体外 支持性脂双层上自组织蛋白模式的重建

该方法有助于回答有关细胞结构和膜的关键问题，例如几何信号在该过程中所起的作用。该技术的主要优势在于能够精确控制影响图案形成的各个方面，例如蛋白质浓度。首先，按照文本方案中所述的方法制备多层囊泡。

现在，将脂质进行七到十个冻融循环。首先，在加热板上准备一个烧杯，盛有70至99摄氏度的热水，同时准备一个装有液氮的容器。用大镊子夹住小瓶，浸入液氮中，直至液氮停止沸腾。然后将小瓶转移至热水中，直至溶液完全解冻。

根据混合物的不同，重复这些步骤直至脂质混合物在肉眼观察下呈现澄清状态。接下来，组装脂质挤出器，并用 Min 缓冲液预冲洗系统。将脂质混合物通过孔径为 50 纳米的膜挤出 35 至 41 次。

确保以奇数次过膜结束操作，以避免产生从未穿过膜的聚集体。将玻璃盖玻片均匀分布在倒置的玻璃培养皿或其他惰性表面上。用玻璃移液管向每张盖玻片的中心加入七滴浓硫酸。

然后在酸滴中央加入两滴50%的过氧化氢。盖上盖子，反应至少孵育45分钟。现在用镊子逐个夹起盖玻片，用超纯水冲洗掉酸液。

将清洗后的盖玻片放入防粘连的夹持器或类似的转运装置中。用超纯水彻底冲洗每一片盖玻片，并用加压气体吹干表面。用永久性记号笔标记盖玻片的洁净面。

组装反应室时，首先用锋利的剪刀剪下并丢弃0.5毫升反应管的管盖和锥形部分。然后将紫外胶涂在管子的上边缘，并用移液器吸头将胶水均匀涂布。将管子倒置，粘附在盖玻片的洁净面上。

最后，将多个腔室置于360纳米的紫外灯或LED下照射5至15分钟，使紫外胶完全固化。为形成支持性脂双层，预先将金属加热块加热至37摄氏度，并将含有Min缓冲液或SLB缓冲液的2毫升反应管（每腔室对应一管）在其中孵育。向组装完毕并已固化的腔室中通入氮气，以去除在紫外固化和组装过程中可能沉降的灰尘或其他微粒。

然后，将样品室置于加热块上。取20微升澄清脂质，加入130微升Min缓冲液进行稀释，配制成0.53毫克/毫升的工作浓度。向每个样品室中加入75微升脂质混合物。

现在，将计时器设置为三分钟。在孵育期间，囊泡会在亲水性玻璃表面破裂并融合，形成连续的支撑脂双层膜（SLB）。60秒后，向每个腔室中加入150微升Min缓冲液。

剩余120秒后，向每个腔室加入200微升Min缓冲液或SLB缓冲液，小心地上下吹打数次，吸出液体后再加入200微升。每个腔室完成一次洗涤后，继续对第一个腔室进行彻底洗涤，直至用完2毫升缓冲液。支撑脂双层的洗涤需要一定经验，以掌握腔室内的操作幅度并找到合适的洗涤强度。

为了从图案化的硅片上制备聚二甲基硅氧烷（PDMS）微结构，首先使用塑料杯称取10克PDMS基础剂和1克PDMS交联剂。使用混合装置混合并脱气PDMS混合物。然后，使用移液器吸头将少量PDMS直接滴加到硅片上的结构处。

立即将一个盖玻片放置在PDMS液滴上，并用干净移液器吸头的上端轻轻按压盖玻片，使其贴附于硅片表面。PDMS应在盖玻片与硅片之间均匀薄层铺展。将带有盖玻片的硅片放入烘箱中，在75摄氏度下固化三至四小时，或过夜。

接下来，将硅片从烘箱中取出，使其冷却至室温。使用刀片小心地将带有附着PDMS的盖玻片从硅片上剥离。然后，按照之前所述用于玻璃的方法，将一个塑料腔室连接到PDMS上。

将带有腔室的盖玻片放入以氧气为工艺气体的等离子清洗机中。用等离子体清洗盖玻片。本实验中采用30%功率和0.3毫巴氧气压力处理1分钟。

现在，按照先前所述方法在玻璃表面的腔室中制备SLB。为进行自组织实验，将腔室中的缓冲液体积调整为200微升Min缓冲液，减去蛋白和ATP溶液的体积。然后加入MinD、标记的MinD、MinE，以及根据需要加入MinC，并通过移液轻轻混合各组分。

现在加入 2.5 毫摩尔的 ATP 以启动 MinDE 的自组织过程。在接下来的 10 到 30 分钟内，使用荧光显微镜检查 MinDE 规则图案的形成情况以及微结构是否正常形成。当规则的 MinDE 图案形成后，轻轻吹打混合两次，以混匀组分。

使用 100 微升移液器移除大部分缓冲液，然后使用 10 微升移液器小心移除剩余液体。为了延长成像时间，将一块湿润的海绵塞入腔室内部，注意确保海绵不接触盖玻片表面。

立即用盖子封闭腔室，以避免微结构中残留缓冲液的干燥。在对微结构进行成像前，需确认 MinDE 的自组织在 PDMS 微结构表面已停止，而微腔内的蛋白质仍在振荡。在此代表性视频中，双色成像展示了 MinD 和 MinE 如何在支撑脂双层上自组织形成沿螺旋模式传播的表面波。

在此，单色成像显示 MinD 和 MinE 在 PDMS 微结构中进行两极间的振荡。这些振荡形成了时间平均的 MinD 浓度梯度，其浓度在区室的两极最高，而在区室中央最低。通过此方法，可进一步开展其他实验，例如单粒子追踪，以测定膜结合动力学及停留时间。

请勿忘记，使用piranha溶液可能具有极高的危险性，在进行此操作时，应始终采取个人防护装备等预防措施。