Name: 应用造血干细胞移植评估骨髓增生异常综合征的起源 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-03T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 39 s
Description: 了解造血干细胞移植技术用于评估骨髓增生异常综合征中恶性造血细胞的潜能。该方法通过体内功能分析识别疾病起始细胞，为癌症干细胞研究提供重要基础，助力开发新型治疗策略。

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本工作由美国国家癌症研究所、美国国立卫生研究院的院内研究计划资助（资助编号 ZIA SC 010378 和 BC 010983）。

本文所述动物实验程序已获得贝塞斯达国家癌症研究所动物护理和使用委员会的批准，并符合《公共卫生服务实验室动物人道护理和使用政策》、《动物福利法》以及《实验室动物护理和使用指南》中的相关规定。
1. 细胞准备
<ol>
	<li>获取骨髓有核细胞（BMNC）
	<ol>
		<li>仅使用无菌材料。可重复使用的器械通过高压蒸汽灭菌器进行灭菌。针头、注射器和塑料器皿应购买一次性无菌包装产品。所有动物操作和细胞处理均须在II级A2型生物安全柜中进行。</li>
		<li>在含有3 mL HF2（Hank's平衡盐溶液添加2%胎牛血清）的14 mL圆底试管中制备BMNCs。</li>
		<li>使用CO2麻醉舱处死C57Bl6供体小鼠（CD45等位基因CD45.2阳性），通常年龄为2–6个月。</li>
		<li>用喷雾瓶将70%乙醇喷洒至小鼠尸体全身以进行表面消毒。从骨盆向下剥离腿部皮肤至脚踝处。</li>
		<li>使用无菌剪刀（直型，尖端锐利/锐利，11.5 cm）和镊子（Graefe，带齿，尖端宽度0.8 mm）从小鼠尸体上取下股骨和胫骨。彻底清除附着的肌肉组织。</li>
		<li>用剪刀剪除胫骨的近端和远端。用镊子夹住胫骨，将装有2.5 mL HF2的27号3 mL注射器插入胫骨远端（脚踝端）骨髓腔内，轻柔施压，将骨髓细胞冲洗至14 mL圆底试管中。
		<ol>
			<li>对另一侧胫骨重复此操作。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>用剪刀剪除股骨的近端和远端。将连接有装满2.5 mL HF2的3 mL注射器的20号针头插入股骨远端骨髓腔，轻柔推注以冲洗骨髓。
		<ol>
			<li>对另一侧股骨重复此操作，将两侧胫骨和股骨的全部骨髓收集至同一支14 mL圆底试管中。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>使用连接在同一3 mL注射器上的20号针头，反复吹打数次以充分分散骨髓组织团块。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>BMNC的抗体染色
	<ol>
		<li>计数BMNC。取步骤1.1.8制备的BMNC悬液20 µL，加入20 µL 3%醋酸溶液，随后使用血细胞计数板和倒置显微镜进行细胞计数。</li>
		<li>在4 °C条件下以450 × g离心5分钟，使BMNC沉淀。按每107个细胞加入90 µL HF2重悬细胞沉淀，并向细胞悬液中加入10 µL生物素标记的谱系抗体混合物（anti-lineage antibody cocktail）。</li>
		<li>在4 °C孵育20分钟后，用3 mL磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤染色后的细胞。</li>
		<li>按每107个细胞加入100 µL HF2重悬BMNC，向细胞悬液中加入2 µL藻红蛋白别藻青蛋白（APC）偶联的抗生物素抗体，随后在4 °C孵育20分钟。</li>
		<li>用3 mL PBS洗涤染色后的BMNC，并用含0.2 µg/mL碘化丙啶（PI）的HF2重悬细胞，用于流式细胞术分选。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>BMNC的流式细胞术分选
	<ol>
		<li>校准流式细胞分选仪。使用未染色细胞优化所有光电倍增管（PMT）、散射光及荧光参数，并将各检测器设置在其线性检测范围内。</li>
		<li>平行制备来自步骤1.2的未染色、PI染色以及APC标记谱系抗体混合物染色的细胞样本，用于光谱补偿分析。</li>
		<li>通过依次设置FSC-H vs. SSC-H、640-SSC-A vs. 640-SSC-H、640-SSC-S vs. 640-SSC-W的门控策略排除双联体细胞（doublet cells）。</li>
		<li>使用561 nm激发PI，并通过614/20带通滤光片收集发射光以排除非活细胞。使用640 nm激发谱系标记的APC荧光，并通过671/30带通滤光片收集发射光。</li>
		<li>以电压高度记录荧光信号，以列表模式至少采集100,000个事件的数据，用于可视化待分选的细胞群体。</li>
		<li>采集以下三组各10,000个细胞的样本后，计算光谱补偿：未标记细胞、PI标记细胞、APC偶联的抗谱系抗体混合物标记细胞。</li>
		<li>设置三个分选区域，分别将谱系阴性（LN）、弱荧光强度的谱系阳性（LP1）以及强荧光强度的谱系阳性（LP2）细胞分选至含有0.5 mL 10% FBS培养基的5 mL试管中。</li>
		<li>采用“单滴包裹”模式（one drop envelop）并启用纯化中止（purify abort）模式进行细胞分选。</li>
		<li>对每份分选后的样本进行分选后分析，总计检测1,000个细胞，以确认分选细胞的纯度和活性。</li>
		<li>在4 °C条件下以450 × g离心5分钟收集分选细胞，弃上清后用0.5 mL HF2重悬细胞沉淀。</li>
		<li>使用血细胞计数板和台盼蓝染色确认分选细胞数量，并用HF2调整细胞浓度以用于移植。 
		注：通过在上述步骤1.2.2中使用其他荧光染料偶联抗体的组合，可分离多种不同表型的BMNC群体用于移植。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 受体小鼠准备与造血干细胞移植（HSCT）
<ol>
	<li>移植受体的准备
	<ol>
		<li>在特定病原体阴性（SPF）级动物实验设施中，对同源背景受体小鼠（B6-LY5.1/Cr，CD45.1）进行兽医监护与饲养管理。</li>
		<li>为进行胃肠道的预防性去污，在致死剂量（9 Gy）照射前7天开始，向受体提供含100 mg/L环丙沙星的无菌水，并在照射后继续维持14天。</li>
		<li>从铯（Cs）源提供致死剂量（9 Gy）的照射，操作步骤如下：由经过培训并获得认证的铯（Cs）源操作人员进行操作。将铯（Cs）源仪器设置为以70 cGy/min的剂量率进行全身γ射线照射。将10只小鼠放入定制的固定装置中，并将该装置插入照射室。进行总计9 Gy、持续13分钟的全身照射，随后将小鼠放回笼中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>造血干细胞移植
	<ol>
		<li>将野生型（WT）BMNC从同源受体小鼠（B6-LY5.1/Cr，CD45.1）按2 × 10⁶细胞剂量混合5 每只小鼠 2 至 5 × 10 个细胞4 使用1.3节所述流式细胞术分选制备的纯化试验骨髓单个核细胞（BMNC）。将细胞混合于同一注射器中。 
		注意：野生型骨髓单个核细胞（WT BMNC）可为受体小鼠提供辐射保护效应，从而确保当受试细胞无法支持造血功能时，受体小鼠仍能存活。本类实验中所用的野生型BMNC表达CD45.1等位基因，因此可通过特异性区分CD45.1与CD45.2的抗体将其与受试细胞区分开来。该野生型BM细胞被称为 &#34;辅助细胞&#34;, &#34;辐射敏感性较低的细胞&#34;，或 &#34;竞争细胞&#34;.</li>
		<li>使用无菌 HF2 将细胞混合物体积调整至每受体 200 µL，以方便注射。</li>
		<li>将细胞混合物移植到致死剂量照射的受体小鼠中 通过 使用1 mL注射器和28号针头进行尾静脉注射，于24小时内完成&#160;照射剂量。将小鼠尾巴置于加热灯下，因为热量可引起尾静脉扩张。 
		注意：在研究结束时，对所有受体小鼠实施安乐死，并通过尸体解剖、组织学和流式细胞术评估疾病进展。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 使用流式细胞术进行移植检测
<ol>
	<li>为评估供体细胞植入情况，分别在移植后第6周、第12周和第16周采集受体小鼠的外周血（PB）。</li>
	<li>将受体小鼠置于带有加热灯的笼子中预热约1分钟，然后将小鼠放入固定器中。</li>
	<li>使用手术刀（10号刀片，#3刀柄）切开尾静脉，用含EDTA作为抗凝剂的毛细管从每只受体小鼠采集100 µL外周血。</li>
	<li>将采集的外周血均分为两份，每份50 µL，分别置于无菌微量离心管中。其中一份用于自动化全血细胞计数（CBC）（由NCI组织病理学核心实验室完成），另一份用于抗体染色和流式细胞术分析。</li>
	<li>为通过流式细胞术检测供体细胞植入情况，向50 µL采集的外周血中加入1 mL低渗红细胞裂解缓冲液（8.29 g/L NH4Cl，1 g/L KHCO3，0.037 g/L Na2EDTA，pH 7.2）以裂解红细胞。涡旋混匀样品，并在室温下孵育10分钟。</li>
	<li>将裂解后的外周血在4,600 × g离心1.5分钟。小心吸除上清液并弃去。</li>
	<li>通过轻弹或&#34;弹击&#34;管底部分破坏细胞沉淀。向管中沉淀加入1.3 mL PBS，于4,600 × g离心1.5分钟。小心吸除并弃去上清液。</li>
	<li>通过轻弹或弹击破坏细胞沉淀，向沉淀中加入200 µL含5%大鼠血清的HF2缓冲液。</li>
	<li>向细胞悬液中加入与别藻蓝蛋白（APC）偶联的抗CD45.2抗体（1 µL）。在4 °C孵育至少30分钟，并短暂涡旋混匀。</li>
	<li>染色完成后，按上述方法洗涤细胞两次，然后用400 µL含1 µg/mL碘化丙啶（PI）的HF2缓冲液重悬细胞。</li>
	<li>使用四色流式细胞仪检测细胞植入情况。可通过添加额外抗体以检测特定细胞类型（如B或T淋巴细胞），从而获得外周血中更多细胞类型的详细信息。</li>
	<li>使用电子表格记录连续时间点的植入数据，以便进行后续数据分析。</li>
</ol>

<ol><li>Corey, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myelodysplastic+syndromes%3A+the+complexity+of+stem-cell+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Myelodysplastic syndromes: the complexity of stem-cell diseases.</a> Nature Reviews Cancer. 7 (2), 118-129 (2007).</li>
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<li>Benito, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NOD%2FSCID+mice+transplanted+with+marrow+from+patients+with+myelodysplastic+syndrome+%28MDS%29+show+long-term+propagation+of+normal+but+not+clonal+human+precursors%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia+Research%22%5BJournal%5D)">NOD/SCID mice transplanted with marrow from patients with myelodysplastic syndrome (MDS) show long-term propagation of normal but not clonal human precursors.</a> Leukemia Research. 27 (5), 425-436 (2003).</li>
<li>Medyouf, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myelodysplastic+cells+in+patients+reprogram+mesenchymal+stromal+cells+to+establish+a+transplantable+stem+cell+niche+disease+unit%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Myelodysplastic cells in patients reprogram mesenchymal stromal cells to establish a transplantable stem cell niche disease unit.</a> Cell Stem Cell. 14 (6), 824-837 (2014).</li>
<li>Chung, Y. J., Choi, C. W., Slape, C., Fry, T., Aplan, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+a+myelodysplastic+syndrome+by+a+long-term+repopulating+hematopoietic+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Transplantation of a myelodysplastic syndrome by a long-term repopulating hematopoietic cell.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (37), 14088-14093 (2008).</li>
<li>Pietras, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functionally+Distinct+Subsets+of+Lineage-Biased+Multipotent+Progenitors+Control+Blood+Production+in+Normal+and+Regenerative+Conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Functionally Distinct Subsets of Lineage-Biased Multipotent Progenitors Control Blood Production in Normal and Regenerative Conditions.</a> Cell Stem Cell. 17 (1), 35-46 (2015).</li>
<li>Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retro-orbital+injections+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Animal%22%5BJournal%5D)">Retro-orbital injections in mice.</a> Lab Animal. 40 (5), 155-160 (2011).</li>
<li>Chung, Y. J., Fry, T. J., Aplan, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myeloablative+hematopoietic+stem+cell+transplantation+improves+survival+but+is+not+curative+in+a+pre-clinical+model+of+myelodysplastic+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Myeloablative hematopoietic stem cell transplantation improves survival but is not curative in a pre-clinical model of myelodysplastic syndrome.</a> PLoS One. 12 (9), e0185219(2017).</li>
</ol>

我们没有需要披露的内容。

尽管骨髓增生异常综合征（MDS）是一种克隆性造血干细胞疾病，但MDS的&#34;干细胞&#34;或起始细胞尚未被明确鉴定。我们先前已证明，通过造血干细胞移植（HSCT），使用NHD13小鼠的骨髓可将MDS移植至野生型（WT）小鼠，其特征表现为大细胞性贫血、白细胞减少、中性粒细胞减少以及形态学上的发育异常证据15。此外，竞争性重群体实验发现，NHD13 MDS骨髓细胞具有生长优势。综合这些发现表明，MDS干细胞或起始细胞可能存在。目前正在进行更多实验，旨在结合本方案中描述的谱系标记染色方法，利用更明确的干细胞和祖细胞标记物（CD150、CD48、c-Kit和Sca-1）16，进一步明确MDS起始细胞的免疫表型特征15。
利用NHD13小鼠鉴定MDS起始细胞涉及复杂的流式细胞术分选过程。ex vivo对原代骨髓单个核细胞（BMNCs）的操作会对细胞造成压力，可能导致细胞死亡或功能丧失。因此，应尽量缩短ex vivo</...

骨髓增生异常综合征（MDS）是一组异质性的克隆性血液系统疾病，其特征为无效造血、形态学上可见的发育异常，以及向急性髓系白血病（AML）转化的倾向性1,2,3,4。无效造血表现为骨髓中的成熟受阻，尽管骨髓呈高增生状态，但仍导致外周血细胞减少1,3。在美国，MDS的发病率估计为每年每10万人中2至12例，且发病率随年龄增长而上升，鉴于美国人口老龄化趋势，这一疾病的重要性日益凸显3,5。尽管大多数MDS病例的病因尚不明确，但部分病例被认为与已知的基因毒性物质暴露有关，包括苯等有机溶剂以及癌症化疗药物6。
MDS 患者体内的 MDS 细胞通常具有获得性突变7。尽管相对少见，但部分 MDS 患者获得了涉及 NUP98、EVI1、RUNX1 和 MLL 等基因的平衡染色体易位（http://cgap.nci.nih.gov/Chromosomes/Mitelman）。本实验室长期关注涉及 NUP98 基因的染色体易位8。由 Vav1 启动子和增强子元件调控表达 NUP98-HOXD13（NHD13）转基因的转基因小鼠表现出 MDS 的所有关键特征，包括外周血细胞减少、形态学上的发育异常证据以及向急性髓系白血病（AML）的转化9。
尽管骨髓增生异常综合征（MDS）已被认识超过60年10，且被认为是一种克隆性造血干细胞疾病，但将人类MDS细胞移植到免疫缺陷小鼠体内的尝试在很大程度上并不成功，原因是MDS细胞植入效率低下11,12,13,14，且小鼠无法发展出临床疾病。为了鉴定哪些造血细胞能够传递MDS，我们采用了NHD13模型，并证明了可以将MDS作为一种疾病实体成功移植，该模型表现出人类MDS的所有主要特征，包括外周血细胞减少、发育异常以及向急性髓系白血病（AML）的转化15。在本报告中，我们介绍了这些实验的技术细节，以及进一步分离造血干细胞和前体细胞（HSPC）的方法，旨在鉴定MDS起始细胞。

<table><tbody><tr><td>14 mL 圆底管</td><td>Falcon</td><td>352057</td><td></td></tr><tr><td>Hank's 平衡盐溶液</td><td>Lonza</td><td>10-527F</td><td></td></tr><tr><td>抗 CD45.2 抗体</td><td>Southern Biotech</td><td>1800-15</td><td>LOT# A077-T044O</td></tr><tr><td>3 mL 注射器</td><td>Monoject</td><td>8881513934</td><td></td></tr><tr><td>27-G 针头</td><td>BD</td><td>305109</td><td></td></tr><tr><td>20-G 针头</td><td>BD</td><td>305176</td><td></td></tr><tr><td>谱系抗体混合物（Lineage Cocktail）</td><td>Miltenyi</td><td>130-090-858</td><td>LOT# 5170418221</td></tr><tr><td>抗生物素抗体（Anti-Biotin antibodies）</td><td>Miltenyi</td><td>130-113-288</td><td>LOT# 5171109046</td></tr><tr><td>1 mL 注射器</td><td>Excelint</td><td>26027</td><td>胰岛素注射器</td></tr><tr><td>加热灯</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>E70001901</td><td></td></tr><tr><td>FACS 仪器</td><td>Cytec</td><td>FACScan</td><td>2 个激光器，5 色检测器</td></tr><tr><td>FACS 分选仪</td><td>Beckman Coulter</td><td>MOFLO ASTRIOS</td><td>5 个激光器，23 个参数，可同时分选 6 个细胞群</td></tr><tr><td>碘化丙啶（Propidium Iodide）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P3566</td><td></td></tr><tr><td>γ 射线照射仪</td><td>Best Theratronics</td><td>Gammacell 40</td><td></td></tr><tr><td>血液采集管</td><td>RAM scientific</td><td>76011</td><td></td></tr><tr><td>受体小鼠</td><td>Charles River</td><td>B6-LY5.1/Cr, CD45.1</td><td></td></tr><tr><td>NUP98-HOXD13 小鼠</td><td>n/a</td><td>C57Bl/6, CD45.2</td><td>种群维持于美国国立卫生研究院（NIH）</td></tr><tr><td>5 mL 圆底管</td><td>Falcon</td><td>352058</td><td></td></tr></tbody></table>

利用造血干细胞移植评估骨髓增生异常综合征的起源

Use of Hematopoietic Stem Cell Transplantation to Assess the Origin of Myelodysplastic Syndrome

骨髓增生异常综合征（MDS）是一组异质性的造血干细胞疾病，其特征为无效造血、外周血细胞减少、细胞发育异常以及向急性白血病转化的倾向。携带 NUP98-HOXD13（NHD13）转基因的小鼠在表现出外周血细胞减少、发育异常以及向急性白血病转化等方面，能够很好地模拟人类 MDS。我们先前已证明，通过移植 MDS 小鼠的骨髓有核细胞（BMNC），可将 MDS 从基因工程小鼠传递给野生型受体小鼠。为了更清晰地理解 MDS 的起源细胞，我们已建立了移植特定免疫表型定义的造血细胞亚群的方法。本文中，我们描述了分离和移植特定造血干细胞及祖细胞群体的操作流程。在移植后，我们还介绍了评估移植效率以及供体 MDS 细胞持续存在的相关方法。

我们展示了多个实验结果的代表性图像。 图1 显示了一次具有代表性的流式细胞术分选实验。在正常的造血分化过程中，当细胞定向分化为特定的造血谱系时，会获得该谱系特异性的细胞表面标志物，并失去自我更新潜能。因此，在野生型小鼠中，干细胞的自我更新能力仅限于谱系阴性骨髓单个核细胞（BMNC）。在本实验中，我们将NHD13小鼠骨髓中的BMNC分选为谱系阴性、谱系低表达阳性以及谱系高表达阳性细胞，随后将这些分选后的细胞移植至野生型（WT）受体小鼠体内，以评估其自我更新能力。
图2展示了另一项实验的结果，该实验将来自患有MDS的NHD13供体的谱系阴性细胞或未分选细胞移植到致死剂量照射的野生型（WT）受体小鼠中。NHD13供体细胞表达CD45.2细胞表面标志物，而野生型竞争细胞（见上文2.2.1节）则表达CD45.1细胞表面标志物。<strong c...

我们描述了利用造血干细胞移植（HSCT）评估基因工程改造的造血细胞的恶性潜能。HSCT可用于评估多种恶性造血细胞 体内 以及生成大量患有骨髓增生异常综合征（MDS）或白血病的小鼠模型，用于评估新型疗法。

骨髓增生异常综合征（MDS）是一组异质性的造血干细胞疾病，其特征为无效造血、外周血细胞减少……

该方法有助于解答恶性肿瘤研究领域中关于启动恶性肿瘤的细胞特征的一些问题。该技术的主要优势在于，它为这些肿瘤干细胞的功能分析提供了基础。该技术的意义延伸至骨髓增生异常综合征（MDS）的治疗领域，因为它有助于识别引发疾病的细胞。为了准备受体动物进行过继性移植，在移植前一周，于特定病原体阴性动物设施中，为同源受体动物提供添加了100毫克/升环丙沙星的无菌水，持续七天。在第七天，由经过培训并获得认证的铯-137操作员将铯源仪器设定为每分钟提供70厘戈瑞的全身γ射线照射。将10只小鼠放入定制设计的固定装置中。将支架插入辐照室，进行总计9戈瑞、持续13分钟的全身辐照，然后将动物放回笼中。次日早晨，用70%乙醇喷洒一只2至6月龄的C57黑六小鼠全身，并用剪刀从骨盆至脚踝处去除皮肤。使用镊子配合剪刀取下股骨和胫骨。将肌肉从骨骼上彻底修剪干净。剪去胫骨的近端和远端，并用镊子夹取一根胫骨。将装有27号针头的3毫升注射器插入骨髓腔，用2.5毫升含2%胎牛血清的Hanks平衡盐溶液（HF2）冲洗骨髓，收集至14毫升圆底管中。当所有骨髓组织收集完毕后，通过20号针头反复抽吸组织数次，使骨髓团块分散成单细胞悬液以便计数。为了对骨髓有核细胞（BMNC）进行流式分选标记，先通过离心收集细胞，然后将细胞沉淀重悬于90微升HF2溶液中，调整浓度至每90微升含1×10⁷个BMNC。接下来，向细胞悬液中加入10 µL生物素标记的谱系抗体混合物，在4°C下孵育20分钟。随后在3 mL PBS中离心洗涤一次。每1×10⁷个细胞用100 µL HF2重悬沉淀。用两微升 APC 标记的抗生物素抗体对细胞进行二次标记。在避光条件下于四摄氏度孵育 20 分钟后，用三毫升新鲜 PBS 洗涤细胞。将细胞沉淀重悬于冰上预冷的 HF2 培养基中，该培养基需补充 0.2 微克/毫升的碘化丙啶。现在使用未染色细胞校准流式细胞分选仪，以优化各检测器在线性范围内的所有光电倍增管、散射光及荧光参数。分别采集10,000个细胞的三个样本，包括未标记细胞、PI标记细胞以及抗谱系APC标记细胞。分选结束后，从每个样本中分析1,000个细胞，以确认分选细胞的纯度和活力。将样品在离心机中离心沉淀。然后用 0.5 毫升 HF2 重悬沉淀物，用于计数。对于分选细胞的过继转移，取来自同品系受体动物的 100 微升浓度为 2×10⁵ 的野生型 BMNC，加入无菌 HF2 中混匀。每只受体动物使用一个微量离心管，其中含有100 µL无菌HF2培养基，内含2至5 × 10⁴个经分选的目标供体骨髓单个核细胞（BMNC）。为每只受体动物准备一支1 mL注射器，并装配28号针头，加载200 µL细胞悬液。随后，将受体小鼠置于加热灯下，以诱导尾静脉扩张。通过尾静脉将细胞混合物注入每只经致死剂量照射的受体动物体内。由于干细胞的自我更新能力仅限于谱系阴性的野生型骨髓单个核细胞（BMNC），因此将谱系阴性、低谱系阳性及高谱系阳性的细胞分选后分别移植到野生型受体中，以确定各细胞群体的自我更新能力。来自MDS模型动物的供体转基因骨髓单个核细胞（BMNC）可通过其CD45.2细胞表面标志物的表达，在体外被明确区分。在将谱系阴性的BNMC或来自转基因MDS供体动物的未分选BMNC移植后16周，转基因细胞逐渐取代野生型细胞，这体现在经致死剂量照射的受体动物外周血中，CD45.2阳性供体细胞的比例逐渐升高。此处显示的是来自一只移植了转基因MDS细胞后发生白血病转化的小鼠的细胞。请注意其中存在大量原始细胞及未成熟细胞形态。在进行该操作时，重要的是要尽量缩短细胞离体操作的时间，因为过长的操作时间可能对细胞造成过度应激，导致细胞死亡或功能丧失。该技术建立后，将为相关领域的研究人员提供一条新途径，可通过遗传工程小鼠模型引入恶性病变，以探究疾病的发生源头。

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Research

科研

JoVE Journal

Developmental Biology

发育生物学

应用造血干细胞移植评估骨髓增生异常综合征的起源

本方案详细描述了从小鼠胚胎干细胞（ESC）中获得可移植的造血干细胞，并将其注射到致死剂量辐照的受体小鼠中的过程。简言之，ESC 被诱导形成拟胚体并进行分化，随后用逆转录病毒 HoxB4 感染，并与 OP9...

从小鼠胚胎干细胞中衍生造血干细胞

本文介绍了一种通过流式细胞术分析骨髓造血祖细胞分布的方法，以及高效分离高纯度造血干细胞（HSCs）的技术。该分离流程主要基于对c-Kit+细胞的磁珠富集，再通过细胞分选来纯化HSCs，用于细胞和分子水平的研究。...

小鼠造血干细胞及谱系定向祖细胞的表型分析与分离

本方案提供了建立竞争性小鼠骨髓移植实验的逐步指南，用于研究造血干细胞/祖细胞功能，而无需通过细胞分选对干细胞进行预先纯化。...

竞争性移植评估造血干细胞适应性

为了监测血红蛋白病患者在干细胞移植后的植入情况，需要对供体来源的细胞进行定量。可通过结合基于流式细胞术的细胞分选、集落形成实验以及后续的短串联重复序列分析，来评估红系细胞区室中前体细胞的增殖与分化能力。...

血红蛋白病患者造血干细胞移植后残余供体红系祖细胞的检测

检测微小残留病（MRD）是急性髓系白血病（AML）中用于优化风险评估和预测复发的重要预后生物标志物。这些关于MRD一致且准确识别与检测的最佳实践指南和建议，可有助于制定有效的AML治疗决策。...

全面采样与处理骨髓以检测急性髓系白血病中可测量残存病灶及白血病干细胞的实验方案

我们概述了一种通过流式细胞术检测原代急性髓系白血病细胞上白血病干细胞标志物共表达的实验方案。我们展示了如何定量分析三种具有不同程度成熟特征的前体细胞群以及一个假定的白血病干细胞（LSC）群体。我们已在相应的患者来源异种移植模型中证实了这些细胞群的存在。...

通过流式细胞术在初诊及随访时评估原发性急性髓系白血病和患者来源异种移植模型中的白血病干细胞

在缺乏形态学标准或细胞遗传学信息不明确的情况下，骨髓增生异常综合征（MDS）的诊断较为困难。多参数流式细胞术（MFC）可能有助于优化MDS的诊断流程。为了在临床实践中具有应用价值，MFC分析必须基于具备足够特异性和敏感性的参数，且不同操作者之间的数据应具有可重复性。...

基于数据库指导的流式细胞术评估骨髓髓系细胞成熟度

本文介绍了一种简单的小鼠骨髓细胞分离与染色方案，用于表征造血干细胞和祖细胞，以及支持性微环境中的内皮细胞和间充质干细胞。方案中还包括一种富集位于骨内膜区和骨髓中央区域细胞的方法。...

小鼠骨髓造血干细胞与祖细胞及基质微环境细胞的流式细胞术分析

本文提供了一种详细的实验方案，用于从小鼠模型中分离和表征骨髓增生异常综合征及急性髓系白血病的骨髓微环境细胞群体。该技术可识别疾病进展过程中非造血性骨髓微环境（包括内皮细胞和间充质基质细胞）的变化。...

识别骨髓增生异常综合征和急性髓系白血病中的骨髓微环境细胞群

股骨内注射可将少量造血干细胞和祖细胞（HSPCs）直接植入骨髓腔，从而实现细胞的移植。本文介绍了一种将人HSPCs通过股骨内注射移植到免疫缺陷小鼠体内的实验方案。...

向免疫缺陷小鼠股骨内注射人造血干细胞和祖细胞

了解造血干细胞移植技术用于评估骨髓增生异常综合征中恶性造血细胞的潜能。该方法通过体内功能分析识别疾病起始细胞，为癌症干细胞研究提供重要基础，助力开发新型治疗策略。

利用造血干细胞移植评估骨髓增生异常综合征的起源

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