 解离试剂。

重复这些步骤，一次使用一根色谱柱，最多 6 个 96 孔板的色谱柱。更换吸头以确保不要交叉污染孔。将板放入培养箱中，从将解离试剂添加到第一根柱子中开始 3 到 5 分钟。

当板第一列中的细胞开始从底部抬起时，使用 P200 多通道移液器向第一列中加入 160 微升 DPBS，并在每个孔的 12 点钟、3 点钟、6 点钟和 9 点钟位置轻轻研磨细胞。将带有细胞悬液的整个体积转移到 V 形底 96 孔板中。对其余含有解离试剂的色谱柱重复这些步骤，更换吸头以免交叉污染孔。

在离心机中，在室温下以 385 倍 G 离心 V 形底板 3 分钟。到目前为止显示的 96 孔传代 sub 在以这种板形式传代细胞时以相同的方式进行。接下来，如果您准备以 96 孔规格冷冻保存细胞，我们将向您展示如何进行。

有关更多信息，请参阅书面协议。在上一节所示的离心步骤之后，使用 P200 多通道移液器吸出上清液，然后重新悬浮在 60 微升补充有 10 微摩尔 ROCK 抑制剂的生长培养基中。对所有孔重复，更换吸头以免交叉污染。

将 30 μL 细胞悬液转移到非基质胶包被的 96 孔组织培养板上。将剩余的 30 μL 悬浮液转移到姊妹板中，然后快速向每个孔中加入 170 μL 冻存缓冲液，无需混合。请注意，此过程是在一式两份的姐妹板中完成的，因此在其中一个单独的板解冻后存在备用细胞群。

仅将冻存的细胞放入 96 孔板的每隔一列中，可以更快地解冻。用封口膜包裹板，并将其放入带盖的室温泡沫塑料盒中。将整个盒子放入零下 80 摄氏度的冰箱中。

24 小时后，可以将印版从聚苯乙烯泡沫塑料箱中移出，并在零下 86 摄氏度下进行分拣，最长可保存 4 周。以 96 孔形式冷冻保存人诱导多能干细胞，允许在细胞培养中暂时中断。研究人员可以对克隆地雷进行基因组验证分析，以确定遗传上需要解冻的克隆，以供未来研究使用。

用靶标特异性向导 RNA Cas9 蛋白和精心设计的供体模板质粒转染 WTC hiPSC 系 4 天后，观察到 0.95% 的细胞表达 GFP。FACS 用于将所有 GFP 阳性细胞分选为富集的群体。初步显微镜研究显示 mEGFP 核纤层蛋白 B1 融合蛋白的预期定位于核膜。

在大约 95% 的细胞中观察到荧光标记的蛋白质，强度不同。克隆系生成后，获得具有均匀 mEGFP 强度的克隆，并进一步分析以进行精确编辑。总而言之，我们展示了一种用于基因编辑人诱导多能干细胞的转染方法，用于表达内源性调节的荧光融合蛋白。

由于典型的敲除效率低，因此一些富集策略（如此处所示的 FACS 方法）会导致表达融合蛋白的推定编辑细胞群。富集的群体可用于生物学研究，或者可以按照该方法中的描述生成克隆系，从而可以识别经过精确基因编辑的细胞系。重要的是要记住，尽管在预期基因座上掺入了标签，但 Cas9 诱导的基因组双链断裂通常被不精确地修复。

此外，在单等位体编辑的克隆中，未标记的等位基因通常包含最有可能由非同源末端连接修复引起的插入缺失。这些发现强调了 CRISPR Cas9 敲入后遗传验证的重要性，只有通过分析克隆细胞系的基因组才能揭示。仅表达预期的融合蛋白并不能保证精确编辑。

当使用此方案编辑人诱导多能干细胞时，请注意遵循书面方案中详述的建议，以确保温和地处理细胞以实现最佳细胞存活和最小的自发分化。我们希望此视频以及相关的实验步骤和材料列表能帮助您在自己的实验室中对自己喜欢的蛋白质进行类似的实验。感谢观看。