体外支持性脂质双层自组织蛋白模式的重组

这种方法可以帮助回答有关细胞组织和膜的关键问题，例如，几何线索在此过程中的作用。该技术的主要优点是它允许精确控制影响模式形成的所有方面，例如蛋白质浓度。首先，按照文本协议中的描述生成多层囊泡。

现在，将脂质冻融 7 到 10 个循环，首先在热板上准备一个装有 70 至 99 摄氏度水的烧杯，以及一个盛有液氮的容器。用大镊子将样品瓶放在液氮中，直到氮气停止沸腾。然后将样品瓶转移到热水中，直到溶液完全解冻。

重复这些步骤，直到脂质混合物看起来清晰，具体取决于混合物。接下来，组装脂质挤出机并用 Min 缓冲液预冲洗系统。将脂质混合物挤出 35 到 41 次，穿过 50 纳米孔径的膜。

确保以奇数次结束，以避免从未穿过膜的聚集体。将玻璃盖玻片分布在倒置玻璃培养皿或其他惰性表面上。用玻璃移液管，向每个盖玻片的中心加入七滴浓硫酸。

然后在酸滴的中间加入两滴 50% 的过氧化氢。覆盖反应物并孵育至少 45 分钟。现在，用镊子单独拿起盖玻片，然后用超纯水冲洗掉酸。

将清洗过的盖玻片放入不粘支架或类似的运输装置中。现在用超纯水充分冲洗每个盖玻片，并用加压气体干燥表面。用永久性记号笔标记盖玻片的清洁面。

要组装腔室，首先用锋利的剪刀切掉并丢弃 0.5 毫升反应管的盖子和锥形部分。然后将 UV 胶涂在管的上边缘，并使用移液器吸头将胶水均匀分布。将试管倒置到盖玻片的干净面上。

最后，通过在 360 纳米灯或 LED 下方放置多个腔室 5 到 15 分钟来固化 UV 胶。为了形成支持的脂质双层，将加热块预热至 37 摄氏度，并将两毫升反应管与 Min 或 SLB 缓冲液以每个腔室一根管孵育。将氮气吹入组装和固化的腔室中，以去除在 UV 固化和组装过程中可能沉淀的任何灰尘或其他颗粒。

然后，将腔室放在加热块上。用 130 μL Min 缓冲液稀释 20 μL 等分试样的透明脂质，使工作浓度为 0.53 mg/mL。向每个腔室中加入 75 微升脂质混合物。

现在，将计时器设置为 3 分钟。在孵育期间，囊泡在亲水性玻璃表面爆裂，并融合形成连贯的 SLB。60 秒后，向每个腔室中加入 150 μL Min 缓冲液。

剩余 120 秒后，加入 200 μL Min 或 SLB 缓冲液洗涤每个腔室，小心地上下吹打几次，取出并再加入 200 μL。每个腔室洗涤一次后，继续彻底清洗第一个腔室，直到 2 毫升缓冲液用完。洗涤支撑的脂质双层需要一些经验来完善腔室中的运动程度，并找到正确的洗涤强度。

要从图案化硅晶片生产 PDMS 微结构，首先使用塑料杯称量 10 克 PDMS 基座和 1 克 PDMS 交联剂。使用混合装置对 PDMS 混合物进行混合和脱气。现在，使用移液器吸头将少量 PDMS 直接滴到硅晶片上的结构上。

立即将 1 个盖玻片放在 PDMS 液滴上，然后取干净的移液器吸头的上端，轻轻地将盖玻片压到硅晶片上。PDMS 应在盖玻片和硅晶片之间薄薄地铺展。将带有盖玻片的晶圆放入烘箱中，在 75 摄氏度下固化 PDMS 三到四个小时，或过夜。

接下来，从烤箱中取出晶片，让它冷却至室温。用剃须刀片小心地从硅晶片上取下带有附加 PDMS 的盖玻片。现在，按照前面对玻璃的描述，将塑料腔室连接到 PDMS。

取出带有连接腔室的盖玻片，放入以氧气为工艺气体的等离子清洗器中。用等离子体清洁盖玻片。在这项工作中，使用了 30% 的功率和 0.3 毫巴的氧气压力，持续一分钟。

现在，按照之前在玻璃上的描述，在腔室中准备 SLB。要进行自组织测定，请将腔室中的缓冲液体积调整为 200 微升 Min 缓冲液，减去蛋白质和 ATP 溶液的量。然后加入 MinD，标记为 MinD、MinE，如果需要，加入 MinC，并通过移液轻轻混合组分。

现在，添加 2.5 毫摩尔 ATP 以开始 MinDE 的自组织。在接下来的 10 到 30 分钟内，在荧光显微镜上检查规则的 MinDE 图案形成和正确形成的微观结构。当形成规则的 MinDE 模式时，轻轻上下移液两次以混合组分。

使用 100 微升移液器去除大部分缓冲液，然后使用 10 微升移液器小心去除其余部分。为了延长成像时间，请将一块湿润的海绵塞入腔室内。确保海绵不接触盖玻片的表面。

立即用盖子关闭腔室，以避免微结构中残留的缓冲液干燥。在对微结构进行成像之前，确认 MinDE 自组织在 PDMS 微结构顶部停止，而微腔中的蛋白质正在振荡。在这个具有代表性的视频中，双色成像展示了 MinD 和 MinE 如何自组织成行进表面波，这些波符合支撑脂质双层上的螺旋图案。

在这里，单色成像显示 MinD 和 MinE 在 PDMS 微结构中执行磁极到磁极振荡。振荡建立了一个时间平均的 MinD 浓度梯度，其中隔室磁极的浓度最大，隔室中间的浓度最小。按照此程序，可以执行其他方法，如单颗粒跟踪，以确定膜结合动力学和停留时间。

不要忘记，使用食人鱼溶液可能非常危险，因此在执行此程序时应始终采取预防措施，例如个人防护设备。